全 文 ：仲恺农业工程学院学报 , 22(3):11 ～ 14, 2009
JournalofZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering
文章编号:1674-5663(2009)03-0011-05
　
收稿日期:2009-06-02
基金项目:广东省科技计划农业攻关(2006B20201045)资助项目.
作者简介:张超洪(1970-), 男 , 广东茂名人 , 工程师.　　＊通讯作者:E-mail:wang999983@126.com
RP-HPLC法测定青果果肉中的黄酮类物质
张超洪1 , 赖志勇 2 , 谢路斯 1 , 戴宏芬3 , 黄炳雄 3 , 肖维强3 , 王晓容 3＊
(1.茂名市质量计量监督检测所 , 广东 茂名 525011;2.普宁市农业科学研究所 ,
广东 普宁 515344;3.广东省农业科学院果树研究所 , 广东 广州 510640)
摘要:应用反相高效液相色谱法 (RP-HPLC)测定了广东产 15个品种青果果肉中黄酮类物质的含量.结果表
明 , 在分离柱为 NucleosilC18反相柱 (5 μm, 250mm×4.6mm), 流动相 A为体积分数 20%的甲醇 , 流动相 B
为体积分数 30%的乙腈 , A和 B流动相用体积分数 50%的磷酸调 pH至 3.2±0.05, 流动相 C为乙腈 , 三元梯度
洗脱 , 流速 1 ～ 1.2 mL/min, 柱温 35℃, 分析波长 285nm～ 350 nm的检测条件下 , 15个品种青果果肉中均含有
柚皮苷和金丝桃苷 , 6个品种含有芦丁 , 并且不同品种之间柚皮苷 、 金丝桃苷和芦丁等 3种黄酮类物质的含量存
在显著差异 (P<0.05);其中芦丁含量以长穗赤品种青果最高 , 达 1 858.17 μg/g干质量;金丝桃苷含量以小鸡
心品种青果最高 , 达 3 238.21 μg/g干质量;柚皮苷以红心榄品种青果最高 , 达 6 440.84 μg/g干质量.
关键词:反相 HPLC;青果;黄酮
中图分类号:O657.7+2;TS201.2　　　　　文献标识码:A
DeterminationofflavanonesinChineseolivefleshbyRP-HPLC
ZHANGChao-hong1 , LAIZhi-yong2 , XIELu-si1 , DAIHong-fen3 ,
HUANGBing-xiong3 , XIAOWei-qiang3 , WANGXiao-rong3
(1.MaomingInstituteofSupervision, InspectionandExaminationofQualityandMetrology,
Maoming525011, China;2.PuningInstituteofAgriculturalSciences, Puning515344, China;
3.InstituteofFruit, GuangdongAcademyofAgriculturalSciences, Guangzhou510640, China)
Abstract:Areverse-phasehigh-performanceliquidchromatography(RP-HPLC)methodwasusedfor
Determinationofflavanonesinfleshof15Chineseolive(Fructuscanari)varieties.Sampleswereinjec-
tedontoreversed-phaseNucleosilC18 column(5μm, 250mm×4.6mmi.d.).MobilephaseAandB
were20% methanoland30% acetonitrile, respectively.BothofthemwereadjustedtopH3.2±0.05
with50%phosphoricacid.AcetonitrilewassetasmobileC.Triplegradientelutionproceededattheflow
rate1 ～ 1.2 mL/min.Operationconditionswereasfolows:columntemperature35 ℃, detectionat
285 ～ 350nmingradient.Naringinandhyperosideweredetectedinalsamples.Rutinwasdetectedonly
in6 samples.RutinwasrichestinChangsuichivarietywith1 858.17μg/gdriedmass(DM).Hypero-
sidewasrichestinXiaojixinzhongvarietywith3 238.21 μg/gDM.NaringinwasrichestinHongxinlan
varietywith6 440.84μg/gDM.Itwasindicatedthatcontentsofthreeflavanonesweresignificantlydif-
ferentat0.05levelinfifteenvarieties.
