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龙牙楤木组织培养与快速繁殖技术研究



全 文 :龙牙木匆心木组织培养与快速繁殖技术研究
秦亚平 吴大椿 肖锦和 (湖北农学院 ,湖北荆州 434025)
摘要 对龙牙木匆心木[ Aralia elata(Miq)Seen]的叶片、叶柄和幼茎进行组织培养 ,结果表明:用叶片进行组织培养的效果最好 ,愈伤
组织最高诱导率达 37.1%;最适诱导培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+2 ,4-D 1.0mg/L;最适分化培养基为MS+6-BA2.0mg/ L+
2 , 4-D1.0mg/L;最好的继代增殖材料为幼根。试验还发现:用 40μg/L的硫酸链霉素可以有效防止细菌的污染;5 g/L的活性炭
防止褐变效果最好;把握好琼脂的用量及适当降低 6-BA的含量可以降低玻璃化现象的发生频率。
关键词 龙牙木匆心木;组织培养;愈伤组织
中图分类号 S79  文献标识码 A  文章编号 0517-6611(2004)01-0111-04
Study on Tissue Culture and Quickly Reproduction Technology of Aralia mandshurica
Qing Yaping et al (Hubei Agricultural College , Jingzhou ,Hubei 434025)
Abstract Leaf , leafstalk and young caudex culture of Aralia elata(Miq)Seen were experimented.The result showed that , the leaf tissue could
get the best result , inducement rate of reproductive tissue could reach to 37.1%.The best culture medium was MS+6BA 1.0 mg/L+2 , 4-D
1.0 g/L;the best polarization culture medium wasMS+6-BA 2.0 mg/L+2 , 4-D 1.0 mg/L.The experiment indicated that streptomycin sul-
fate of 40μg/ml could prevent germ contamination.Active carbon of 5 g/L could prevent culturing materials from browned and vetrification could
become less frequent if the content of 6-BA was reduced.
Key words Aralia elata(Miq)Seen , Tissue culture, Reproductive tissue
  龙牙木匆心木[ Aralia elata(Miq)Seen] 是五加科木匆心木属多
年生落叶灌木或小乔木 。其嫩芽营养丰富 ,富含蛋白质、
维生素、多种人体必需的氨基酸及钙 、锰、铁 、钛 、镍 、铜、
钴等微量元素[ 1] ,是一种味美可口的保健山野菜 ,被誉为
“山菜之王” 。
龙牙木匆心木能开花结籽 ,进行有性繁殖 ,但是繁殖率很
低;现在生产上主要采用无性繁殖 ,用茎或根段扦插繁
殖。由于龙牙木匆心木不分枝 ,无性繁殖需采集大量的扦插
材料 ,对野生资源破坏严重 。为了满足市场对种苗的需
