全 文 ：仲恺农业技术学院学报 , 21 (2):09 ～ 13, 2008
JournalofZhongkaiUniversityofAgricultureandTechnology
文章编号:1006-0774 (2008)02-0009-05
收稿日期:2008-02-23
基金项目:广东省科技计划农业攻关 (2006B20201045)资助项目.
作者简介:肖维强 (1968-), 男 , 广东汕头人 , 高级农艺师. ＊通讯作者:E-mail:xrwang@ 263.net.
反相 HPLC法测定余甘子果实中的游离氨基酸
肖维强1 , 赖志勇 2 , 戴宏芬 1 , 黄炳雄1 , 王晓容 1
(1.广东省农业科学院 果树研究所 , 广东 广州 510640;2.普宁市农业科学研究所 , 广东 普宁 515344)
摘要:应用反相 HPLC法测定了余甘子果实中的游离氨基酸.色谱柱为爱尔兰产 150 mm×4.6 mm, 5 μRP18
柱.流动相 A为 0.04mol/LKH2PO4 (pH7.2±0.05)、 B为水 、 C为乙腈 , 流速 0.65mL/min, 梯度洗脱 , 检测
波长 360 nm, 柱温 40 ℃.结果显示 , 16种氨基酸标准品的线性范围为 0.015 6～ 0.250 0μmol/mL, 相关系数 R2
=0.994 9 ～ 0.999 9.标准品在 0 ～ 48 h内经多次测定 , 保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.03% ～
1.75%和 0.54% ～ 3.67%之间;回收率和回收率相对标准偏差分别在 85.95% ～ 102.18%和 1.10% ～ 6.54%之
间.4种余甘子果实中检出有 9种游离氨基酸 , 分别是天门冬氨酸 、 谷氨酸 、 丝氨酸 、 精氨酸 、 甘氨酸 、 苏氨
酸 、 脯氨酸 、 丙氨酸和苯丙氨酸 , 含量为 0.004 2 ～ 0.566 6 mg/g干质量.
关键词:余甘子;反相 HPLC;淤离氨基酸
中图分类号:O657.7+1;R914.1 文献标识码:A
Determinationoffreeaminoacidsintheemblicafruitbyreversed-phaseHPLC
XIAOWei-qiang1 , LAIZhi-yong2 , DAIHong-fen1 , HUANGBing-xiong1 , WANGXiao-rong1
(1.InstituteofPomology, GuangdongAcademyofAgriculturalSciences, Guangzhou510640, China;
2.PuningInstituteofAgriculturalSciences, Puning515344, China)
Abstract:Freeaminoacidsintheemblicafruitweredeterminedbyareversed-phasehighperformance
liquidchromatography(RP-HPLC)method.Sampleswereinjectedinto5μRP18 column(150 mm×
4.6mm)madeinIreland.MobilephaseAwas0.04mol/LKH2PO4 withpH7.2±0.05 , Bwaswater
andCwasacetonitrile.Gradientelutionwasproceededattheflowrateof0.65mL/min.Operationcon-
ditionsweresetasfolows:wavelengthof360 nm, columntemperatureof40 ℃.Theresultsshowed
thatlinearcalibrationofsixteenstandardaminoacidsampleswerewithin0.015 6-0.250 0μmol/mLwith
corelationcoeficient(R2)of0.994 9 -0.999 9.Relativestandarddeviation(RSD)ofretainedtime
andpeakareawererespectivelywithin0.03% -1.75% and0.54%-3.67% afterrepeatedanalyzedof
standardsampleswerewithin48h.Recoveryratiowaswithin85.95%-102.18% withRSDof1.10%-
6.54%.NinefreeaminoacidsincludingAsp, Glu, Ser, Arg, Gly, Thr, Pro, AlaandPheinemblica
fruitweredetermined, andtheircontentswerebetween0.004 2to0.566 6mg/gdriedmas.
