全 文 ：收稿日期:2009-12-03;　修订日期:2010-07-06
基金项目:教育部春晖计划(No.Z2005-2-45003)
作者简介:陈　薇(1975-),女(汉族),四川成都人 ,现任桂林医学院附属
医院副主任药师 ,硕士学位 ,主要从事临床药学研究工作.
＊通讯作者简介:段小群(1972-), 男(汉族),湖南郴州人 , 现任桂林医学
院副教授 ,博士学位 ,主要从事药理学研究工作.
罗汉果甜苷对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响
陈　薇 1 ,段小群 2＊ ,刘永明2 ,卢　曦 2
(1.桂林医学院附属医院 ,广西 桂林　541001;　2.桂林医学院 ,广西 桂林　541004)
摘要:目的 探讨罗汉果甜苷对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响 。方法 以人肝 L-02细胞作为研究对象 , 用四环素建立
肝细胞脂肪变性模型。将实验分为诱导组 、继续诱导组 、脱离诱导组 , 用油红 O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成
情况 , 并测定细胞内甘油三酯(TG)含量的变化。结果 罗汉果甜苷(20 ～ 80μg· ml-1)可明显降低细胞内 TG值 , 并呈剂
量依赖性。结论 罗汉果甜苷通过减少细胞内 TG的生成从而阻止肝细胞脂肪变性。
关键词:罗汉果甜苷;　甘油三酯
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.12.024
中图分类号:R962　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)12-3092-02
EffectsofMogrosides(Mog)onHepatocyteSteatosisInducedbyTetracyclineinvitro
CHENWei1 ,DUANXiao-qun2 ,LIUYong-ming2 ,LUXi2
(1.TheAfiliatedHospitalofGuilinMedicalColege, Guilin541001, China;2.DepartmentofPharmacology,
GuilinMedicalColege, Guilin541004 , China)
Abstract:ObjectiveTostudytheefectsofmogrosides(Mog)onhepatocytesteatosisinducedbytetracyclineinvitro.Methods
SteatosismodelofhepatoeyteswasestablishedbyaddingtetracyclinetothegrowingL-02celstrain.Lipiddropletsinthehepa-
tocyteswereobservedbyoilredstainingandthecontentsoftriglyceride(TG)inhepatocyteswasmeasuredwithanalysiskit.Re-
sultsMog(20 ～ 80μg.ml-1)decreasedthelevelofTGinhepatocytesinaconcentrationdependentmanner.ConclusionThese
resultssuggestthatMogcanpreventhepatocytefattydegenerationviainhibitingTGproductionofhepatocyte.
Keywords:Mogrosides(Mog), Tetracycline, TG
　　非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease, NAFLD)
是一种无过量饮酒史(每周饮酒折合酒精量小于 40 g)、以肝实
质细胞脂肪变性和脂肪储积为特征的临床病理综合征 [ 1] 。随着
人们物质生活水平的提高 ,生活方式和饮食结构发生了显著的改
变 , 再加上科学技术的飞跃发展 , 发现和被检测到的 NAFLD患者
逐年升高。由于 NAFLD是肝硬化 、肝癌的重要病因 [ 2 , 3] , 所以对
其进行深入地研究具有十分重要的意义。
广西特产罗汉果(Luohanguo)系葫芦科植物的果实。主要分
布在广西 ,在民间的药用历史已有三百多年 , 其性凉味甘 、无毒 ,
有润肺止咳 、凉血 、润肠通便 、抗炎镇痛的功效 [ 4] 。本实验研究
了罗汉果甜苷对四环素诱导的肝细胞脂肪变性的影响 ,为进一步
开发罗汉果保健产品提供理论依据。
1　材料与仪器
1.1　仪器 CO
2
培养箱(美国 FormascientificInc公司),倒置显微
镜(日本 Olympus公司), 酶联免疫检测仪 Model-450(美国 Bio
