全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceut ical Biotechno logy 　2006 ,13(2):107 ～ 111
螺旋藻多糖硫酸酯化修饰前后抗肿瘤及免疫活性的研究*
盛玉青1 ,尹鸿萍2* ,李海涛1 ,徐士君1
(1. 南京中医药大学 药学院 , 江苏 南京 210046;2. 中国药科大学 生命科学与技术学院 , 江苏 南京 210009)
摘　要　比较螺旋藻多糖硫酸酯化修饰前后体内外抗肿瘤及免疫活性。采用 M TT 比色法研究药物在体
外对人肿瘤细胞株的抑制作用 ,促进正常小鼠脾淋巴细胞的增殖活性以及对荷瘤小鼠 NK 和 CTL 细胞活性的
影响 。采用移植性肿瘤实验方法考察了药物对小鼠 S180 肉瘤的抑制作用。结果显示 ,螺旋藻多糖(NPSP)对肿
瘤细胞株几乎无细胞毒作用 , 硫酸酯化螺旋藻多糖(SNPSP)对肿瘤细胞株具有显著的细胞毒作用 , 其中对
SM MC-7721 人肝癌细胞株抑制率最高达 50%。 NPSP50 mg /kg 对小鼠 S180 肉瘤无抑制 , 相同剂量的 SNPSP
对小鼠 S180肉瘤的抑制率达 35. 42%。 NPSP 具有促进脾淋巴细胞增殖作用 , 但对 ConA 和 LPS 诱导的脾淋巴
细胞增殖反应无促进作用 , SNPSP 促进脾淋巴细胞增殖作用较 NPSP 增强 , 同时对 ConA 和 LPS 诱导的脾淋巴
细胞增殖反应也具有明显的促进作用。 NPSP 和 SNPSP 均能促进荷瘤小鼠 NK 细胞和 C TL 细胞活性 , 其中
S NPSP促进 C TL细胞活性较 NPSP 增强。
关键词　螺旋藻多糖;硫酸酯化;抗肿瘤;细胞免疫
中图分类号:Q539　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2006)02-0107-05
　　多糖硫酸酯或称硫酸酯化多糖是指含有硫酸
基团的天然及其半合成的酸性多糖 ,为聚阴离子化
合物 。自 1987年发现硫酸酯化葡聚糖具有抑制艾
滋病病毒 HIV 活性以来 ,后来的研究发现硫酸酯
化多糖还具有抗肿瘤 、增强免疫等作用 。本实验室
从钝顶螺旋藻(Spirulina Platensis)中提取螺旋藻
多糖(NPSP),采用氯磺酸-吡啶法对 NPSP 进行硫
酸酯化修饰 ,得到硫酸酯化螺旋藻多糖(SN PSP),
并对其体内外抗肿瘤及细胞免疫活性进行了初步
研究 。
1　材　料
1. 1　药物
NPSP 和 SNPSP 均为本实验室自制 ,纯度均
大于 90%,玫瑰酸钠法测定 SNPSP的 SO 2-4含量为
23. 4%。体外实验将 NPSP 和 SNPSP 用不含血
清的 RPMI 1640培养液配制成 10 mg /m l的母液 ,
过滤除菌 ,并稀释至所需的浓度 ,体内实验在临用
前将它们用无菌生理盐水溶解 。
1. 2　药品与试剂
RPM I 1640培养基(Gibco 公司),新生小牛血
清(FCS ,杭州四季青生物工程有限公司),四甲基
偶氮唑盐(MT T ,Amresco 公司),刀豆蛋白 A(Co-
nA ,Sigma公司),细菌脂多糖(LPS ,Sigma公司),
环磷酰胺(CY , 上海华联制药有限公司 , 批号
031006),丝裂霉素(Kyow a Hakko Kogyo 公司 ,批
号 385BBE),重组人白介素-2(rIL-2 ,江苏金丝利
药业有限公司 ,批号 20050101)。
1. 3　主要设备
倒置显微镜(重庆光学仪器厂),超净工作台
(苏州净化设备厂), DG5031 型酶联免疫检测仪
(国营华东电子管厂), CO2孵箱(Thermo 公司),
80-2离心沉淀器(上海手术器械厂), 96 孔培养板
(Co rning 公司)。
1. 4　动物及肿瘤细胞株
SGC-7901人胃癌细胞株 , KB 人口腔上皮癌
细胞株 ,SMMC-7721 人肝癌细胞株 , Hela 人宫颈
癌细胞株 , YAC-1 小鼠淋巴瘤细胞株均购自上海
细胞生物学研究所 。小鼠S180肉瘤由江苏省肿瘤
医院动物实验中心提供。昆明种小鼠 ,体重 20±
2 g ,中国药科大学实验动物中心提供 ,动物合格证
号 SCXK(苏)2002-0011。
107
* 收稿日期:2005-09-14　　修回日期:2005-11-01
作者简介:盛玉青 ,女 , 1977年生 ,南京中医药大学药学院 2003级硕士研究生。
　 * 通讯作者:尹鸿萍 ,副教授 , Tel:025-83271108
2　方　法
2. 1　体外对肿瘤细胞株的抑制作用
取对数生长期的肿瘤细胞 ,胰蛋白酶消化后
以含 10%FCS的 RPM I 1640培养液调整细胞至
