全 文 ：基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 6期，第 678-681页
Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.6, 678-681
研究报告
A Letter
罗汉果种子传播小西葫芦黄化花叶病毒的检测
朱英芝 1,2 陈保善 2,3 蒙姣荣 2,3*
1广西大学农学院,南宁, 530004; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530004; 3广西大学生命科学与技术学院,南宁,
530004
*通讯作者, mengjiaorong@163.com
摘 要 为了解小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)是否能通过罗汉果种子传播。本
研究通过取 ZYMV阳性的罹病罗汉果植株种子 700粒，400粒直接播种于防虫网室中，300粒经表面消毒处
理后播种于MS培养基上。最终获得 213棵罗汉果实生苗。对所获得实生苗进行生物学鉴定及 ZYMV特异性
RT-PCR检测，均未检测到 ZYMV阳性植株。结果表明 ZYMV不能经罗汉果种子传播，或其传播率很低。
关键词 罗汉果,小西葫芦黄化花叶病毒, RT-PCR,种子
Detection of Zucchini yellow mosaic virus Transmission through Seeds of
Siraitia grosvenorii
Zhu Yingzhi 1,2 Chen Baoshan 2,3 Meng Jiaorong 2,3*
1 College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, 530004; 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-biore-
sources, Nanning, 530004; 3 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530004
* Corresponding author, mengjiaorong@163.com
DOI: 10.3969/gab.030.000678
Abstract In order to understand whether the Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) transmitted through seeds
of Siraitia grosvenorii. A total of 700 seeds were collected from ZYMV-infected plants. Four hundred of 700 seeds
were cultivated directly in net-house for control pest, and 300 were cultivated in MS medium after surface steril-
ization with alcohol. ZYMV of young plantlets were detected by observation or RT-PCR with ZYMV-specific
primers. Two hundred and thirteen young plantlets were survived from 700 seeds. No ZYMV-positive sample was
detected by observed or RT-PCR with ZYMV-specific primers. The results indicated that ZYMV could not be
transmitted via seeds of Siraitia grosvenorii, or the transmission rate was very low.
Keywords Siraitia grosvenorii, Zucchini yellow mosaic virus, RT-PCR, Seeds
罗汉果(Siraitia grosvenorii)是我国特有的一种同
时兼备了食用和药用功能的葫芦科罗汉果属植物(李
典鹏和张厚瑞, 2000)，具有清热润肺，止咳祛痰，滑肠
通便等作用。近几年来，罗汉果种植面积逐年增加，
但病虫害特别是病毒病十分严重，在开花之后至果
实成熟之前，田间的病毒感染率几乎达到 100% (林纬
等, 2003)，以至于其栽培模式已由传统多年生栽培，
演化为现在的完全采用脱毒组培苗的一年生栽培。小
西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,
ZYMV)是罗汉果病毒病原之一，严重影响罗汉果产量
和质量(林国光和周广泉, 1982; Liao et al., 2005)。
1919年，Reddick等(1919)首先报道病毒可通过
植物种子进行传播，随后研究表明，约 18%植物病毒
可通过种子传播(Johansen et al., 1994)。由带毒种子
形成的初侵染来源经媒介传播后可导致植物病毒病
害迅速流行(German-Retana et al., 2008)。目前，尚未
见有 ZYMV能否通过罗汉果种子传播的相关报道。
因此研究病毒是否能通过种子传播，可为罗汉果的
栽培和病毒病害防治提供科学依据。
本文拟通过采集感染 ZYMV的罗汉果植株的种
