全 文 ：高速逆流色谱分离纯化木芙蓉叶中芸香苷
陈云1，赵红英1，王贵发1，王奇2
(1．浙江省人民医院药学部，杭州 310014;2．浙江科技学院生物与化学工程学院，杭州 310023)
摘 要 目的 建立高速逆流色谱( HSCCC) 分离纯化木芙蓉叶中芸香苷的方法。方法 采用水提取法制备芙蓉
叶粗提物，应用大孔吸附树脂以 60%乙醇为洗脱液对粗提物进行洗脱，达到去除杂质和获得黄酮类物质的目的，应用高
速逆流色谱仪，以乙酸乙酯∶ 正丁醇∶ 水( 1∶ 0． 3∶ 1． 5) 上相为固定相，下相为流动相，组成溶剂体系对芙蓉叶提取物进
行分离，从而获得高纯度的芸香苷。结果 经对提取的芸香苷粗提物及 HSCCC 法纯化后的峰样品进行高效液相色谱
( HPLC) 分析，表明芸香苷粗提物的纯度较低，纯化后的峰样品纯度 98． 6%，达到了化学对照品的要求。结论 该方法
重复性好，分离效果好，可为 HSCCC在其他植物黄酮类提取中的应用提供有价值的参考。
关键词 木芙蓉叶;芸香苷;色谱，高速逆流
中图分类号 R282． 71; R284． 2 文献标识码 A 文章编号 1004－0781( 2013) 06－0778－04
Separation and Purification of Rutoside from Hibiscus Mutabilis Leaves Using High-speed
Counter-current Chromatography
CHEN Yun1，ZHAO Hong-ying1，WANG Gui-fa1，WANG Qi2 ( 1． Department of Pharmacy，Zhejiang
Provincial People＇s Hospital，Hangzhou 310014，China; 2． School of Biological and Chemical Engineering，
Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China)
ABSTRACT Objective To develop a experimental system for the separation of rutoside from Hibiscus mutabilis leaves by
high-speed counter-current chromatography ( HSCCC) ． Methods HSCCC was successfully applied to purify rutoside extracts
of Hibiscus leaves． Firstly，crude extract of Hibiscus mutabilis leaves was prepared by water extraction． Then the crude extract was
applied to macroporous resin and eluted with 60% ethanol ． The above extract was further sperated by HSCCC． The two-phase
solvent system used in HSCCC was ethyl acetate∶ n-butanol∶ water ( 1∶ 0． 3∶ 1． 5) ． Results The purity of the obtained
rutoside was over 98． 6% ． Conclusion HSCCC is a feasible method for the purification of rutoside from the herb．
KEY WORDS Hibiscus mutabilis leaves; Rutoside; Chromatography，high-speed counter-current
木芙蓉叶为部颁法定药材，又名芙蓉花叶，为锦葵科
植物木芙蓉(Hibiscus mutabilis L．)的叶，味微辛而滑、无
毒，具有凉血、解毒、消肿、镇痛等功效［1］。近年来研究证
明，木芙蓉花、叶中含有芸香苷等黄酮类化合物［2-3］。其
叶的煎剂对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌等均有抑制作
用［4］;其水浸出液还具有明显的抗炎活性且无毒。目前，
植物总黄酮的提取及纯化方法有水煎煮法、乙醇提取法、
超声波法、微波提取法和大孔树脂法等［5-6］，多为传统方
法，所得总黄酮纯度较低，笔者采用水提取法制备芙蓉叶
粗提物，应用大孔吸附树脂以 60%乙醇为洗脱液对粗提
物进行洗脱，再应用高速逆流色谱(high-speed counter-
current chromatography，HSCCC)法进行分离纯化。