4×104 / ml。按每孔 0. 1 ml (4 000个细胞)加入
96孔培养板中 , 4 h后加入不同稀释浓度的 N P-
SP 、SNPSP 各 0. 1 m l ,阴性对照加等体积的 RP-
M I 1640完全培养液 ,每个浓度均设 4 个复孔 ,置
37℃体积分数为 5% CO 2孵箱中连续培养 48 h
或 72 h。培养结束前 4 h各孔加入 MTT(5 g /L)
20μl ,放置上述孵箱中继续孵育 4 h , 弃上清 ,每
孔加入二甲基亚砜 150 μl ,充分振荡混匀后于酶
标仪 570 nm 处测 OD 值 ,计算抑制率 。抑制率
(%)=(对照组 OD 值-药物组 OD 值) /对照组
OD 值×100%
2. 2　体内对小鼠 S180肉瘤的抑制作用
无菌取传代后 8 d的荷瘤小鼠的腹水 ,用生理
盐水稀释 ,调整细胞至 5×107 /m l ,每只 0. 2 m l接
种于小鼠右前肢腋下 ,接种后 24 h 随机分为 6组 ,
每组 10 只 , 分别为模型组(即 NS 组), CY 组
(20 mg /kg),NPSP 低剂量组(50 mg /kg),NPSP 高
剂量组(200 mg /kg),SNPSP 低剂量组(50 mg /kg),
SN PSP 高剂量组(200 mg /kg),另设正常对照组 ,
均以 10 m l/kg 的体积灌胃给药 ,每天 1 次 ,连续
9 d ,d10称重并处死动物 ,剥取瘤块 ,摘取脾脏和
胸腺 ,称重 ,计算抑瘤率 ,脾指数和胸腺指数。抑瘤
率=(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重) /模型组
平均瘤重×100%,脾(胸腺)指数=脾(胸腺)重
(mg) /体重(g)
2. 3　对小鼠免疫功能的影响
2. 3. 1　对正常小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响　
按常规方法制备正常小鼠的脾淋巴细胞 ,调整细胞
至 1×107 /ml , 于 96 孔板每孔加细胞悬液或经
5μg /m l的 ConA 和 10 μg /m l的 LPS 分别诱导的
细胞悬液各 100μl ,最后加入不同浓度的药物 NP-
SP 和 SNPSP 各 100 μl ,并设对照孔(加 100 μl
RPM I 1640完全培养液),每个浓度均设 4 个复
孔 ,混合均匀后 ,放置孵箱孵育 48 h ,M TT 比色法
于 570nm 处测 OD值 。
2. 3. 2　对荷瘤小鼠 NK 细胞活性的影响[ 1] 　动物
分组及给药同 2. 2 ,末次给药后 24 h无菌取荷瘤小
鼠的脾细胞 ,调整细胞至 2×106 /m l ,作为效应细
胞。取传代培养 24 h 的 YAC-1 细胞调整至
1×105 /ml ,作为靶细胞。在 96 孔细胞培养板中 ,
分别设效应细胞孔 、效靶细胞孔和靶细胞孔 3组 ,
每孔加入 100 μl 相应的细胞悬液 ,效靶细胞比例
为20∶1 ,每孔总体积为 200μl ,不足部分以 RPMI
1640完全培养液补齐 。每组均设 4个复孔 ,放置
孵箱培养 24 h , MT T 比色法于 570nm 处测 OD
值 ,计算 NK 细胞的杀伤活性 。NK 细胞的杀伤活
性(%)=[ 1-(效靶孔 OD 值-效应孔 OD 值)/靶细
胞孔 OD 值] ×100%
2. 3. 3　对荷瘤小鼠 CT L 细胞活性的影响[ 2] 　用
25μg /ml的丝裂霉素与活的 S180 细胞在 37℃条
件下作用 30 min 作为刺激细胞 ,上述荷瘤小鼠的
脾细胞与刺激细胞以 20∶1的比例加入 24 孔板
中 ,并加入终浓度为 50 IU /m l的 rIL-2 ,于 37℃体
积分数为 5%CO2孵箱中孵育 6 d , 3d换液 1次 ,
即获得 CT L 细胞 。用 0. 4%台盼蓝拒染法检测活
的 CT L 细胞为 90%以上 ,调整细胞至 2×106 /ml ,
将CTL 细胞移至 96孔细胞培养板中 ,按效靶比为
20∶1 的比例加入活的 S180细胞作为靶细胞 ,同
时设效应细胞和靶细胞对照孔 ,均设 4 个复孔 ,放
置孵箱培养 24 h ,MT T 比色法于 570nm 处测 OD
值 ,计算 CTL 细胞的杀伤活性 。CTL 细胞杀伤活
性公式同上述 NK 细胞杀伤活性公式 。
2. 4　用 SPSS11. 5统计软件中的 One-Way ANO-
VA进行多组数据之间的比较 ,用 t检验进行两组
数据之间的比较。
3　结　果
3. 1　体外对肿瘤细胞株的抑制作用
NPSP 、SN PSP 体外对 4种人肿瘤细胞株的抑
制作用见图 1 ～ 4 。由图中可以看出 ,在 12. 5 ～
200μg /ml的浓度范围内 NPSP 对这 4种瘤株几乎
