全 文 ：书收稿日期:2013-03-06
作者简介:徐珊珊(1987-) ，女(汉族) ，辽宁瓦房店人，硕士研究生，E-mail minatsui. 33@ gmail. com;* 通讯作者:
尹然(1979-) ，女(汉族) ，辽宁锦州人，副教授，博士，主要从事药物分析学研究，Tel． 024-23986296，E-mail yinran@
ymail. com。
文章编号:1006-2858(2014)02-0138-05
蓼大青叶醇提物体内外抗氧化活性的研究
徐珊珊，吴小雪，张晨宁，李 清，毕开顺，尹 然*
(沈阳药科大学 中药质量控制技术国家地方联合工程实验室，辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 采用体内外试验方法研究蓼大青叶抗氧化活性。方法 通过考察蓼大青叶体积分数
95%甲醇提取液清除二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)活性以及对 H2O2 诱导小鼠红细胞氧化溶
血的影响，评价其体外抗氧化活性;通过研究蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取液对 CCl4 所致急性
肝损伤小鼠血浆中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、丙二醛(MDA)水平及肝匀浆液中谷胱甘肽
过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响，探讨蓼大青叶的体内抗氧化活性。结果 蓼大青叶体积分数
95%甲醇提取液质量浓度在 25 ～ 1 000 mg·L －1内可有效清除 DPPH·，IC50为 103. 4 mg·L
－1;蓼大
青叶体积分数 95%甲醇提取液质量浓度在 25 ～ 100 mg·L －1内具有 H2O2 诱导红细胞氧化溶血抑
制作用;剂量范围在 3 ～ 12 g·kg －1内能减少小鼠血浆中 MDA 水平，增加 T-SOD 活性，提高肝匀浆
液 GSH-Px 活性。结论 蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取物具有一定的体内外抗氧化活性。
关键词:蓼大青叶;甲醇提取物;抗氧化;体内;体外
中图分类号:Ｒ 96 文献标志码:A
中药蓼大青叶为蓼科植物蓼蓝(Polygonum
tinctorium Ait．)的干燥茎叶，味苦，性寒，归心、胃
经，具有清热解毒、凉血消斑的功效，主要用于温
病发热、发斑发疹、肺热喘咳、喉痹、痄腮、丹毒和
痈肿［1］等症。蓼大青叶所含化学成分主要有靛
蓝、靛玉红、N-苯基-2-萘胺、β-谷甾醇和虫漆蜡醇
等，鲜叶含靛青苷［2］，近代药理研究表明其具有
抗病毒、抗菌、解热、抗炎［3］和抗敏等作用［4 － 5］。
衰老的自由基学说自 1956 年提出以后，人们
逐步认识到人体的衰老甚至许多疾病都与体内氧
化过程中产生的自由基有关［6］。过剩的自由基
可作用于细胞、组织等，若不及时消除，可能诱发
多种疾病。因此，适当补充外源性抗氧化物对保
持人体健康尤为重要，而中草药便是天然抗氧化
物来源的宝库。随着人们对抗氧化的重视，对中
药进行抗氧化活性研究显示出重要意义。
蓼大青叶收载于《中华人民共和国药典》
2010 版，其指标性成分为靛蓝。有研究报道，靛
蓝混悬液灌胃对四氯化碳引起的动物肝损伤有明
显的保护作用［7］;Kyung-su Kim 等研究表明靛蓝
植物水提物具有一定的体外抗氧化活性［8］。目
前关于蓼大青叶的类似品大青叶已有少数文献报
道了体外抗氧化活性［9 － 10］，而关于蓼大青叶的抗
氧化等药理活性研究则少有报道。因此本课题组
在前期对蓼大青叶进行的靛蓝含量测定之后，对
其抗氧化活性进行了初步探索。作者通过经典的
DPPH·清除实验和抑制 H2O2 诱导红细胞溶血实
验，以及保护 CCl4 诱导的小鼠急性肝损伤实验，
从体内、体外两方面对蓼大青叶体积分数 95%甲
醇提取物的抗氧化活性进行了评价，以期为其进
一步开发利用提供参考。
1 仪器与材料
MK3 酶标仪(Labsystem，Helsink，芬兰) ，
TGL －16M 台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心
机仪器有限公司) ，FSH-2 高速组织匀浆机(金坛
天竟实验仪器厂) ，安捷伦 1100 高效液相色谱仪、
DAD 检测器(美国安捷伦公司)。
蓼大青叶，产地安徽，由沈阳药科大学中药资
源学教研室路金才教授鉴定为 Polygoni Tinctorii
Folium，经粉碎，过 3 号筛，密闭保存。二苯代苦
味酰基自由基(DPPH·，Sigma Corp．，Mo，USA) ，
MDA 检测试剂盒、SOD 检测试剂盒和 GSH-Px
检测试剂盒(南京建成生物制研究所) ，联苯双酯
滴丸(浙江医药股份有限公司) ，纯净水(杭州娃
哈哈集团有限公司) ，花生油(金龙鱼集团有限公
第 31 卷 第 2 期