子，经栽培后对植株进行 ZYMV 检测，以明确
ZYMV能否通过罗汉果种子进行传播。
基金项目:本研究由广西自然科学基金项目(桂科自 0832045)和广西创新能力建设项目(桂科能 05112001-1B,桂科能05112001-1)
共同资助
1结果与分析
1.1田间罗汉果植株的 PCR检测
通过 RT-PCR方法对田间 18 棵具有典型花叶
病症状的罗汉果植株进行检测。PCR产物经 0.8%琼
脂糖凝胶电泳后，所有样品均检测到 1 074 bp的特
异性核苷酸片段(图 1)，产物大小与理论设计值一致，
阴性对照无特异性核苷酸片段。结果表明，这 18棵
罗汉果植株均已被 ZYMV感染。
图 1具有典型花叶病症状叶片的 RT-PCR扩增产物检测
注: M: 1 kb DNA Ladder; 1~6, 8~19:具有典型花叶病症状样品
(1~18); 7:健康对照
Figure 1 RT-PCR detection of ZYMV from leaves of Siraitia
grosvenorii with typical mosaic symptom
Note: M: 1 kb DNA Ladder; 1~6, 8~19: Individual plants (num-
ber 1~18) with mosaic symptom; 7: Healthy plant
注:“-”:未发病
Note:“-”: No ZYMV-positive
汉果植株(表 1)。在对MS培养基中的 98棵实生苗进
行生物学观察中，也未观察到发病罗汉果植株(表 2)。
1.4罗汉果实生苗 RT-PCR检测
为进一步快速确定罗汉果种子能否传播
ZYMV，对 MS培养基上的罗汉果实生苗，在发芽后
25 d取样进行 ZYMV特异 RT-PCR检测。在 10个
小样本(小样本为一棵实生苗的叶片取 0.1 g)及 12个
图 2 RT-PCR产物的 ClaⅠ酶切鉴定
注: M: 100 bp DNA Ladder; 1~18:样品
Figure 2 Restriction of RT-PCR products derived from ZYMV-
infected Siraitia grosvenorii plants with restriction endonuclease
ClaⅠ
Note: M: 100 bp DNA Ladder; 1~18: Samples
注:“-”:未发病;“N”:无此叶片
Note:“-”: No ZYMV-positive;“N”: No leaf
表 2培养基种植的罗汉果实生苗生物学观察结果
Table 2 The result of observing with plantlets cultivated in MS
medium
叶片
Leave
顶叶
Parietal
二叶
Futaba
三叶
Clover
3 d
-
-
N
6 d
-
-
N
9 d
-
-
N
12 d
-
-
N
15 d
-
-
N
18 d
-
-
-
21 d
-
-
-
25 d
-
-
-
观察时间
Observation time
表 1防虫网室中罗汉果实生苗生物学观察结果
Table 1 The results of observing with plantlets cultivated in net-house
叶片
Leave
顶叶
Parietal
二叶
Futaba
三叶
Clover
观察时间
Observation time
5 d
-
-
-
10 d
-
-
-
15 d
-
-
-
20 d
-
-
-
25 d
-
-
-
30 d
-
-
-
45 d
-
-
-
60 d
-
-
-
75 d
-
-
-
90 d
-
-
-
105 d
-
-
-
120 d
-
-
-
135 d
-
-
-
150 d
-
-
-
1.2 PCR产物的酶切鉴定
对上述的 PCR产物进行酶切鉴定，经凝胶电泳
后，所有的 PCR产物均分解为一条约 752 bp和一条
约 322 bp的特异性核苷酸片段(图 2)，与预期大小一
致。结果表明，通过特异性引物扩增获得的 PCR产物
为 ZYMV特异性核苷酸片断，进一步确认这 18棵罗
汉果已被 ZYMV感染。
1.3罗汉果实生苗的生物鉴定
在罗汉果发芽后连续 5个月对播种在防虫网室内
的 115棵罗汉果实生苗进行观察，均未观察到发病罗
罗汉果种子传播小西葫芦黄化花叶病毒的检测
Detection of Zucchini yellow mosaic virus Transmission through Seeds of Siraitia grosvenorii 679
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
大样本(大样本为 7~8棵实生苗的叶片剪碎混匀,取
0.1 g)中，都没有检测到 ZYMV特异性核苷酸片段，
但阳性对照可扩增出约 1 kb的 ZYMV特异性核苷
酸片段(图 3;图 4)。
图 3小样本罗汉果实生苗的 RT-PCR检测
注: M: 1 kb Ladder DNA Marker; 1:阳性对照; 1~11:实生苗
Figure 3 RT-PCR detection of ZYMV from individual seedlings
of Siraitia grosvenorii derived from seeds of ZYMV-infected
plants
Note: M: 1 kb Ladder DNA Marker; 1: ZYMV positive control;
1~11: Seedlings
图 4大样本实生苗的 RT-PCR检测
注: M: 1 kb Ladder DNA Marker; 1~12:大样本实生苗检测