Keywords:emblicafruit;PR-HPLC;freeaminoacid
余甘子为大戟科叶下株属 (Phylanthus)植物余甘子 (PhylanthusemblicaL.)的干燥成熟果实 , 又
名 “油甘”、 “望果 ”、 “余甘果” 等[ 1] , 该植物在我国栽培利用已有 1 800年的历史 , 现广泛分布于云南 、
贵州 、 四川 、福建 、 广东 、广西等南方省区.余甘子的果实风味独特 , 食后先酸涩 , 后甘甜爽口 , 并且营
养丰富 , 含有 12种维生素 、 16种微量元素 、 多种氨基酸 、 有机酸 、 蛋白质 、 糖类等[ 2] .其中维生素 C含
量甚高 , 是苹果的 160倍 , 矿质元素和氨基酸含量也高于苹果[ 3] ;并且还具有抗诱变 、抗致畸 、 防肿瘤 、
降脂减肥等作用 [ 1] .正因为余甘子的果实 、根 、 叶 、 树皮等都具有特殊药理作用 , 被世界卫生组织指定
为在全世界推广种植的 3种保健植物之一[ 2] .为了解不同品种余甘子果实中保健成分含量的差异 , 作者
应用反相高效液相色谱法 , 对产自广东普宁的 4种余甘子果实中的游离氨基酸的含量进行测定 , 希望能够
供相关研究和应用参考.
1 材料和方法
1.1 标准品
氨基酸混合标准品为美国 Agilent公司产品 , 共 17种 , 分别为天门冬氨酸 (ASP)、 谷氨酸 (GLU)、
丝氨酸 (SER)、组氨酸 (HIS)、 精氨酸 (ARG)、 甘氨酸 (GLY)、 苏氨酸 (THR)、 脯氨酸 (PRO)、
丙氨酸 (ALA)、缬氨酸 (VAL)、蛋氨酸 (MET)、 胱氨酸 (CYS-S)、 异亮氨酸 (ILE)、亮氨酸 (LEU)、
苯丙氨酸 (PHE)、赖氨酸 (LYS)和酪氨酸 (TYR).为便于计算 , 标准品含量均以 100%来计.
1.2 仪器与试剂
Agilent1100型高效液相色谱仪 , 带 Agilent化学工作站和 VWD检测器 , 手动进样器 , 20 μL定量管 ,
美国 Agilent公司生产.
色谱级乙腈 , 美国 Fisher公司产品;2 , 4-二硝基氟苯 , 购自广州铱能色谱材料贸易公司;实验用水
为超纯水;其余试剂均为国产分析纯.
1.3 色谱条件
采用 2, 4-二硝基氟苯 (DNFB)柱前衍生法[ 4]并加以改进分离氨基酸.色谱柱:爱尔兰产 150mm×
4.6mm, 5μRP18柱.流动相:A为 0.04mol/L的 KH2PO4 (pH7.2±0.05), B为水 , C为乙腈.检测
波长 360 nm.柱温 40℃.梯度洗脱按文献 [ 4]的方法进行.
1.4 氨基酸的柱前衍生及标准曲线的制作
取混合氨基酸标准品 30 μl, 加入 0.5 mol/LNaHCO3 30 μL, 加入 0.1%DNFB溶液 50 μL, 混匀后避
光 60℃ 60 min, 冷却后加入 2 mLpH7.0、 0.01 mol/L的 KH2PO4 , 混匀后进样分析.
取混合氨基酸标准品 0.250 0、 0.125 0、 0.062 5、 0.031 2和 0.015 6 μmol/mL, 按上述衍生方法处
理 , 并进样检测 .根据标准品的浓度和峰面积 , 经 Excel计算 , 得线性回归方程和相关系数 (R2).
1.5 精密度及样品稳定性试验
选择混合标准品的 1个浓度 , 衍生后连续 5次进样 , 并在 0 ～ 48 h内多次进样 , 选 0、 1、 2、 4、 8、
12、 24、 36、 48h共 9个时间点的检测结果 , 计算各氨基酸峰面积和保留时间的相对标准偏差 (RSD).
1.6 样品处理
分别选取产自广东省普宁的柿饼 、双鹅 、 甜种和土种等 4个品种的余甘子果实烘干粉碎 , 称取 2 g于
25 mL容量瓶中 , 加入 0.1 mol/L的 HCl浸泡过夜 , 超声波提取 20 min, 定容后以 12 000 r/min离心
20 min, 取上清液经 0.5μm微孔膜过滤.按上述方法进行柱前衍生并检测 , 根据峰面积计算各样品中多
种氨基酸的含量.以上各样品均重复 3次以上.
1.7 准确度试验
按文献 [ 5]介绍的方法 , 并以双鹅品种余甘子果实为样品进行回收试验 , 计算回收率和回收率的相对
标准偏差.
2 结果与分析
2.1 氨基酸混合标准品的分析结果
按所选定的色谱条件 , 16种标准氨基酸能得到良好的分离 (图 1).混合标准品为 17种 , 经单个氨
基酸标准品比对检测 , 组氨酸 (HIS)未检出 , 这可能与所选择的衍生剂和流动相有关 [ 4-5] .