求和积极保护野生植物资源 ,采用组织培养进行快速繁
殖是保持龙牙木匆心木优良性状 ,加快繁殖速度的有效途径 。
龙牙木匆心木的组织培养 ,首次由日本人贝守(1986)报
道[ 2] ,我国曲芳、金今松 、韩建军 、吕世友等也曾有用芽、
叶柄及茎作为组培材料的相关研究报道[ 1~ 4] 。笔者通过
试验 ,用叶作外殖体成功地获得了龙牙木匆心木的组培幼苗 ,
并且较好地解决了如何选择外殖体 ,防止外殖体褐变、细
菌污染 ,减少玻璃化现象的发生以及细胞培养快繁等一
系列技术问题 。
1 材料和方法
1.1 供试外殖体 采用萌芽后10 d的嫩叶片、叶柄和幼
茎(采自湖北农学院植物园从辽宁省丹东市引进的龙牙
木匆心木植株)。
1.2 供试培养基  以MS 为基础培养基 ,添加不同浓度
注:湖北省科技厅重点资助项目(2001AA213B02)。
作者简介:秦亚平(1958-),男 ,湖北省荆州市人 ,副教授 ,从事作物高
产栽培与生理研究。
收稿日期:2003-09-30
的激素和活性炭(AC)配制而成 。1 000mlMS 培养基中加
蔗糖 30 g ,琼脂 7.5~ 8.0 g , pH 值调至 5.7 。
1.2.1 诱导培养基 。MS+6-BA 1.0 mg/L+2 , 4-D 0.5
mg/L+AC;MS+6-BA1.0mg/L+2 , 4-D1.0mg/L+AC;
MS+6-BA 2.0mg/L+2 , 4-D1.0mg/L+AC;MS+6-BA
0.5mg/L+2 , 4-D 1.5 mg/L+AC;MS 。
1.2.2 继代培养基 。MS+6-BA 0.5 mg/L+2 , 4-D 1.0
mg/L+AC;MS+6-BA2.0mg/L+2 , 4-D0.5mg/L+AC;
MS+6-BA 1.0 mg/L+2 ,4-D1.5 mg/L+AC。
1.2.3 分化培养基 。MS+6-BA 2.0 mg/L+2 , 4-D 1.5
mg/L+AC;MS+6-BA2.0mg/L+2 , 4-D0.5mg/L+AC;
MS+6-BA 0.5mg/L+2 , 4-D2.0mg/L+AC;MS+6-BA
1.0mg/L+2 , 4-D 1.5 mg/L+AC;MS 。
1.2.4 生根培养基 。MS+6-BA 0.5 mg/L+2 , 4-D 2.0
mg/L。
1.3 试验方法
1.3.1 愈伤组织的诱导培养 。
1.3.1.1 外殖体的灭菌 。将供试外殖体用自来水冲洗数
分钟 ,洗去附着在材料表面的尘土及一部分杂菌 ,沥干后
在超净工作台上用浓度 75%的酒精浸润 30 s(嫩叶片浸润
10 s),立即取出 。再放入浓度 1‰的升汞溶液中浸泡 5 ~
10min ,接着用无菌水反复冲洗 4 ~ 5次 ,每次持续 3 ~ 4
min 。冲洗完后 ,用无菌滤纸吸干外殖体上的水分 ,用剪刀
将其剪成 2 cm 左右的小方块或小段 。
1.3.1.2 外殖体接种 。将消毒好的外殖体材料接种到直
径10 cm ,盛有 40 ml培养基的罐头瓶中 ,每瓶接种 5片或
5段 。接种后 ,放到25 ℃、黑暗条件下培养 。每3 d观察1
安徽农业科学 , 2004 , 32(1):111-114
Journal of Anhui Agricultural Sciences
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2004.01.070
次 ,并记录相关数据 。
1.3.1.3 外殖体及诱导培养基的选择 。在 4种不同的诱
导培养基上分别接种叶、叶柄和幼茎 ,观察记载产生愈伤
组织的数量。通过比较 、分析 ,筛选出最佳的诱导培养基 。
1.3.2 防止外殖体褐变的研究 。设3个不同的处理 ,并设对