2 0 1 4 年 2 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 31 No. 2
Feb． 2014 p. 138
司) ，其他所用试剂均为市售国产分析纯试剂。
昆明小鼠 60 只，SPF 级，体质量(25 ± 2)g，
雌雄各半，由沈阳药科大学实验动物中心提供，合
格证号 SCXK(辽)2010-0001。
2 方法
2. 1 蓼大青叶体外抗氧化活性的测定
2. 1. 1 蓼大青叶提取液的制备
称取蓼大青叶粗粉 50 mg，加 入 甲 醇
250 mL，加热回流提取 1. 5 h，滤过，将滤液减压
浓缩，转移至 50 mL 量瓶中，用体积分数 95%甲
醇溶液定容，摇匀，制得生药含量约为 1. 0 g·L －1
的蓼大青叶提取液。
2. 1. 2 对 DPPH·的清除能力的测定
供试溶液的制备:取蓼大青叶提取液适量，加
入体积分数 95%甲醇溶液逐级稀释，制成质量浓
度分别为 25、50、100、200、500 和 1 000 mg·L －1的
系列供试溶液。
阳性对照溶液的制备:称取维生素 C 10 mg，
置于 10 mL 量瓶中，用体积分数 95%的甲醇溶液
溶解并稀释至刻度，摇匀，得维生素 C 储备液。
将该储备液用体积分数 95%的甲醇溶液逐级稀
释成质量浓度分别为 10、25、50、75、100、200、500
和1 000 mg·L －1的系列维生素 C 甲醇溶液。
DPPH·溶液的配制:取 DPPH·粉末适量，精
密称定。用体积分数 95%的甲醇溶液溶解，配置
成 0. 2 mmol·L －1 DPPH·甲醇溶液，避光密闭冷
藏保存。
取系列供试溶液，于 96 孔板中按表 1 加样，
置酶标仪中，于波长 517 nm 下每 5 min测量一次
直至吸光度不变。取系列维生素 C 阳性对照溶
液，按上述方法加样，避光放置 30 min 后于波长
517 nm 下测量吸光度。按下述公式计算清除率:
DPPH·清除率(%)=
A － A0
A1
× 100%。
Table 1 Sample adding method of the DPPH·rate
表 1 DPPH·的加样方法
Absorbance Sample V∶ V
A DPPH·solution-text solution 4∶ 1
A0 95% Methanol-text solution 4∶ 1
A1 DPPH·solution-95% methanol 4∶ 1
2. 1. 3 抗 H2O2 诱导红细胞溶血能力的测定
供试溶液的制备:取蓼大青叶提取液适量，用
生理盐水逐级稀释成质量浓度分别为 100、50、
25 mg·L －1的高、中、低 3种质量浓度的供试溶液。
阳性对照溶液的制备:取维生素 C 约 10 mg，
精密称定，置于 100 mL 量瓶中，用生理盐水溶解
并稀释至刻度，制得质量浓度为 100 mg·L －1的维
生素 C 生理盐水溶液。
红细胞悬浮液的制备:取全血 1 mL，加等渗
盐水 3 mL，充分摇匀离心沉淀，弃去上清液，再加
入生理盐水 3 mL，按上述方法反复洗涤 3 次。
100 mL 生理盐水加 0. 5 mL 红细胞即得体积分数
为 0. 5%红细胞悬浮液。
小鼠摘眼球取血，制成体积分数 0. 5%的红
细胞悬浮液，分别设立空白对照组、阳性对照组、
H2O2 诱导模型组及高、中、低剂量组。取红细胞
悬液 1 mL，加入不同质量浓度的蓼大青叶提取液
0. 2 mL，最后加 50 mol·L －1 H2O2 0. 2 mL，混匀。
阳性对照加入维生素 C 生理盐水溶液代替蓼大
青叶提取液，空白对照组则以生理盐水代替。
37 ℃ 温 浴 1 h，加 生 理 盐 水 稀 释 5 倍，
3 000 r·min －1离心 5 min，取上清液，于 96 孔板中
加样，置酶标仪中于波长 415 nm 下测定吸光度。
2. 2 蓼大青叶体内抗氧化活性的测定
2. 2. 1 灌胃液的制备
取蓼大青叶粗粉适量，加入 5 倍体积的体积
分数 95%甲醇溶液，加热回流 1. 5 h，过滤，将滤
液减压蒸发至干，残渣混悬于体积分数 10%吐温
80 水溶液中，制成质量浓度为 750. 0、375. 0、
187. 5 g·L －1的高、中、低 3 种质量浓度供试灌胃
液;将联苯双酯滴丸混悬于体积分数 10%吐温 80
水溶液中，制得质量浓度为 0. 55 g·L －1的联苯双
酯阳性对照溶液。
2. 2. 2 小鼠肝损伤模型制备
60 只小鼠分为 6 组，每组 10 只，雌雄各半，
分别为空白组、模型组、阳性药物组、高剂量组、中
剂量组和低剂量组。各组小鼠灌胃前禁食 12 h。
空白组、模型组每天灌胃体积分数 10%吐温 80
水溶液，阳性药物组每天灌胃联苯双酯溶液，高、中、
低剂量组分别给予高、中、低 3种质量浓度的供试灌
胃液。灌胃剂量 16 mL·kg －1，每天 1次，连续 15 d，
于第 15天灌胃给药后，除空白组外，腹腔注射体积
分数 0. 1%的 CCl4 花生油溶液 10 mL·kg
－1。
2. 2. 3 小鼠血浆 SOD 活性及 MDA 水平的测定