没有直接细胞毒作用 ,而相同浓度的 SNPSP 却表
现出明显的细胞毒作用 ,其中对 SMMC-7721最为
敏感 ,200μg /m l的浓度抑制率达到 50%。
3. 2　体内对小鼠 S180肉瘤的抑制作用
由表 1可见 , NPSP200 mg /kg 剂量组对小鼠
S180肉瘤具有一定的抑制作用 ,但与模型组相比
无显著性差异(P>0. 05), 50 mg /kg 剂量组无抑
制肿瘤生长的作用。 SN PSP 2 个剂量组对小鼠
108 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 2 期　
S180肿瘤均有一定的抑制作用 ,其中 50 mg /kg 剂
量组对小鼠 S180 肉瘤的抑制作用显著(P <
0. 01),抑瘤率为 35. 42%,较 NPSP 同剂量组的抑
制率提高了 44%, 200 mg /kg 剂量组对小鼠 S180
肉瘤的抑制作用较低(P>0. 05)。CY20 mg /kg 剂
量组对小鼠 S180肿瘤具有明显的抑制作用(P <
0. 01),抑瘤率为 45. 14%,但 CY 对小鼠胸腺指
数 、脾指数也具有明显的抑制作用(P<0. 01),而
NPSP 、SNPSP 对小鼠胸腺指数和脾指数无明显影
响(P>0. 05)。
Tab 1　Effec t o f po NPSP , SNPSP on tumo r S180 in mice(x±s , n=10)
Group Dose (mg /kg) Tumor weight (g) Inhibito ry ratio (%) Thymus index Spleen index
Control - - - 2. 29±0. 40 6. 29±0. 82
Model - 1. 479±0. 398 0 2. 08±0. 87 7. 80±2. 66
CY 20 0. 811±0. 341 ** 45. 14 0. 90±0. 44 ** 4. 41±0. 78**
NPSP 50 1. 607±0. 337 -8. 64 1. 88±0. 95 6. 98±2. 57
200 1. 291±0. 289 12. 71 2. 29±0. 80 7. 44±1. 75
SNPSP 50 0. 955±0. 232 ** 35. 42 2. 59±0. 44 7. 50±2. 20
200 1. 385±0. 384 6. 34 2. 27±0. 97 7. 48±2. 22
*P<0. 05 , **P<0. 01 VS m odel group
3. 3　对小鼠免疫功能的影响
3. 3. 1　对正常小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响　
由表 2可见 ,5 ～ 100 μg /m l的 NPSP 和 SNPSP 对
小鼠脾淋巴细胞均有促增殖作用 ,其中 SNPSP 对
小鼠脾淋巴细胞促增殖作用更强 。5 ～ 100 μg /ml
的 NPSP 对 ConA和 LPS诱导的脾淋巴细胞增殖
反应无促进作用。不同浓度的SNPSP 对ConA 诱
导的脾淋巴细胞增殖反应均有促进作用 ,且低浓度
较高浓度作用更强 。SNPSP5 ～ 25 μg /ml对 LPS
诱导的脾淋巴细胞增殖反应也有促进作用 ,与对照
组比较具有显著性差异 。
109盛玉青等:螺旋藻多糖硫酸酯化修饰前后抗肿瘤及免疫活性的研究
Tab 2　Effect o f NPSP and SNPSP on the prolifer ation of lymphocy te s of no rmal mice in v itro(x±s , n=4)
Group
OD(570nm)
Without Inducement ConA LPS
Control 0. 296±0. 013 0. 385±0. 006 0. 678±0. 010
NPSP 5μg /ml 0. 305±0. 011 0. 389±0. 006 0. 688±0. 011
NPSP 10μg /ml 0. 315±0. 012 0. 387±0. 004 0. 679±0. 005
NPSP 25μg /ml 0. 313±0. 010 0. 372±0. 004 0. 657±0. 007
NPSP 50μg /ml 0. 353±0. 012** 0. 328±0. 007 0. 562±0. 000
NPSP 100μg /ml 0. 323±0. 011** 0. 195±0. 008 0. 225±0. 011
SNPSP 5μg /ml 0. 326±0. 010** 0. 439±0. 011 ** 0. 718±0. 004**