照 ,即活性炭的含量分别为 20、5、1mg/L。配好培养基并灭
菌后 ,充分摇动培养基 ,使活性炭均匀地分散在培养基中。
1.3.3 防止玻璃化现象的研究。对 5种愈伤组织培养基
分别接种观察 ,每种培养基接种50瓶 ,记录外殖体发生玻
璃化的频率及培养基中组分的用量 。
1.3.4 防止细菌污染的研究 。在超净工作台上待灭菌培
养基冷却到 45 ℃左右时 ,用注射器加入 2滴 40 μg/ml的
硫酸链霉素溶液于培养基中 ,摇荡均匀 ,冷却后接入外殖
体 ,培养观察记载细菌的污染数目和愈伤组织诱导率 ,评
价其效果。
1.3.5 愈伤组织继代培养基的筛选 。将较好的愈伤组织
块(疏松、淡黄白色 、柔软)接种到不同激素浓度的培养基
上继代培养 ,观察愈伤组织的增殖量和质量 ,筛选出最佳
培养基 。
1.3.6 诱导分化培养基的筛选。将增殖后生活力强的愈
伤组织块转移到 5 种不同的分化培养基上 ,诱导芽的分
化 ,观察统计诱导率 ,筛选出最佳诱导培养基。培养条
件:温度 24 ~ 26 ℃,光照时间 12 h/ d ,光照强度 1 500 lx 。
1.3.7 生根培养 。选出分化培养中长 2 cm 左右 、有 1 ~ 2
片叶的不定芽 ,转移到生根培养基 MS +6-BA 0.5 mg/L
+2 ,4-D2.0 mg/L上进行生根培养 。培养条件:温度 25
℃,光照时间 24 h/d ,光照强度 1 500 lx。
1.3.8 试管幼苗驯化栽培。将长 4 ~ 6 cm 左右 、根系发
达的幼苗从培养基中取出 ,充分洗净附着在幼苗根部的
培养基(注意不能伤到根系),然后用 400 mg/L的 GA3浸
泡幼苗根部 2 h ,即可移栽到由灭菌的菜园土和蛭石(1∶2)
组成的营养钵中。移栽前先用清水将基质浸透 ,然后用
竹签挖小孔将根栽入 ,轻压并用水浇平 ,再用塑料袋覆盖
营养钵以保持湿度在 80%~ 90%,最后将营养钵置于 25
℃,光照时间 12 h/d ,光照强度 1 500 lx的条件下培养 ,每
隔 3 d浇 1次 50倍 MS培养基营养液残液 。7 d 后揭开塑
料袋 ,放在室温中炼苗 ,10 ~ 20 d后栽入大田。
1.3.9 细胞培养快速增殖研究。将较疏松的愈伤组织切
成直径 0.5 cm 左右的小块 ,分别转移到 2种不同激素浓
度的培养液中 ,每瓶接种 2 块 ,然后放到摇床上进行振荡
培养 ,培养条件:温度 25 ℃, 暗培养 , 摇床转速为 150
转/min 。每隔 1 d观察变化 ,培养10 d ,记录增殖量 。
1.3.10 幼根在增殖培养中的应用 。将生根培养基中长
势较好植株的一部分幼根 ,切成 1 ~ 2 cm 的小段 ,转移到
诱导培养基上进行诱导增殖培养 ,观察记载结果 。
2 结果与分析
2.1 外殖体的选择 不同的外殖体材料在不同培养基
上的诱导率不同。由表 1 可以看出 ,叶片的诱导率最高 ,
在4种不同激素浓度的培养基上均能诱导出愈伤组织;
而叶柄及幼茎都没有产生愈伤组织。由此可以得出结
论:在龙牙木匆心木组织培养中 ,叶片的诱导效果最好 。
  表 1  不同接种材料和培养基对愈伤组织诱导率的影响
培养基 外殖体
接种数

愈伤组织
数∥块
诱导率
%
MS+6-BA 1.0mg/ L 叶片 30    7   23.3
+2 , 4-D0.5mg/ L 叶柄 10 0 0.0
幼茎 10 0 0.0
MS+6-BA 1.0mg/ L 叶片 30 9 30.0
+2 , 4-D1.0mg/ L 叶柄 10 0 0.0
幼茎 10 0 0.0
MS+6-BA 2.0mg/ L 叶片 35 13 37.1
+2 , 4-D1.5mg/ L 叶柄 10 0 0.0