-Rad公司), 旋转蒸发器(RE-52型 , 上海亚荣仪器厂生产)。
1.2　试剂 罗汉果甜苷 , 由莱茵生物股份有限公司提供;1640培
养液购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;血清购自
海克隆生物化学制品(北京)有限公司;四环素(实验室用)购自
生工生物工程(上海)有限公司;油红 O购自美国 Sinma公司;四
甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒购自美国 Amersco公司;甘油三酯
(TG)测定试剂盒购自浙江东欧生物工程有限公司。
2　方法
2.1　肝细胞培养 人正常肝细胞株 L-02, 购自中国科学院上海
生命科学研究所 ,用含 10%胎牛血清 1640培养基传代培养。
2.2　四环素浓度的确定 将处于对数生长期的 L-02细胞调整
浓度为 5×104个 /ml培养于 96孔板中 , 分别加入不同浓度的四
环素(见表 1), 用 MTT[ 5]比色法测定细胞增殖情况(以吸收度
OD值表示)。结合细胞形态观察 , 选择对细胞活性影响小 ,不会
导致细胞裂解死亡的浓度作为诱导细胞形成脂肪变性的最佳浓
度。
2.3　罗汉果甜苷浓度的确定 将处于对数生长期的 L-02细胞
调整浓度为 5×104个 /ml培养于 96孔板中 ,分别加入不同浓度
的罗汉果甜苷(见表 2),用 MTT比色法测定细胞增殖情况(以吸
收度 OD值表示)。结合细胞形态观察 , 将对细胞活性影响小 , 不
会导致细胞裂解死亡的浓度定为最高给药浓度。
2.4　肝细胞脂变模型的建立 将处于对数生长期的 L-02细胞
分为两组 , 即:对照组 、诱导组 , 使每组细胞浓度均为 5 ×104个 /
ml。对照组:用正常培养基培养;诱导组:每毫升正常培养基中加
四环素 12μg培养。在各实验条件下培养 48h,收集细胞冻融液 ,
严格按照 TG试剂盒规定操作 , 测定其中 TG的含量。制备油红
O染色 [ 6]标本 ,观察细胞脂滴数的变化。
2.5　罗汉果甜苷对肝细胞脂变模型的影响 将处于对数生长期
的 L-02细胞分为 3组 ,使每组细胞浓度均为 5×104个 /ml。诱
导组:损伤同时加药治疗 48 h;继续诱导组:先损伤 48 h, 再在损
伤的同时加药治疗 48 h;脱离诱导组:先损伤 48 h, 再加药治疗
48 h。每组内均设有空白对照 、模型 、阳性对照及高 、中 、低 3个
剂量组 ,在各实验条件下收集细胞冻融液 , 严格按照 TG试剂盒
规定操作 , 测定其中 TG的含量。用 100 μg· ml-1烟酸作为阳性
对照药 。
2.6　数据处理 所有数据均以 x±s表示 , 采用方差分析进行统
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计处理。
3　结果
3.1　四环素作用浓度的确定 观察细胞形态发现 , 正常肝细胞为
多边形 , 胞膜完整界限清楚 , 细胞浆丰富。四环素 15 μg· ml-1组
细胞数量与正常细胞相比基本不变 ,低倍镜下可见部分细胞形态
有少许变化 , 但漂浮坏死细胞较少;30 μg· ml-1组细胞增大变
圆 , 数量有减少;120μg· ml-1组细胞多呈圆形或椭圆形 , 数量大
大减少;细胞膜不完整 ,有破损(图 1)。 MTT实验检测结果提示:
四环素浓度超过 30 μg· ml-1时吸收度(OD值)下降明显 , 对细
胞增殖影响力较大(表 1),参考相关根据文献 [ 7]报道 ,选择 12 μg
· ml-1作为四环素造模剂量。
图 1　不同浓度四环素对肝细胞形态的影响
表 1　MTT法检测四环素对肝细胞生长活性的影响( x±s)
组别 剂量 C/μg· ml-1 OD值 细胞活性变化(%)
空白对照 - 1.098±0.068 100.0
四环素 7.5 0.990±0.023 90.2
15 0.963±0.016 87.7
30 0.820±0.034 74.7
60 0.763±0.037 69.5
120 0.602±0.058 54.8
　　n=5
3.2　罗汉果甜苷的浓度确定 实验结果(表 2)表明 , 罗汉果甜苷
对肝细胞毒性较低 , 当浓度小于 80 μg· ml-1对正常肝细胞的生
长基本无影响 , 因此结合预试结果 , 将罗汉果甜苷的实验浓度定
为 20, 40, 80 μg· ml-1。
3.3　油红 O染色光学显微镜观察 正常 L-02细胞 , 细胞内仅
可见点状散在红色脂肪滴(图 2a),经 12μg· ml-1四环素离体诱
导 48 h后 , 细胞内出现大量聚集成颗粒状的红色脂肪滴(图
2b)。而正常 L-02细胞经 80 μg· ml-1罗汉果甜苷与 12 μg·
ml-1四环素共同培养 48 h后 , 细胞内脂滴与模型细胞相比有所
减少(图 2c)。
表 2　MTT法检测罗汉果甜苷对肝细胞生长活性的影响( x±s)