SNPSP 10μg /ml 0. 336±0. 014** 0. 448±0. 006 ** 0. 777±0. 008**
SNPSP 25μg /ml 0. 377±0. 009** 0. 439±0. 002 ** 0. 778±0. 003**
SNPSP 50μg /ml 0. 360±0. 016** 0. 406±0. 008 ** 0. 660±0. 003
SNPSP 100μg /ml 0. 400±0. 011** 0. 396±0. 012 * 0. 589±0. 015
*P<0. 05 , **P<0. 01 VS cont rol g rou p
3. 3. 2　对荷瘤小鼠 NK 细胞和 CT L 细胞活性的
影响　由表 3可见 ,与模型组比较 , NPSP 和 SNP-
SP 的高低剂量组均能明显提高 NK 细胞的活性
(P <0. 01),促进 NK 细胞杀伤靶细胞 YAC-1 。
NPSP(P<0. 05)和 SNPSP(P<0. 01)的高低剂量
组还能明显提高 CTL 细胞的活性 ,促进 CTL 细胞
杀伤靶细胞小鼠 S180 肉瘤细胞 ,其中 SNPSP 促
进 CT L细胞活性较 N PSP 更强 。
Tab 3 　Effect of NPS P、SNPSP on activities of NK cells
and CTL cells in tumor-bearing mice(x±s , n=6)
Group
Dose
(mg /kg)
Activity (%)
NK CT L
Control - 0. 518±0. 219 -
Model - 0. 376±0. 170 0. 482±0. 121
CY 20 0. 482±0. 134 0. 563±0. 119
NPSP 50 0. 681±0. 115 ** 0. 668±0. 104 *
200 0. 629±0. 136 ** 0. 666±0. 090 *
SNPSP 50 0. 693±0. 057 ** 0. 727±0. 063 **
200 0. 671±0. 140 ** 0. 725±0. 118 **
*P<0. 05 , **P<0. 01 VS m odel group
4　讨　论
一些天然的多糖经硫酸酯化修饰后抗肿瘤活
性得到了增强。茯苓多糖[ 3 , 4] 是一种不溶于水的
葡聚糖 , 将其硫酸酯化修饰后体内外抗 S180 、
MKN-45 、SGC-7901肿瘤的效果较硫酸酯化前得
到显著提高 ,这可能与修饰后多糖链的屈伸度增
加 ,水溶性增强有关 。Zhang 等[ 5] 也报道硫酸酯化
香菇多糖体外对多种人和鼠的肿瘤细胞株具有显
著的抑制增殖作用 ,其中对人乳腺癌细胞 MCF-7
的抑制率大于 50%,体内对小鼠 S180肉瘤的抑制
作用也较硫酸酯化前提高了 。本文的体内外抗肿
瘤实验也表明螺旋藻多糖经硫酸酯化修饰后抗肿
瘤活性得到了显著的提高。多糖的生物活性与其
结构和理化性质紧密相关 ,多糖硫酸酯化修饰后由
于所带硫酸基团的空间位阻和静电排斥效应改变
了多糖原来的空间结构 ,增加了糖链的屈伸度 ,提
高了水溶性 ,从而引起生物活性的改变[ 6] 。
机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切关
系 ,其中由 T 细胞介导的细胞免疫起着更重要的
作用 。NK 细胞是细胞免疫中的非特异性成分 ,是
一类在早期肿瘤免疫机制中起重要作用的效应细
胞 ,处于机体抗肿瘤的第一道防线。CTL 细胞是
一种特异性的细胞免疫成分 ,能特异性地清除体内
的肿瘤细胞 ,在肿瘤的免疫治疗中发挥了重要的作
用。NPSP 和 SNPSP 均能促进脾淋巴细胞增殖 ,
具有丝裂原样活性 , SNPSP对 ConA 和 LPS 诱导
的脾淋巴细胞增殖反应也有促进作用 。NPSP 和
SNPSP 还能提高荷瘤小鼠的 NK 细胞和 CTL 细
胞活性 ,其中 SNPSP 促进 CT L 细胞的活性较 NP-
SP 增强。硫酸酯化螺旋藻多糖除了对肿瘤细胞具
110 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 2 期　
有直接的细胞毒作用外 ,还能通过调节机体免疫功
能发挥抗肿瘤作用 ,克服了化疗药物在抗肿瘤的同
时对机体免疫功能的影响 ,具有一定的开发前景。
参考文献
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Antitumor and Immunomodulation Effect of Polysaccharide from Spir-
ulina Platensis and Its Sulfated Derivative