幼茎 10 0 0.0
MS+6-BA 0.5mg/ L 叶片 50 6 12.0
+2 , 4-D1.5mg/ L 叶柄 10 0 0.0
幼茎 10 0 0.0
MS 10 0 0.0
2.2 诱导培养基的筛选 叶片接种后 7~ 9天就可出现
微小的淡黄色皱缩突起 ,约30d后出现愈伤组织 ,再过7d
左右就可形成较大的愈伤组织块。但不同浓度的激素组
合的诱导率有所不同 ,即在 MS培养基中附加不同比例的
2 , 4-D和 6-BA ,对诱导率有很大的影响 。MS 培养基中
的 2 , 4-D含量在 1.0 mg/L时 ,有利于愈伤组织的形成;
2 , 4-D含量达到 1.5mg/L 时 ,诱导率呈下降趋势 。如果
在培养基中加入少量的 6-BA ,诱导率显著提高。由表 1
可见 , 6-BA 和 2 , 4 -D的浓度分别为 2.0 和 1.0 mg/L
时 ,诱导效果最好 ,诱导率达 37.1%。故最佳的诱导培养
基为 MS+6-BA 2.0 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L。
2.3 外殖体褐变的控制 所谓褐变 ,即指接种外殖体在
创伤处形成褐色 ,不能形成愈伤组织的现象。在诱导龙
牙木匆心木愈伤组织时 ,很容易发生褐变现象 。外植体的褐
变是导致培养失败的重要原因。发生褐变主要在损伤的
外殖体内 ,褐变机理是损伤的外植体创面分泌的多酚氧
化酶遇氧形成醌类物质 ,使创面变成了褐色 ,而醌类物质
对植物是有毒害作用的 。因此 ,在防止外殖体褐变的措
施中 ,加入抗氧化的活性炭是研究者常用的方法[ 5] 。用
活性炭防止褐变的效果与加入活性炭的多少有关。该试
验结果表明 , 5g/L活性炭防止褐变效果最好 。过多的活
性炭会固定培养基中的营养物质 ,从而使愈伤组织吸收
营养不足而表现瘦小(表 2)。
2.4 外殖体玻璃化的控制 龙牙木匆心木的组织培养中 ,外
殖体易形成半透明的畸形隆起物 ,开始时颜色比较透明 ,
后来渐渐地变成了淡褐色透明物 ,以致不能诱导形成愈
伤组织 ,最后干枯而死 ,这即是玻璃化现象[ 6] 。玻璃化现
象已成为组培快繁中提高繁殖率和增加培养过程稳定性
的主要障碍 ,严重影响组培在生产上的应用[ 7] 。
112                      安徽农业科学                  2004年
  表2 不同比例的活性炭对褐变发生程度的影响
活性炭加入量
g/ L
褐变发生
程度∥% 愈伤组织的长势
10 10 愈伤组织块较小 ,瘤状体不多 ,瘦小
5 25 愈伤组织块大 ,瘤状体多 ,生活力强
1 75 愈伤组织块大 ,瘤状体很少,强壮
  通过试验和观察可以从以下几个方面防止玻璃化的
发生:
(1)适当地提高琼脂的浓度 。在该试验中 , 5 g/L琼脂
比 7.5 g/L琼脂玻璃化严重些。琼脂过多 ,培养基中的营
养物质被固定 ,很难被吸收利用;琼脂过少 ,培养基呈流
动状态 ,也不利于外殖体生长。该试验的琼脂最适用量
为 7.5 g/L。通过试验发现 ,在愈伤组织的诱导过程中琼
脂用量偏少 ,可以有效地防止外殖体的玻璃化 ,同时也有
利于外殖体吸收营养物质。而在分化及生根培养时 ,琼
脂用量可稍多一些 ,一方面有利于固定幼苗 ,另外对营养
物质的吸收影响也不大 。
(2)降低细胞分裂素(6-BA)的浓度 。试验对 5种诱
导培养基的接种情况进行比较发现 , 6-BA含量低的诱导
培养基发生玻璃化的频率要低 。
2.5 细菌污染的解决方法 由于龙牙木匆心木外殖体维管
束内部带有细菌 ,表面灭菌很难完全杀死细菌 ,因此容易
引起培养基污染。试验中使用硫酸链霉素控制细菌的繁