组别 剂量 C/μg· ml-1 OD值 细胞活性变化(%)
空白对照 - 1.098±0.068 100.0
罗汉果甜苷 20 1.092±0.024 99.4
40 1.047±0.047 95.3
80 1.048±0.084 95.5
160 1.016±0.084 92.5
320 0.561±0.054 51.1
　　n=5
图 2　罗汉果甜苷对肝细胞脂变模型的影响
3.4　肝细胞内 TG含量的测定 实验结果(表 3)表明 , 各组加四
环素的模型细胞比不加任何药物的正常对照细胞胞浆内的 TG
值明显升高 , 加入烟酸的阳性对照细胞与模型细胞相比细胞内
TG含量明显降低。
各组给予罗汉果甜苷处理后 ,细胞内 TG值均出现了明显的
降低 , 且随着给药浓度的增高 , 细胞内 TG值持续下降 , 继续诱导
组细胞内 TG值与模型细胞相比 ,差异明显(P<0.01), 脱离诱导
组细胞内 TG值降低最为明显 , 说明只要停止向培养液中加造模
药 , 细胞内累积的甘油三酯可以自行降低 , 这与治疗脂肪肝首先
在于去除病因的理论是一致的。
表 3　罗汉果甜苷对脂变细胞内 TG含量的影响( x±s) mmol· L-1
组别
TG
空白 模型 烟酸
100μg.ml-1
罗汉果甜苷
20μg·ml-1 40μg· ml-1 80μg· ml-1
诱导 2.27±0.56＊ 2.96±0.40 2.51±0.27＊ 3.18±0.31 2.36±0.75＊ 1.92±0.36＊＊
继续诱导 2.66±0.23＊＊ 3.61±0.22 2.65±0.33＊＊ 3.21±0.20＊ 2.56±0.30＊＊ 2.72±0.12＊＊
脱离诱导 2.37±0.33＊ 2.79±0.20 2.45±0.43 2.90±0.20 2.24±0.47＊＊ 2.58±0.35＊
　　与模型组相比 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=5
4　讨论
本文采用四环素制备肝细胞脂变模型 ,四环素属于抗生素类
化学药物 , 该药脂溶性较好 ,具有肝毒性 ,能很好的渗透到大多数
组织和体液中 , 且较易进入细胞内 [ 8] 。四环素引起脂肪肝的机制
是抑制体内蛋白质的合成 , 特别是肝的载脂蛋白的合成 , 使肝内
VLDL分泌发生障碍 , 从而不能使肝内 TG运出肝细胞外 , 脂质以
脂滴的形式聚于细胞内置网和高尔基复合体内。脂质及 TG含
量增加 , 肝脏脂质过氧化反应也增强 ,肝组织学检查显示 , 肝细胞
产生明显的小泡性脂肪变性 ,符合非酒精性脂肪肝病理学研究结
果 [ 9] 。其抑制蛋白质作用机制可能通过抑制肝细胞线粒体 DNA
复制或干扰 DNA转录 , 使 mRNA合成减少 , 从而使 mRNA翻译
成载脂蛋白的量减少。通过抑制肝内 TG的转运及肝细胞线粒
体对脂肪酸的 β -氧化 , 从而诱发肝细胞脂肪变性。
本实验将罗汉果甜苷作用于离体细胞模型 , 共分为 3组:诱
导组 , 损伤同时加药治疗 2 d;继续诱导组 , 先损伤 2 d再在损伤
同时加药治疗 2 d;脱离诱导组 , 先损伤 2天再加药治疗 2 d。诱
导组可以考察药物对脂肪肝的预防与减轻作用 , 继续诱导组和脱
离诱导组可以考察有化学损伤因素存在或曾经服用肝毒性药物
造成肝损害后 ,药物对肝细胞的治疗与保护作用。由脱离诱导组
实验结果可知 , 一些高脂血症的患者不用马上服用降脂药 , 首先
应该停止使用或接触具有肝毒性的化学物质 , 再通过中药保健品
或单纯饮食疗法即可获得痊愈。
目前对 NAFLD的治疗临床上主要采用西药治疗 , 主要分为:
HMG-COA还原酶抑制剂 、胆汁酸螯合剂 、苯氧芳酸类 、烟酸类
等。西药对于高脂血症患者具有起效快 、作用强的特点 , 但这些
药物对人体均有不同程度的毒副作用 , 长期服用经常会出现不良
反应 ,而采用传统中药治疗脂肪肝 ,能有效的防止并发症 ,减少由
药物引起的不良反应 , 研究和开发降脂中药有良好的前景和重要
的意义。
罗汉果甜苷对大鼠慢性肝损伤有明显的保护作用 [ 10] , 其对
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.12 时珍国医国药 2010年第 21卷第 12期
脂变肝细胞的作用尚无文献报道。本实验研究表明 ,罗汉果甜苷
具有降低脂变细胞内甘油三酯的作用 ,且存在一定的量效关系 ,
为进一步开发罗汉果提供了有力的药理学依据。
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收稿日期:2009-12-18;　修订日期:2010-07-29
基金项目:中国医学基金会新药发展基金(No.20061108)
作者简介:吴　凌(1985-),男(汉族),福建福州人 ,现为吉林大学生命科
学学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事生物制药研究工作.