2.2 16种标准氨基酸的线性关系
根据仪器分析结果 , 将 16种标准氨基酸的峰面积 (Y)对浓度 (X)作图 , 得到相应的回归方程及
相关系数 (表 1).16种氨基酸在所选定的检测条件下和浓度范围内 , 线性关系良好.
10 仲恺农业技术学院学报 第 21卷
图 1 混合标准品的反相 HPLC图 (按保留时间依次为:天门冬氨酸 、 谷氨酸 、 丝氨酸 、 精氨酸 、 甘氨酸 、 苏氨酸 、
脯氨酸 、 丙氨酸 、 缬氨酸 、 蛋氨酸 、 胱氨酸 、 异亮氨酸 、 亮氨酸 、 苯丙氨酸 、 赖氨酸和酪氨酸.
Fig1 RP-HPLCdiagramofmixtureofASP, GLU, SER, ARG, GLY, THR, PRO, ALA, VAL,
MET, CYS-S, ILE, LEU, PHE, LYSandTYR
表 1 16种标准氨基酸的回归方程及相关系数
Table1 Regressioncurveequationandcorrelationcoefficientof16 standardaminoacids
编号
No
氨基酸
Aminoacids
回归方程
Regressionequation
相关系数
Correlationcoeficient/R2
1 天门冬氨酸 ASP y=407.11x+4.620 8 0.996 5
2 谷氨酸 GLU y=414.47x+4.408 3 0.996 7
3 丝氨酸 SER y=489.04x+4.604 2 0.996 4
4 精氨酸 ARG y=1 030.50x+2.204 2 0.999 9
5 甘氨酸 GLY y=601.06x+9.712 5 0.998 6
6 苏氨酸 THR y=761.29x+1.125 0 0.999 2
7 脯氨酸 PRO y=509.21x+2.050 0 0.998 4
8 丙氨酸 ALA y=607.06x+4.470 8 0.997 2
9 缬氨酸 VAL y=455.90x+2.875 0 0.998 0
10 蛋氨酸 MET y=406.25x+4.604 2 0.997 2
11 胱氨酸 CYS-S y=657.39x+8.075 0 0.994 9
12 异亮氨酸 ILE y=393.23x+2.745 8 0.996 8
13 亮氨酸 LEU y=428.12x+3.745 8 0.996 3
14 苯丙氨酸 PHE y=488.15x+3.950 0 0.997 5
15 赖氨酸 LYS y=792.86x+11.492 0 0.997 1
16 酪氨酸 TYR y=545.82x+8.083 3 0.997 6
2.3 精密度及标准品稳定性试验
取氨基酸混合标准品 0.25μmol/mL连续 5次进样 , 并在 48 h内不同时间点多次进样 , 对其保留时间
和峰面积进行统计分析 , 并计算其相对标准偏差.结果显示 , 混合氨基酸标准品连续 5次进样 , 以及在
48 h内多次进样的保留时间和峰面积相对标准偏差均在 3.67%以内 (表 2), 说明检测仪器稳定且精密度
高 , 混合标准品在 48 h内稳定.
2.4 4种余甘子果实中氨基酸的含量
按上述处理方法和分析 , 4个品种余甘子果实样品中所含氨基酸的种类及其含量列于表 3.
11 第 2期 肖维强 , 等:反相 HPLC法测定余甘子果实中的游离氨基酸
表 2 16种氨基酸不同进样时间保留时间和峰面积的相对标准偏差
Table2 RSDsofretainedtime(RT)andpeakareaof16 aminoacidsinjectedatdifferenttime(%)
氨基酸
Aminoacids
连续 5次进样 5timesinconsecution 0 ～ 48 h9次进样 9 timesin0-48h
保留时间 RT 峰面积 Peakarea 保留时间 RT 峰面积 Peakarea
天门冬氨酸 ASP 0.009 2 0.004 7 0.015 4 0.011 0
谷氨酸 GLU 0.005 8 0.004 9 0.009 7 0.009 2
丝氨酸 SER 0.003 0 0.004 7 0.003 4 0.007 8
精氨酸 ARG 0.002 5 0.009 7 0.002 9 0.023 1
甘氨酸 GLY 0.023 9 0.006 2 0.017 5 0.013 2
苏氨酸 THR 0.002 1 0.006 2 0.002 6 0.009 4
脯氨酸 PRO 0.002 0 0.007 3 0.002 6 0.005 4
丙氨酸 ALA 0.002 0 0.005 2 0.002 7 0.007 1
缬氨酸 VAL 0.000 8 0.005 7 0.001 5 0.014 1
蛋氨酸 MET 0.000 7 0.005 9 0.001 4 0.017 6
胱氨酸 CYS-S 0.000 6 0.004 7 0.001 2 0.018 3
异亮氨酸 ILE 0.000 5 0.005 7 0.001 2 0.020 4
亮氨酸 LEU 0.000 5 0.005 7 0.001 1 0.021 4
苯丙氨酸 PHE 0.000 3 0.005 5 0.000 7 0.008 0
赖氨酸 LYS 0.006 7 0.016 0 0.005 0 0.036 7
酪氨酸 TYR 0.000 2 0.022 4 0.000 3 0.029 3
4种余甘子果实中均检出 9种游离氨基酸 ,不同品种样品之间每种氨基酸的含量均存在一定的差异(表
3).根据多重比较结果 ,甜种和土种余甘子所含上述氨基酸多于其它 2个品种.在上述分析条件下 ,除胱氨
酸和赖氨酸完全不能检出外 ,余甘子中还含有极微量的缬氨酸 、蛋氨酸 、异亮氨酸 、亮氨酸和酪氨酸(图 2).