殖 ,取得了较好的效果 。在培养过程中 ,加入链霉素的培
养基中的愈伤组织块或不定芽长势良好 ,而没加链霉素
的培养基中的愈伤组织或不定芽周围则有淡黄色浓液
(细菌),7 d后接种材料就会被细菌包围而长势衰弱 ,最后
枯竭而死。
2.6 愈伤组织的继代培养 在继代培养中 ,经 21 ~ 28 d
就可产生较多的愈伤组织块 。试验结果表明 ,3 种培养基
都有增殖作用 ,但是增殖速率有所不同 ,愈伤组织的生长
速率因 6-BA的浓度不同而有所差异 。从表 3可看出 ,
在基础培养基中加入 1.0 mg/L的 6 -BA和 1.5 mg/L的
2 , 4-D可以获得最好的增殖率 ,即最佳增殖培养基为 MS
+6-BA 1.0mg/L+2 , 4-D 1.5 mg/L 。
  表3 不同激素浓度对继代培养的影响
培养基 愈伤组织状态
MS+6-BA 0.5mg/ L+2 , 4-D 1.0mg/ L+AC瘤状体不大 ,小瘤数量
增加了 20%,黄绿色
MS+6-BA 2.0mg/ L+2 , 4-D 0.5mg.L+AC瘤状体大 ,数量增加了
1倍 ,生活力强
MS+6-BA 1.0mg/ L+2 , 4-D 1.5mg/ L+AC继代效果较差 ,瘤状体
数量变化不大
2.7 芽的诱导分化培养 将外殖体中形成的愈伤组织
或继代培养得到的愈伤组织 ,转移到分化培养基上诱导
芽的分化 ,都能分化出不定芽 。
激素的浓度对芽的分化有很大的影响 。由表 4 可
知 ,在进行分化培养时 ,降低 2 , 4 -D的浓度对芽的诱导
分化有明显的效果;如在降低 2 , 4-D浓度的同时加入一
定量的 6-BA效果更好 ,没有加 2 , 4-D的培养基中分化
出来的芽比较瘦小 ,而且都比较短。
5种不同激素浓度的分化培养基中以基础培养基中
附加 2.0 mg/L的 6-BA和 0.5 mg/L的 2 , 4-D 效果最
好 ,即最佳分化培养基为 MS +6 -BA 2.0 mg/L+2 , 4-D
0.5mg/L ,平均诱导分化率达 85%(表 4)。
  表 4 不同激素浓度对芽生长的影响
培养基 不定芽的生长情况
MS+6-BA 0.5mg/ L+2 , 4-D 2.0mg/ L分化较慢 ,出现部分玻璃化苗
MS+6-BA 1.0mg/ L+2 , 4-D 1.5mg/ L分化较慢 , 少数芽长了根 , 芽
比较瘦弱
MS+6-BA 2.0mg/ L+2 , 4-D 1.5mg/ L分化较快 ,但出现畸形苗
MS+6-BA 2.0mg/ L+2 , 4-D 0.5mg/ L分化最快 ,芽粗状 ,生活力强
MS 分化一般 ,芽较瘦小 , 40 d左右
易玻璃化
2.8 生根培养 不定芽接到生根培养基 MS +6-BA 0.5
mg/L+2 ,4-D2.0mg/L上 ,培养 21 d左右 ,就可长出白色
的根 ,多数主根上有侧根 2 ~ 3 条。待幼根长到比较粗壮
时进行移栽 。
2.9  试管苗驯化移栽效果 试管苗经 17 d左右的驯化
培养后 ,移栽成活率达 85%,且幼苗长势良好 。
2.10 细胞培养快速增殖效率(表 5) 用培养液进行愈
伤组织的增殖培养 , 15 d后即可产生大量生活力强的愈伤
组织颗粒 ,颗粒直径 2 ~ 10mm ,但以 5 mm 的居多 ,增殖量
扩大 2 ~ 3 倍(表 5)。这些愈伤组织颗粒呈淡黄色 ,生活
力也比在固体培养基中继代的愈伤组织要强。MS+6-
BA1.0mg/L+2 , 4-D 0.5 mg/L培养基增殖效果较好 ,平
均增殖量达到 3倍 。
  表 5 不同激素水平的液体培养基对增殖的影响
培养基 接种瓶数 培养天数
d
增殖量

MS+6-BA 0.5mg/ L A 15 1
+2 , 4-D1.0mg/ L