于腹腔注射 CCl4 花生油溶液 24 h 后，将小
鼠摘眼球取血，置于涂过肝素的干燥离心管中，离
心 10 min，取血浆，按试剂盒操作，测定 SOD 活性
931第 2 期 徐珊珊等:蓼大青叶醇提物体内外抗氧化活性的研究
及 MDA 水平。
2. 2. 4 小鼠组织匀浆液 GSH-Px 活性的测定
将小鼠处死，取肝脏，在冰冷的生理盐水中漂
洗至无血液，用滤纸拭干，用眼科小剪剪碎组织，
称质量。放入烧杯中，加入相当于组织质量 9 倍
的冷生理盐水，用组织捣碎机 15 000 r·min －1上
下研磨，最终制成质量分数为 10%的组织匀浆，
2 000 r·min －1低温离心 15 min，取上清液，按试剂
盒测定 GSH-Px 活性。
2. 3 蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取物中靛蓝
的 HPLC含量测定
2. 3. 1 溶液的制备
20 g·L －1水合氯醛的二氯甲烷溶液的制备:
将水合氯醛置干燥器中干燥 24 h 以上后使用。
称取水合氯醛 2. 0 g，加入二氯甲烷100 mL，充分溶
解至溶液澄清，加入无水硫酸钠脱水，滤过，备用。
对照溶液的制备:取靛蓝对照品适量，精密称
定。将其溶解于 DMF 中，制得质量浓度为
28. 0 mg·L －1靛蓝对照溶液，于 4 ℃避光保存。
供试溶液的制备:称取蓼大青叶粗粉 0. 1 g，
加入体积分数 95%的甲醇 500 mL，加热回流提
取1. 5 h，滤过。将滤液减压蒸发至干，残渣加入
20 g·L －1水合氯醛的二氯甲烷溶液 200 mL，超声
提取 1. 5 h，冷却，滤过。将滤液减压浓缩，转移至
10 mL 量瓶中，以 20 g·L －1水合氯醛的二氯甲烷
溶液稀释至刻度，摇匀，用 0. 45 μm 微孔膜滤过，
取续滤液备用。
2. 3. 2 色谱条件
色谱柱:Waters Spherisorb ODS2 柱(250 mm ×
4. 0 mm，5 μm) ;流动相:乙腈(A)-水(B) ，梯度
洗脱;洗脱程序:0 ～ 10 min 60% ～ 70% A;检测
波长:285 nm;柱温:35 ℃;流速:1. 0 mL·min －1;
进样量:4. 0 μL。
3 结果
3. 1 蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取物对
DPPH·的清除率
考察各质量浓度蓼大青叶供试溶液对 DPPH·
的清除率随时间的变化，结果见图 1。结果表明，
不同质量浓度的样品对 DPPH·的清除率随时间
变化逐渐升高，且在 40 min 均趋于平衡，因此反
应时间选为 40 min。以维生素 C 甲醇溶液质量
浓度和蓼大青叶供试溶液质量浓度对 DPPH·最
终清除率作图，结果见图 2。结果表明，在一定质
量浓度范围内，维生素 C 甲醇溶液和蓼大青叶
95%甲醇提取液对 DPPH·清除率逐渐增大，与其
质量浓度呈近似线性关系，通过回归分析，计算求
得维生素 C 和蓼大青叶 95%甲醇提取液的 IC50
值分别为 53. 26 和 103. 4 mg·L －1。
+—1 000 mg·L －1;－—500 mg·L －1;◆—200 mg·L －1;
■—100 mg·L －1;▲—50 mg·L －1;×—25 mg·L －1
Fig. 1 The change of scavenging rate of DPPH·of 95%
methanol extraction of the Polygoni Tinctorii Folium over
time
图 1 不同质量浓度的蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取
液对 DPPH·的清除率随时间的变化
◆—95% Methanol extracting solution of the Polygoni Tinc-
torii Folium;■—VC solution
Fig. 2 The change of scavening rate of DPPH·at same
reaction time over different concentration of 95% metha-
nol extraction of the Polygoni Tinctorii Folium and VC
methanol solution
图 2 相同反应时间下不同质量浓度的蓼大青叶体积分
数 95%甲醇提取液和 VC甲醇溶液对 DPPH·的清除率
3. 2 抗 H2O2 诱导小鼠红细胞氧化溶血活性
蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取物高、中、
低 3 个剂量对体外 H2O2 诱导小鼠红细胞氧化溶
血的影响结果见表 2。数据统计结果显示，与模
型组比较，药物组 P 值均小于 0. 01，即质量浓度
在 25 ～ 100 mg·L －1内，蓼大青叶体积分数 95%甲
醇提取液对 H2O2 诱导小鼠红细胞溶血具有显著
抑制作用，其中高剂量组的抑制效果与 VC 相比，