Keywords:RP-HPLC;Chineseolive;flavanone
　　青果为橄榄科 (Burseraceae)橄榄属 (Canarium)植物橄榄 [ Canariumalbum(Lour.)Raeusch] 的
果实.橄榄为常绿乔木 , 生长于热带 、亚热带地区.其果实青果为药食兼用型水果 [ 1] , 具有清热 、 利咽 、
袪痰 、 生津 、健脾 、 解毒等功效[ 2] .青果一般用于鲜吃 、 加工凉果和制药.用于入药的果品要求药效成
分含量较高 , 而鲜吃的品种则要求风味浓郁 、 微涩带甘 , 具体哪些品种用于那种用途 , 应该有一个化学成
分上的判别.目前 《中国药典》[ 1]对青果的化学成分无含量测定项 , 鉴别也只是组织形态的方法 , 但是不
同品种青果中的某些化学成分含量差别很大 [ 3] .在有条件的情况下 , 应对青果不同品种中多种功效成分
作一个全面的分析测定 , 以便对药用 、鲜食或加工成小食品等选择青果品种提供理论依据.青果中以没食
子酸为主的多酚物质是其重要的药效成分 , 不同品种青果果肉中的没食子酸含量存在明显的差异 [ 3] .另
据报道 , 青果果肉中所含的黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂 , 对人体具有抗肿瘤 、延缓衰老 、增强心血
管功能 、增强免疫力等生理保健功效 [ 4] .青果中黄酮类物质的测定方法各异 , 李张伟等 [ 4]采用超声波提
取青果中的黄酮成分 , 并以芦丁为标准 , 用分光光度计测定青果果肉中黄酮类物质的含量.也有学者[ 5]
采用气质联用仪定量和定性测定了青果汁透析液中黄酮类物质等功效成分的含量.应用高效液相色谱法测
定多种水果中黄酮类物质的种类和含量 , 是目前国际上常用的检测方法之一[ 6-9] , 具有仪器操作简便 、 结
果准确 、精密度高 、 对样品前处理要求不十分严格等优点 , 被国内外研究者所接受 , 但采用高效液相法测
定青果中的黄酮类物质则罕见报道.作者拟采用反相高效液相色谱法 (RP-HPLC), 分析测定广东产 15
种青果果肉中黄酮类物质的含量 , 以期能够进一步了解不同青果品种中黄酮类物质的组成 , 为青果的综合
开发利用和提高农产品附加值提供理论依据.
1　材料与方法
1.1　标准品
橙皮苷 (Hesperidin)、 柚皮苷 (Naringin)和芦丁 (Rutin)等 3种黄酮类物质的标准品为中国药品生
物制品检定所产品 , 批号分别为 110721-200512、 110722-200309和 100080-200306;柚皮素 (Naringenin)
为美国 Sigma公司产品 , 批号为 067K1084;川皮苷 (Nobiletin)、 甜橙黄酮 (Sinensetin)为陕西慧科植物
开发有限公司产品 , 批号均为 080402;金丝桃苷 (Hyperoside)为上海友思生物技术有限公司产品 , 批号
为 071010.
1.2　仪器
Agilent1100型高效液相色谱仪 , 带 Agilent化学工作站和 VWD检测器 、手动进样器 、 20 μL定量管 ,
美国 Agilent公司生产.
1.3　试剂
色谱级甲醇 、乙腈 , 美国 Fisher公司产品;实验用水为超纯水;其余试剂均为国产分析纯.
1.4　色谱条件
色谱柱为 NucleosilC18反相柱 (250 mm×4.6mm), 流动相 A为体积分数 20%的甲醇 , 流动相 B为
体积分数 30%的乙腈 , 以上 A和 B流动相用体积分数 50%的磷酸调 pH至 3.2±0.05, 流动相 C为乙腈 ,
三元梯度洗脱 , 流速 1 mL/min, 梯度洗脱顺序是:60%B+0%C/14 min、 60%B+40%C/1 min(流速
1.2mL/min)、 60%B+40%C/9.5 min(流速 1.2 mL/min)、 100%C/1.5 min、 100%C/4 min、 60%B+
0%C/5min;柱温 35 ℃.分析波长梯度为 285 nm/0 ～ 20min、 350nm/20 ～ 30 min、 285 nm/30 ～ 35min.