Figure 4 RT-PCR detection of ZYMV from mixed samples of
Siraitia grosvenorii seedlings derived from seeds of ZYMV-in-
fected plants
Note: M: 1 kb Ladder DNA Marker; 1~12: Mixed samples
number
行传播，种子传播百分率可达 18.95% (Davis and Miz-
uki, 1986; Schrijnwerkers et al., 1991; Tóbiás et al.,
2008)；另一种说法则认为 ZYMV不能通过植物种子
进行传播(Nameth et al., 1985; Gleason and Provviden-
ti, 1990; Roinson et al., 1993)。对于 ZYMV能否通过罗
汉果种子进行传播，还未见到报道。本研究表明，ZYMV
不能够通过罗汉果种子进行传播或是传播效率很低。
这为通过有性繁殖获得优良罗汉果新品种提供科学依
据，为获得抗病毒罗汉果品种提供理论基础。
3材料与方法
3.1植物种子材料
罗汉果植株种于广西大学农学院植物病理研究
室的防虫网室内。呈典型花叶症状的植株，经 ZYMV
特异 RT-PCR检测及酶切鉴定确认后，挂牌标记。测
试的种子由病株上采摘的果实获得。
3.2试剂
Ex Ta q DNA 聚合酶、限制性内切酶购于
TaKaRa 公司；RNA 提取试剂盒 TRNzol-A+购自天
根生物有限公司；反转录试剂盒 Revert Aid First
Strand cDNA Synthesis Kit购自 Ferment公司；引物
由上海生工生物工程技术有限公司合成。
3.3罹病种子的获得
破碎田间采集的果实，取出种子并洗掉果囊，晒
干后置于室温中保存(保存不超过一个月)。
3.4实生苗的生物学鉴定
晒干后的种子播种于防虫网室内，保持土壤湿
润，直至种子发芽。种子破土后一个月内，每隔 5 d观
察一次是否有植株表现出病毒病症状，随后 4个月
每隔 15 d观察一次，并记录从顶叶往下数前三片叶片
的发病情况。如有病毒症状的植株，则进行 RT-PCR
鉴定。对于播种到MS培养基中的罗汉果实生苗，在
种子发芽之后至采样之前，每隔 3 d观察一次，同样记
录从顶叶往下数前三片叶片的发病情况。
3.5无菌实生苗的培养
种子剥去外壳；75%乙醇处理 30 s，灭菌 ddH2O
洗 3次；0.1%升汞处理 8 min，灭菌 ddH2O清洗 8次；
灭菌滤纸吸附种子表面多余的 ddH2O后，将种子播种
到MS培养基上，每个瓶子播一粒种子。25℃暗培养
10 d，然后于 25℃，12 h/d光照(光照强度为 2 600 Lux)
培养 25 d。
2讨论
种子传毒的鉴定方法主要有：直接播种的生物
学鉴定法、电子显微镜法、血清学方法及分子生物学
检测法。用生物学鉴定法具有简单、成本低等特点，
但需要耗费时间长，对于隐症病毒及病毒种类不能
准确判断。分子生物学检测法虽然成本高，但具有灵
敏度高的特点。本研究把组织培养技术与分子生物
学检测技术相结合的方法，具有省时及灵敏度高等
特点。此外，本研究采用小样本与大样本相结合的方
法降低分子生物学检测的成本，为用分子生物学检
测种子传毒提供新思路。
科研工作者对 ZYMV能否经种子传播进行过相
关研究，并通过对不同作物的研究得出两种截然相反
的结论。一种说法认为 ZYMV可以通过植物种子进
680
3.6实生苗总 RNA提取
罗汉果总 RNA提取参照 TRNzol-A+提取试剂
盒提供的方法 (实生苗分为小样本及大样本,如小样
本检测结果表明实生苗带毒率较低,则用大样本检
测 , 降低检测成本 )。获得的罗汉果总 RNA 置于
-80℃中保存，待用。
3.7 RT-PCR的分子生物学检测
第一链 cDNA 合成体系参考 RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit所提供的方法。PCR体系
为 25 μL，其中 ddH2O 17 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，
模板 (合成的第一链 cDNA) 1 μL，dNTP 1 μL，
ZYMVCP (+) 1 μL，ZYMVCP (-) 1 μL，Ex Taq 聚合
酶 0.2 μL。反应的参数为：95℃预变性 5 min；95℃变
性 30 s，60℃ 退火 30 s，72℃延伸 2 min 共 30 个循
环；最后 72℃延伸 10 min。取上述 PCR扩增获得的
产物，在 0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量
为 5 μL。
3.8检测引物的设计
根据 GenBank 中 ZYMV外壳基因核苷酸序列
保守区设计检测引物：ZYMVCP (-)：GACTACGGCA
CTCCTGGACCAC，ZYMVCP (+)：GGGGAGCGGA
GACAAGTGAACTG，预期特异性产物的长度为
1 074 bp。
3.9 PCR产物的酶切鉴定
为进一步确认 PCR扩增片段为 ZYMV的特异
性片段，用限制性内切酶 ClaⅠ对 PCR产物进行酶
切鉴定。
作者贡献
朱英芝负责资料查阅、实验操作及论文撰写。陈
保善和蒙姣荣老师负责指导实验及帮助修改论文。
致谢
感谢广西大学农学院植物病理研究室林纬老师
提供罗汉果植株及种子材料。感谢评审人对本文提
出的宝贵意见及做出的修改。
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