SHENG Yu-qing1 ,YIN Hong-ping2* , LI H ai-tao1 ,XU Shi-jun1
(1. School of Pharmacy , Nanj ing Universi ty o f Chinese Medicine , Nanj ing 210046 ,China;2. School
o f Li f e Science and Technology , China Pharmaceut ical Universi ty , Nanj ing 210009 ,China)
Abstract　T o study the antitumor and immunomodulation effect of po lysaccharide f rom Spirulina Platen-
sis(NPSP) and its sulfated derivative (SNPSP), M TT colo rime tric analysis w as used to evaluate ant itu-
mor activi ty against human tumor cells in v i tro , prolife rat ion-enhancing activity on spleen lymphocy tes
of normal mice and their effects on NK and CTL cells of tumo r-bea ring mice. The antitumor effect in v i-
vo was determined on the S180-bearing mice. NPSP rarely had cy to tox ic act ivity tow ards human tumor
cells in v it ro whi le SNPS P had potent cy totoxic activity tow ards human tumo r cells wi th 50%inhibitory
ratio on human SMMC-7721 hepatoma. NPSP(50 mg /kg) had no inhibitory ef fect on S180 in mice w hi le
SN PSP(50 mg /kg) had the inhibitory ratio of 35. 42%. NPSP could enhance splenocy tes pro liferation ,
but not the splenocytes induced by ConA o r LPS. SNPSP had st ronger ef fect on the proliferation o f
splenocytes than NPSP , additionally SNPSP could enhance ConA or LPS-induced splenocy tes prolife ra-
tion. Although both NPSP and SNPSP could increase the activi ties o f NK and CT L cells in tumo r-bear-
ing mice , SN PSP had mo re potent ef fect on the activity of CT L cells than N PSP. SNPSP had bet ter anti-
tumo r activit ies in vi tro and in vivo , had st ronger effect on the proliferat ion of spleen lymphocy tes and
had mo re potent effect on the activi ty of CT L cells than N PSP.
Key words　Polysaccharide f rom Spirulina Platensis , Sulfated deriv ative , A ntitumor activi ty , Cellular
immune response
信　　息
2006-15　国内首次合成不饱和甘露碳糖苷　我国科研人员首次合成了不饱和甘露碳糖苷。该成果目前已通过成果
鉴定 ,有关专家认为 , 该成果对天然产物糖类似物创新药物研究具有重要价值。研究人员在国内外首次合成醌类及烯丙基
类 15 个新型碳糖苷化合物。根据国家新药筛选中心的生物活性测试结果 ,发现其中烯丙基类碳糖苷化合物具有良好的体
外免疫调节作用。
111盛玉青等:螺旋藻多糖硫酸酯化修饰前后抗肿瘤及免疫活性的研究