1.5　标准品标准曲线的制作
标准品的标准曲线参照文献 [ 10]进行.将芦丁 、金丝桃苷 、 柚皮苷 、橙皮苷配制成最高含量为 25
μg/mL、 柚皮素为 6.3μg/mL、川皮苷 、 甜橙黄酮为 12.5 μg/mL的混合标准液 , 标准品用纯甲醇溶解 ,
并以体积分数 50%的甲醇水溶液稀释定容 , 将标准溶液按 2倍倍比稀释 , 分别稀释 2、 4、 8、 16、 32和
64倍 , 按上述色谱条件进样分析 , 根据标准品的浓度和峰面积 , 经 Excel计算 , 得线性回归方程和相关系
数 (R2).
1.6　精密度 、准确度试验
参照文献 [ 10]进行.
12 仲恺农业工程学院学报 第 22卷
1.7　样品处理
15个品种的青果 (赤钟仔 、 冬节圆 、 长穗赤 、 香种 、土纳甜种 、 八枝香 、咁种 、 正纳种 、 红心榄 、
东孙种 、流黄种 、一枝香 、豆仁种 、 白鸡心和小鸡心种)分别采自广东汕头 、 普宁等地.取 10粒以上各
品种的鲜果 , 将果肉磨碎 , 于 65 ℃下烘干或晒干 , 打成粉 , 60%以上过 60筛目 , 其余颗粒直径在 1 mm
左右为宜.65℃烘至质量恒定 , 分别称取 400 mg于 25mL容量瓶中 , 加入 10 mL纯甲醇 , 15 μL体积分
数 50%的磷酸 , 过夜 , 超声波提取 15 min, 用纯甲醇定容 , 取上清液经 0.5 μm的微孔膜过滤后进样分
析.以上各样品均重复 3次以上.
1.8　数据处理
试验结果先由 Agilent化学工作站积分处理 , 根据峰面积计算各样品中黄酮类物质的含量 , 然后用
SAS软件进行差异显著性分析.
2　结果
2.1　混合标准品的分析
　　　　按保留时间依次为:芦丁 、 金丝桃苷 、 柚皮苷 、 橙皮苷 、 柚
皮素 、 川皮苷和甜橙黄酮.其芦丁 、 金丝桃苷 、 柚皮苷和橙皮苷
的含量为 25μg/mL, 柚皮素为 6.3μg/mL、 川皮苷 、 甜橙黄酮为
12.5μg/mL.(Mapinaccordancewiththeretentiontime:rutin, hy-
peroside, naringin, hesperidin, naringenin, nobiletinandsinensetin.
Theconcentrationofrutin, hyperoside, naringin, hesperidinwere25
μg/mL, naringeninwas6.3 μg/mL, nobiletinandsinensetinwere
12.5μg/mL, respectively)
　　 图 1　混合标准品色谱图
　　　Fig1　HPLCdiagramofmixtureofrutin, hyperoside,
naringin, hesperidin, naringenin, nobiletinandsinensetin
　　按所选定的色谱条件 , 混合标准品中的 7种标准
品均得到良好的分离 (图 1).
2.2　7种标准品的线性关系
根据仪器分析结果 , 7种标准品的峰面积 (Y)
对浓度 (X)作图 , 得到相应的回归方程及相关系数
(表 1).7种标准品在所选定的检测条件下和浓度范
围内 , 线性关系良好.