表 3 4种余甘子果实中游离氨基酸的含量和相对标准偏差
Table3 AveragecontentsandRSDsoffreeaminoacidsinfourdifferentkindsofemblicafruit
氨基酸
Aminoacids
柿饼 Shibing 双鹅 Shuange 甜种 Tianzhong 土种 Tuzhong
平均数 Average
/(mg/gDM)
RSD
/%
平均数 Average
/(mg/gDM)
RSD
/%
平均数 Average
/(mg/gDM)
RSD
/%
平均数 Average
/(mg/gDM)
RSD
/%
天门冬氨酸 ASP 0.019 0 c 0.118 5 0.004 2 d 0.047 6 0.067 5 a 0.104 5 0.052 3 b 0.024 4
谷氨酸 GLU 0.073 6 c 0.037 5 0.032 6 d 0.108 9 0.194 8 a 0.020 5 0.092 1 b 0.037 0
丝氨酸 SER 0.047 8 c 0.068 5 0.067 8 c 0.032 0 0.134 8 a 0.038 0 0.127 4 b 0.034 1
精氨酸 ARG 0.029 2 b 0.042 1 0.006 0 d 0.102 4 0.016 3 c 0.064 6 0.034 6 a 0.029 0
甘氨酸 GLY 0.012 6 b 0.033 0 0.011 3 b 0.035 9 0.032 6 a 0.061 3 0.034 4 a 0.130 5
苏氨酸 THR 0.013 7 c 0.036 8 0.012 5 c 0.042 3 0.018 0 a 0.072 4 0.015 8 b 0.058 0
脯氨酸 PRO 0.280 9 d 0.008 8 0.507 6 b 0.039 5 0.370 0 c 0.019 7 0.566 6 a 0.033 7
丙氨酸 ALA 0.057 8 c 0.044 4 0.048 1 d 0.030 1 0.134 9 a 0.038 2 0.081 7 b 0.019 9
苯丙氨酸 PHE 0.057 3 d 0.051 9 0.084 2 c 0.038 7 0.171 5 a 0.030 9 0.154 7 b 0.032 5
＊同一行中不同字母者表示在 P<0.05水平上差异显著.Diferentlettersinthesamelineindicatedthesignificantdifferenceat
0.05 level.
2.5 准确度试验 (标准品回收试验)
在所选择的检测条件下 , 16种氨基酸均能得到很好的回收 (表 4), 分析条件能满足试验要求 , 方法
稳定 , 试验结果可靠.