B 15 2
C 15 2
D 15 1
MS+6-BA 1.0mg/ L A 15 3
+2 , 4-D0.5mg/ L
B 15 4
C 15 2
D 15 3
2.11 幼根诱导增殖培养效果 用幼根增殖只需 5 ~ 7 d ,
就可以形成大量的生活力强的愈伤组织 ,而使用其他材
料至少要 14 ~ 21 d ,甚至更长;用幼根分化出来的愈伤组
织的增殖量也比用其他材料多 5 ~ 8倍 。
用幼根进行增殖所得的愈伤组织块大 ,疏松 ,柔软 ,黄绿
色 ,分化能力强 ,转移到分化培养基上很快就能分化成胚状
11332 卷 1期          秦亚平等  木组织培养与快速繁殖技术研究
体并长成植株。证明幼根是优良的增殖培养材料。
2.12 试管苗驯化栽培 将幼根诱导增殖后形成的植株
移栽到营养钵上 ,经精心管理 ,幼苗存活率达 80%。
3 小结与讨论
(1)龙牙木匆心木组织培养时外殖体有多种 ,而该试验主
要以叶 、叶柄及幼茎分别进行试验 ,结果表明 ,叶片的诱
导效果最好 ,诱导率达 37.1%。
(2)在进行诱导培养时 ,诱导率随着 2 , 4 -D浓度的
增加而增加 ,但 2 ,4-D浓度达 1.5 mg/L时 ,诱导率则呈
下降趋势。如果在适当增加 2 , 4-D浓度的同时 ,加入少
量的 6-BA ,诱导率可以显著提高。即 MS+2 , 4-D 1.0
mg/L+6-BA 2.0 mg/L诱导率较好 。
(3)用幼根作为增殖材料 ,可使增殖量达到增殖前的
5 ~ 8倍 ,且增殖时间缩短到 7 d以内 。因此 ,幼根是一种
好的繁殖材料 。
(4)40μg/L的硫酸链霉素控制细菌的污染效果较好 ,
可应用于龙牙木匆心木组织培养上 。
(5)活性炭防止外殖体的褐变效果显著 ,但浓度不宜
过高 ,以 5 g/L为宜 。
(6)琼脂加入量控制在 7.5 ~ 8.0 g/L时 ,可有效防止
外殖体玻璃化的产生 。
(7)试验结果表明 ,试管苗驯化率达 80%,有一定的
推广与应用价值。
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(责任编辑:金琼琼 责任校对:金琼琼)
(上接第 110页)
达 105 元/hm2;重灾发生年份 ,松毛虫防治经费达 150
元/hm2以上 。至于松梢螟的危害 ,马尾松纯林要比混交林
高55.15%。研究表明 ,营造针阔混交林能抑制松毛虫和
松梢螟的危害 ,并且具有显著的生态 、社会和经济效益。
5 结论
(1)从提高林地生产力角度来衡量 ,马尾松与枫香的
块状 、带状混交均比马尾松纯林高 ,单位面积蓄积量分别
比纯林高91.7%和33.3%;而块状混交比带状混交高43.7%。
同时 ,混交林的形质指标也高于纯林。因此 ,营造混交林的
增产潜力是很大的 ,尤其应提倡营造块状混交林。
(2)马尾松与枫香混交造林 ,其林地土壤理化性质得
到改善 ,肥力随之提高 。不仅提高了本代林分生产力 ,而
且可为下代林分正常生长发育 ,提供了可靠的营养基础。
同时 ,可防止土壤逆向演替 、灰化和贫瘠化。
(3)针阔混交林由于林地生态条件优越 ,能抑制或减
轻松毛虫 、松梢螟的危害 。混交林可减少松毛虫防治经
费 105 元/hm2;混交林由于少受松梢螟对主梢的危害 ,其
树干 Ⅰ 、Ⅱ级通直度比马尾松纯林高 25.95%,并能减轻
松材线虫的入侵。因此 ,营造混交林是避免虫害大发生
的关键所在 。
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(责任编辑:罗芸 责任校对:罗芸)
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