2.3　15种青果果肉中的黄酮类物质含量
按照上述分析方法 , 得到正纳种青果果肉中黄酮类
物质的色谱图 (图 2)和 15个青果样品中黄酮类物质含
量的分析结果 (表 2).从表 2可以看出 , 所有样品中均
含有柚皮苷和金丝桃苷 , 6个品种中含有芦丁.3种黄
酮类物质含量在不同品种之间存在显著差异
(P<0.05), 芦丁含量以长穗赤品种青果最高 , 达
1 858.17μg/g干质量;金丝桃苷含量以小鸡心品种最
高 , 达3 238.21μg/g干质量;柚皮苷以红心榄品种最
高 , 达 6 440.84μg/g干质量 , 红心榄品种测出含有金
丝桃苷和柚皮苷 , 二者总黄酮含量为质量分数 0.888%.
表 1　7种混合标准品回归方程及相关系数
Table1　Regressionequationandcorrelationcoeficientof
sevenstandardflavanonesinmixture
标准品名称
Standards
回归方程
Regressionequation
相关系数(R2)
Correlation
coefficient
芦丁 Rutin y=13.154x-0.110 9 1.000 0
金丝桃苷 Hyperosidey=21.887x-20.863 0.994 1
柚皮苷 Naringin y=30.342x+19.555 0.999 3
橙皮苷 Hesperidin y=38.875x-1.121 8 1.000 0
柚皮素 Naringenin y=50.216x+1.360 9 0.999 9
川皮苷 Nobiletin y=43.682x+3.813 2 1.000 0
甜橙黄酮 Sinensetin y=36.321x-1.005 2 1.000 0
图 2　青果样品 (正纳种)的 RP-HPLC图
Fig2　HPLCdiagramofflavanonesinfleshof
Zhengnazhongveriety
13　第 3期 张超洪 , 等:RP-HPLC法测定青果果肉中的黄酮类物质
表 2　15种青果果肉中黄酮类物质的含量和相对标准偏差
Table2　Averagecontentandrelativestandarddeviation(RSD)offlavanonesinfleshof15 Chineseolivevarieties
品种
Variety
芦丁 Rutin 金丝桃苷 Hyperoside 柚皮苷 Naringin
含量
Contents/(μg/gDM)
相对标准偏差
RSD/%
含量
Contents/(μg/gDM)
相对标准偏差
RSD/%
含量
Contents/(μg/gDM)
相对标准偏差
RSD/%
赤钟仔 Chizhongzi 984.23 d 0.742 1 461.19 i 0.887 3 417.11 g 0.582
冬节圆 Dongjieyuan 899.65e 4.614 1 563.70 h 1.581 2 000.83 m 0.591
长穗赤 Changsuichi 1 858.17 a 0.238 2 342.80 e 0.942 3441.49 g 0.275
香种 Xiangzhong 1 038.55c 1.023 1 451.10 i 0.585 3 265.23 h 0.282
土纳甜种 Tunatianzhong 1 218.15b 3.126 1 884.10 f 1.814 4 634.07 b 0.435
八枝香 Bazhixiang 未检出 Nofind 1 700.87 g 0.809 2 567.35 k 0.435
咁种 Ganzhong 未检出 Nofind 1 572.37 h 2.082 3 082.93 i 0.804
正纳种 Zhengnazhong 854.99 f 2.035 1 353.15 j 2.516 2 470.68 l 0.882
红心榄 Hongxinlan 未检出 Nofind 2 435.70 d 1.556 6 440.84 a 0.261
东孙种 Dongsunzhong 未检出 Nofind 1 896.57 f 2.183 2 982.55 j 0.528
流黄种 Liuhuangzhong 未检出 Nofind 2 496.72 c 0.891 3 946.56 e 0.424
一枝香 Yizhixiang 未检出 Nofind 2 589.62 b 0.495 3 838.21 f 0.287
豆仁种 Dourenzhong 未检出 Nofind 2 451.98 cd 0.837 3 108.00 i 1.057
白鸡心 Baijixin 未检出 Nofind 2 568.96 b 2.014 4 094.60 d 1.033
小鸡心种 Xiaojixinzhong未检出 Nofind 3 238.21 a 2.255 4 351.73 c 1.086
　＊同一列中不同字母者表示在 0.05水平上差异显著.Diferentletersinthesamecolumnindicatedthesignificantdiferenceat0.05level.