12 仲恺农业技术学院学报 第 21卷
图 2 土种余甘子的游离氨基酸反相 HPLC图
Fig2 RP-HPLCdiagramoffreeaminoacidsinemblicafruit(Tuzhong)
3 讨论
表 4 氨基酸回收率及回收率的相对标准偏差
Table4 RecoveryratioandRSDof16 aminoacids
编号
No
氨基酸
Aminoacid
回收率
Ratioofrecovery/%
相对标准偏差
RSD/%
1 天门冬氨酸 ASP 0.934 4 0.022 0
2 谷氨酸 GLU 1.021 8 0.011 0
3 丝氨酸 SER 0.951 1 0.032 1
4 精氨酸 ARG 0.941 8 0.047 3
5 甘氨酸 GLY 0.950 1 0.046 1
6 苏氨酸 THR 0.929 4 0.025 5
7 脯氨酸 PRO 1.015 0 0.025 0
8 丙氨酸 ALA 0.953 5 0.032 4
9 缬氨酸 VAL 0.894 1 0.036 3
10 蛋氨酸 MET 0.941 7 0.049 3
11 胱氨酸 CYS-S 0.918 7 0.061 9
12 异亮氨酸 ILE 0.932 3 0.039 4
13 亮氨酸 LEU 0.943 7 0.058 8
14 苯丙氨酸 PHE 0.941 4 0.065 4
15 赖氨酸 LYS 0.899 7 0.040 2
16 酪氨酸 TYR 0.859 5 0.031 7
动植物样品中氨基酸的分析 , 过去通常采用
专门的氨基酸分析仪来完成.由于氨基酸分析仪
对样品的分离范围窄小 , 不利于多种化学成分的
分析 , 因此人们在实践中应用高效液相色谱法来
进行氨基酸的分离和测定 , 同样取得了良好的分
离效果 [ 4, 6] .应用高效液相色谱仪来分离氨基酸 ,
需要对样品进行衍生 , 普遍的是采用柱前衍生法.
常用的柱前衍生法有多种 , 如邻苯二甲醛 (OPA)
法 、二甲氨基萘磺酰氯 (dansyl-Cl)法和 2, 4-
二硝基氟苯法等 [ 7] .本试验采用 2 , 4-二硝基氟
苯柱前衍生法测定氨基酸 , 其操作简便 、衍生物
稳定 、 重复性好 , 16种氨基酸均能得到良好的分
离 , 标准品回收率在 86% ～ 102%之间 , 基本能
够满足余甘子及其它样品中氨基酸种类和含量测
定的要求.不足之处是本试验条件只检出 16种氨
基酸 , 经对单个氨基酸标准品比对试验 , 确定未
检出的是组氨酸 , 组氨酸应在溶剂峰中没能分离
出来.影响分离结果的原因 , 可能与选择的衍生
条件 、 分离柱和流动相有关.刘鸿洲等 [ 4] 用 2 , 4
-二硝基氟苯柱前衍生法测定氨基酸 , 分离出的
标准品只有 15个 , 缺丝氨酸和胱氨酸两种;庞新安等 [ 6]用 AcoQ·Tag柱前衍生反相高效液相色谱法测定
果品中的氨基酸 , 分离出 16种氨基酸 , 缺胱氨酸;景延秋等[ 5]应用邻苯二甲醛衍生法测定烟草中的氨基
酸 , 可分离出 17种氨基酸;王绍萍等[ 8]应用异硫氢酸苯酯衍生法测定玉米浆中的氨基酸 , 也能分离出样
品中的 17种氨基酸.应用高效液相色谱仪分离氨基酸的柱前衍生方法有很多种 , 操作者可能是根据各自
的试验条件来选择衍生方法.欲使用本试验采用的 2 , 4-二硝基氟苯柱前衍生法在液相色谱仪上完全分离
所有 17种氨基酸 , 还有待进一步的试验.
余甘子是药食两用的水果 , 有关其起药理作用的功能成分 , 尤其是它在补益性作用方面的成分 , 目前还
不十分清楚.本试验证明余甘子中含有丰富的氨基酸 , 不同品种之间存在一定的差异.除氨基酸种类和含量
外 , 余甘子中的其它功能成分还有待进一步研究测定.
(下转第 39页)
13 第 2期 肖维强 , 等:反相 HPLC法测定余甘子果实中的游离氨基酸
设置合理.利用 BIOS开发环境的 Profiler功能 , 可以对算法的运算复杂度进行统计 , 统计得到图像融合的
运行时间为 5742602个指令周期 , 所耗费时间为 9.6ms(DSP芯片时钟为 600MHz), 能够实现对两路图
像的实时融合处理 .
4 结论
在基于 TMS320DM642系统平台上 , 本文给出了双光谱融合系统的硬件配置和图像处理的流程 , 在
DSP/BIOS开发环境下 , 给出了视频驱动的设置 、各个任务的优先级别和管理以及存储管理 , 并对系统进
行了实验 , 实现了数字图像融合程序设计 , 实验表明 , 程序结构和进程调度安排合理 , 能够满足对紫外信
号进行检测和定位的要求 , 整个系统实时性好 , 运行稳定可靠 .
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【责任编辑 夏成锋】
(上接第 13页)
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【责任编辑 冯元璋】
39 第 2期 李 伟 , 等:基于 DSP/BIOS的双光谱图像融合系统软件设计