＊通讯作者简介:刘晓宇(1967-), 男(汉族),吉林吉安人 , 现任吉林大学
珠海学院副教授 ,学士学位 ,主要从事生物制药研究工作.
白囊耙齿菌多糖提取条件优化及其生物活性
吴　凌1 ,张喜光 1 ,石陶圣 1 ,尹秀菊1 ,逯家辉 1 ,刘晓宇2＊
(1.吉林大学生命科学学院 ,吉林 长春　130012;　2.吉林大学珠海学院 ,广东 珠海　519041)
摘要:目的 优化白囊耙齿菌多糖的提取工艺及多糖生物活性研究。方法 以超声时间 、超声功率和水料比(V/W)为影
响因素 , 应用中心组合试验方法进行实验设计 , 以多糖得率为响应值 ,进行响应面分析。利用 MTT法检测多糖对大鼠肾
系膜细胞增殖的影响。结果 多糖提取的最佳条件为:超声时间 184 s, 超声功率 410W, 水料比 48∶1;抑制肾系膜细胞的
增殖的 IC50为 16.21μg· ml-1。结论 响应面法可用于白囊耙齿菌多糖的提取 ,其多糖可显著抑制肾系膜细胞的增殖。
关键词:响应面分析;　多糖;　超声波提取
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.12.025
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)12-3094-03
OptimizationofExtractionforIrpexlacteusPolysaccharidesanditsBioactivity
WULing1 ,ZHANGXi-guang1 ,SHITao-sheng1 ,YINXiu-ju1 ,LUJia-hui1 ,LIUXiao-yu2＊
(1.ColegeofLifeScience, JilinUniversity, ChangChun130012, China;2.ChemicalandPhamacologicalDe-
partment, ZhuhaiSchool, JilinUniversity, Zhuhai519041, China)
Abstract:ObjectiveTooptimizetheextractionconditionsofpolysaccharidesfromIrpexlacteusFr.andtoinvestigateitsbioac-
tivity.MethodsExtractiontime, ultrasonicpowerandthesolvent/solidratiowereselectedascausalfactors.Experimentaldesign
wasdevelopedbycentralcompositedesignmethod.Theyieldofpolysaccharideswasusedastheresponsivevalues, andresponse
surfacemethodwasemployedtoanalyzetheresultsofexperiments.MTTassaywasusedtostudytheefectofpolysaccharideson
ratglomerularmesangialcells.ResultsTheoptimumprocessconditionsforpolysaccharideswere:extractiontime184 s, ultrason-
icpower410Wandthesolvent/solidratio48:1 (V/W).Thepolysaccharidesamounttoinhibittheproliferationofglomerular
mesangialcelwas16.21μg· ml-1.ConclusionThismethodcanbeappliedtotheextractionofpolysaccharidesandthepoly-
saccharidescaninhibittheproliferationofratglomerularmesangialcels.
Keywords:Responsesurfaceanalysis;Polysaccharides;Ultrasonicextraction
　　白囊耙齿菌 IrpexlacteusFr.隶属于非褶菌目多孔菌科耙齿
菌属 IrpexFr., 其多糖具有抗菌 、消炎 、利尿作用 [ 1] 。真菌多糖具
有抗肿瘤 、抗病毒 、抗衰老 、抗溃疡与抗炎症 , 健胃保肝等作
用 [ 2] 。真菌多糖的研究具有十分重要的意义。
响应面分析法(ResponseSurfaceAnalysis, RSA)[ 3～ 5]是一种
集统计学 、数学建模和计算机科学为一体 , 用于工艺条件优化的
有效方法。响应面分析法的最大优点是在合理的实验设计下 ,以
最少的实验次数 ,获取最大限度的实验信息 ,其采用多元二次回
归的方法作为函数估计的工具 ,研究各因素及它们间的交互作用
对响应值的影响 ,精确的表述因素和考察指标之间的关系。
系膜细胞作为肾脏的固有细胞 ,是肾小球区最重要的产生细
胞外基质的细胞。系膜细胞增生以及产生细胞外基质增加是许
多因素导致肾脏纤维化形成的前奏 [ 6] 。抑制系膜细胞的增生即
能预防多种肾疾病的发生。
本实验旨在研究多糖超声波提取过程中各因素的作用 ,并通
过中心组合试验设计方法 [ 7] , 确定出最优提取工艺参数。并且
通过观察多糖对大鼠肾系膜细胞增殖的影响 ,寻找高效低毒治疗
肾炎药物 , 为白囊耙齿菌的研究开发及中药现代化提供理论依
据。
1　仪器与材料
1.1　材料 大鼠肾系膜细胞(HBZT-1),购自购自武汉大学中国
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