P值大于 0. 05，无显著性差异。
041 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 31 卷
Table 2 Influence on the oxygen hemolysis of red blood cells of mice
表 2 抗 H2O2 诱导小鼠红细胞氧化溶血活性
Group ρ /(mg·L －1) A415 Hemolysis ratio / % Inhibition ratio / %
Blank — 0. 220 ± 0. 049 39. 14 —
Model — 0. 563 ± 0. 040 100. 0 —
VC 100 0. 229 ± 0. 027* 40. 66 59. 34
95% Methanol extracting 100 0. 293 ± 0. 030* 52. 07 47. 93
solution of the 50 0. 366 ± 0. 056* 65. 11 34. 89
Polygoni Tinctorii Folium 25 0. 413 ± 0. 043* 73. 40 26. 60
Note:* —Compared with model，P ＜ 0. 01
3. 3 对小鼠血浆中 SOD 活性、MDA 的生成以
及组织匀浆液中 GSH-Px活性的影响
蓼大青叶高、中、低剂量供试灌胃液对小鼠血
浆中 SOD 活力、MDA 的生成量以及组织匀浆液
中 GSH-Px 活力的影响见表 3。由表 3 可知，高、
中剂量组能够显著提高小鼠血浆中 SOD 活性，降
低 MDA 水平，其中高剂量组可显著提高小鼠肝
匀浆中 GSH-Px 的活性，对小鼠血浆中 MDA 水
平的影响与联苯双酯比较，P 值大于 0. 05，无显
著性差异，对小鼠血浆中 SOD 水平的影响与联苯
双酯比较，P值小于 0. 05，效果略佳。
Table 3 Values of SOD，MAD in the plasma and GSH-Px in the liver homogenate of mice
表 3 小鼠血浆中 SOD的活性、MDA的生成以及组织匀浆液中 GSH-Px的活性
Group Dose /(g·kg －1) T-SOD /(U·mL －1) c(MDA) (mol·L －1) GSH-Px /(U·mL －1)
Blank — 126． 6 ± 16． 6 8． 50 ± 1． 91 1176 ± 85
Model — 85． 5 ± 18． 7 14． 58 ± 1． 34 405． 9 ± 30． 3
Bifendate 8． 8 × 10 －4 112． 9 ± 27． 1＊＊ 10． 53 ± 1． 14＊＊ 859 ± 39＊＊
High dose 1． 2 119． 7 ± 17． 9＊＊ 11． 39 ± 1． 65＊＊ 682． 1 ± 39． 2＊＊
Middle dose 0． 60 109． 7 ± 18． 2＊＊ 12． 34 ± 1． 80＊＊ 466． 3 ± 56． 0*
Low dose 0． 30 92． 0 ± 14． 7 13． 39 ± 0． 91 436． 2 ± 43． 6
Notes:Compared with model，* —P ＜ 0. 05，＊＊—P ＜ 0. 01
3. 4 蓼大青叶 95% 甲醇提取物中的靛蓝含量
采用外标法计算靛蓝的含量，结果表明，蓼大
青叶体积分数 95% 甲醇提取物中含有靛蓝
0. 4%。
4 讨论
a．本实验在体外抗氧化研究阶段以 DPPH·
清除率为指标，对蓼大青叶的水煎液、体积分数
50%甲醇提取液、体积分数 75%甲醇提取液和体
积分数 95%甲醇提取液的抗氧化活性进行了初
步筛选比较，发现体积分数 95%甲醇提取液的抗
氧化效果最佳。考虑到靛蓝对肝脏的保护作用，
作者选择了四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型，
对蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取物的体内抗
氧化活性进行研究。实验中灌胃液的制备需将体
积分数 95%的甲醇提取物浸膏溶解到水相中，由
于该浸膏过于黏稠，经反复尝试，需用高于室温的
体积分数 10%吐温 80 水溶液，边搅拌边充分混
悬，防止实验出现灌胃量不准。
b．作者通过考察蓼大青叶体积分数 95%甲
醇提取物对 DPPH·清除效果和对 H2O2 诱导红细
胞氧化溶血抑制作用，研究其体外抗氧化活性。
结果表明，蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取液在
一定范围内具有显著的自由基清除能力及抗氧化
溶血能力，剂量 －效应关系明显，表现出良好的体
外抗氧化活性。选用 CCl4 诱导小鼠肝损伤模型
对蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取物进行体内
抗氧化活性评价，并选择雌雄小鼠各半来考察性
别差异对活性的影响。结果显示，在一定范围内
蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取物能够提高肝
损伤小鼠血浆中 T-SOD 活性和肝匀浆中 GSH-Px
活性，降低血浆 MDA 水平，且小鼠性别对实验结
果无显著影响。推测其机理可能是通过调节抗氧
化酶活性，阻断脂质过氧化链式反应［11］，缓解
CCl4 诱导的小鼠肝毒性，降低机体氧化损伤。研
究结果表明了蓼大青叶体积分数 95%甲醇提取
物具有较好的体内外抗氧化活性。
c． Kyung-su Kim 等通过体外抗氧化实验研
141第 2 期 徐珊珊等:蓼大青叶醇提物体内外抗氧化活性的研究
究发现，靛蓝植物成熟叶子的水提液具有较好的
抗氧化活性，并认为该活性强弱与其所含多酚类
化合物及 VC 的多少呈正相关［8］。本实验于初期
体外活性筛选阶段，发现体积分数 95%甲醇提取
液的抗氧化活性明显优于水提液，因此选择了对
体积分数 95%甲醇提取液做进一步的抗氧化活
性研究。靛蓝为吲哚苷类化合物，是蓼大青叶的
主要活性成分之一，本课题组前期实验已建立了
蓼大青叶中靛蓝的含量测定方法，作者按此方法
对本研究中蓼大青叶 95%甲醇提取物中的靛蓝
进行了提取和含量测定，但由于中药是一个复杂
体系，化学成分多样，其药理活性往往是多成分多
靶点协同作用的结果，因此，对于蓼大青叶抗氧化
活性的药效物质基础尚有待进一步深入研究。
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Study on antioxidant activity in vivo and in vitro of
methanol extraction of Polygoni Tinctorii Folium
XU Shan-shan，WU Xiao-xue，ZHANG Chen-ning，LI Qing，BI Kai-shun，YIN Ｒan*
(National and Local Joint Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medi-
cines，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China)
Abstract:Objective To observe the antioxidant activity in vivo and in vitro of the Polygoni Tinctorii Foli-
um．Methods The in vitro antioxidant activity of the Polygoni Tinctorii Folium was studied according to the
scavenging rate of DPPH·and the influence on the oxygen hemolysis of red blood cells induced by H2O2
with 95% methanol extraction of the Polygoni Tinctorii Folium． The in vivo effect was observed by determi-
ning the values of SOD，MAD in the plasma and GSH-Px in the liver homogenate of mice． Ｒesults The 95%
methanol extraction of the Polygoni Tinctorii Folium could significantly scavenge DPPH·with IC50 of
103. 4 mg·L －1 in the range of 25-1 000 mg·L －1，and inhibit the hemolysis of red blood cells induced by
H2O2 between 25-100 mg·L
－1 ． It could also lower the level of MDA，increase the activity of T-SOD in mice
plasma，and improve the vitality of GSH-Px in mice liver homogenate within the dosage of 3-12 g·kg －1 ．
Conclusions The 95% methanol extraction of Polygoni Tinctorii Folium has obvious antioxidant activity in
vivo and in vitro ．
Key words:Polygoni Tinctorii Folium;methanol extraction;antioxidant;in vivo;in vitro
241 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 31 卷