3　讨论
以往对青果中功效成分的研究主要集中在挥发性芳香成分 、 三萜类化合物 、多酚类 、蛋白质和氨基
酸 、脂肪和脂肪酸 、 矿物质和微量元素等 , 目前报道较多是青果中多酚类的没食子酸含量测定 , 对黄酮类
物质的测定较少.而在青果药理作用研究方面 , 彭勃等[ 11]研究证明青果具有良好的防醉 、 解酒 、 护肝作
用 , 并认为青果的保肝作用可能归功于青果中的萜类及鞣质等酚类成分.袁剑刚等 [ 12]研究了青果对几种
常见细菌 、 霉菌和酵母菌的抑制效应 , 并初步认为黄酮类物质及没食子酸可能是抑菌防腐的主要作用成
分.李张伟等[ 4]以芦丁为标准 , 用分光光度计测定青果果肉中黄酮类物质含量为 3.84%;李铃望 [ 5]用气
质联用仪对青果果汁透析液中的解酒护肝功效成分进行定量定性分析 , 结果表明主要的黄酮类成分为黄烷
酮 、异黄烷酮 、 异哇酮 、 苯基丁氮酮等 , 总含量为 4.01%.本试验应用 RP-HPLC法 , 选定 7种黄酮类标
准品 , 对广东产 15种青果果肉中的黄酮类物质的种类和含量进行了测定 , 结果显示 , 青果果肉中含有芦
丁 、金丝桃苷和柚皮苷 3种黄酮物质 , 未检出其它黄酮类成分.其中只有 6个品种含有芦丁 , 其余品种仅
含金丝桃苷和柚皮苷 2种类黄酮类物质.15种青果果肉中的总黄酮类物质含量以红心榄品种最高 , 为果
肉干物质的 0.888%, 其中芦丁为 0、 柚皮苷为 0.644%、 金丝桃苷为 0.244%.本试验总黄酮含量明显低
于李张伟等 [ 4]和李铃望 [ 5]的试验结果 , 这可能与不同的提取和测定方法 、不同的青果品种及采收时间有
关.本研究方法可准确地了解青果样品中所含黄酮类物质的种类和含量 , 其操作简便 , 分离效果好 , 分离
速度快 , 相对于分光光度法和气质联用仪 , 本法能准确快速定性 、定量地检测出青果中黄酮类物质的种类
和含量.
参考文献:
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(下转第 16页)
14 仲恺农业工程学院学报 第 22卷
图 1　南岭莪术
Fig1　C.kwangsiensisvar.
nanlingensisN.LiuetX.Y.Ma
　　广东 (Guangdong):乳源 (Ruyuan), 海拔 300m, 2006-06-05, 巫远
坤 (WuYuan-kun)001 (模式! Holotypus! 存华南植物园标本馆 IBSC);
刘念 、 叶向斌 (LiuNianetYeXiang-bin)20070612001 (存 IBSC).
栽培:刘念 、马晓燕 (LiuNianetMaXiao-yan)2008061001 (存 IB-
SC).
本变种与广西莪术 (原变种)的区别在于植株较矮小 , 株高仅 0.4 ～
0.6m, 主根茎直径仅 2 ～ 3cm、 长约 3 ～ 4 cm, 孕苞片白绿色 (图 1).
　致谢:承蒙东莞市岭南园林建设有限公司巫远坤工程师的大力帮助 ,
谨致谢意.
参考文献:
[ 1] 　李树刚 , 梁畴芬.广西莪术———姜黄属—新种 [ J] .植物分类学报 , 1977, 15
(2):110.
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【责任编辑　徐　妍】
(上接第 14页)
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【责任编辑　冯元璋】
16 仲恺农业工程学院学报 第 22卷