HSCCC 是 20 世纪 80 年代发展起来的一种液液
分配色谱分离技术，具有样品无损失、无污染、高效、快
速和大制备量分离等优点，已广泛应用于天然产物化
学成分的分离［7-10］。
目前，采用 HSCCC 法分离芙蓉叶中芸香苷的研究
收稿日期 2012－07－12 修回日期 2012－11－29
作者简介 陈云(1982－) ，女，浙江杭州人，药师，从事医院
药学工作。电话:0571－85893237，E-mail:46676795@ qq． com。
笔者未见报道。本研究旨在选择分离芙蓉叶中芸香苷
最佳的 HSCCC 溶剂体系和操作条件，利用高效液相色
谱(HPLC)来测定两相溶剂体系中各组分的分配系数
K值，运用 HSCCC技术分离纯化芙蓉叶中芸香苷。
1 仪器、试剂与试药
1． 1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪(Waters
中国有限公司) ;TBE 300A 型高速逆流色谱仪(上海
同田生物技术有限公司) ，恒温循环器:HX-1050，
UVD-200 UV Detector:TBP-50A;BUCHI 旋转蒸发仪
(TOKYO RIKAKIKAI CO． LTD) ;HX-200 型中药粉碎
机(浙江省永康市溪岸五金药具厂) ;SP-756PC 型紫
外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。
1． 2 试剂与试药 木芙蓉叶(由浙江天一堂药业公
司提供并鉴定为 Hibiscus mutabilis) ;芸香苷对照品(纯
度:98%，批号:110221，上海融禾医药科技发展有限公
司) ;ADS-17 大孔吸附树脂(安徽三星树脂科技有限
公司) ;D101 大孔吸附树脂(安徽三星树脂科技有限
公司) ;乙醇(杭州亭亭化工有限公司，分析纯) ;乙酸
乙酯(杭州高晶精细化工有限公司，分析纯) ;甲醇(上
海申翔化学试剂有限公司，分析纯) ;正丁醇(杭州高
·877· Herald of Medicine Vol. 32 No. 6 June 2013
晶精细化工有限公司，分析纯) ;冰醋酸(杭州高晶精
细化工有限公司，分析纯)。
2 方法与结果
2． 1 木芙蓉叶粗提物的制备
2． 1． 1 用水提法制备木芙蓉叶粗提物 取烘干的木芙
蓉叶于万能粉碎机内粉碎至粉末状。取芙蓉叶粉
末 8． 6 g，无水碳酸钠和硼砂各 0． 7 g，置于 500 mL 烧杯
中，按物料比 1∶25 加水溶解，50 ℃下搅拌 15 min 后离
心 12 min，收集上清液，滤渣按物料比 1∶20加水溶解，50
℃下搅拌10 min后再离心12 min，合并上清液，72 ℃下旋
蒸至约 40 mL，加 4倍量乙醇溶解后抽滤，60 ℃下旋蒸至
无乙醇，浓缩液经 D101大孔吸附树脂柱收集有效成分后
再在 65 ℃下旋蒸得浸膏，经真空干燥得到粗提物。
2． 1． 2 过柱洗脱液乙醇体积分数的考察 按“2． 1． 1”
项方法提取木芙蓉叶粗提物，过 D101 大孔吸附树脂柱，
洗脱液乙醇浓度分别按 40%，50%，60%，70%，80%来洗
脱样品。其芸香苷含量变化见表 1。
表 1 过柱时乙醇浓度对芸香苷含量的影响
Tab． 1 Effects of volume fraction of ethanol on rutin
content eluted through the column
乙醇浓
度 /%
浸膏干
质量 /g
浸膏得率 /
%
峰面积
芸香苷
含量 /%
40 0． 286 3 1． 664 5 4 944 989 0． 319 8
50 0． 406 0 2． 360 5 7 728 398 0． 498 0
60 0． 424 5 2． 468 0 8 294 550 0． 534 3
70 0． 397 5 2． 311 0 8 430 613 0． 543 0
80 0． 325 6 1． 893 0 7 817 962 0． 503 8
从表 1 可以看出，当乙醇浓度从 40%至 70%时，
芸香苷含量不断增加;当乙醇体积分数从 70%至 80%
时，芸香苷含量开始下降。可以看出，洗脱时乙醇浓度
以 70%为最佳。
2． 2 HSCCC对芙蓉叶芸香苷分离纯化
2． 2． 1 溶剂体系的选择 经查阅文献［11-13］，采用
乙酸乙酯、正丁醇、水为溶剂体系对木芙蓉叶进行成分
分离。溶剂体系分别按照下列比例乙酸乙酯∶正丁醇
∶水为 1∶0． 5∶1． 5;1∶0． 3∶1． 2;1∶0． 3∶1． 5;1
∶0． 5∶1． 7;1∶0． 3∶1． 7 配置两相体系。取一定量
的经大孔吸附树脂纯化的木芙蓉叶提取物溶解在两相
体系中，各取等体积的两相溶液于道夫管中，烘干溶
液，用等体积的甲醇溶解烘干后的产物，经 HPLC 检测
得两相中各自的芸香苷峰面积，得分配系数。各比例
分配系数 K 值见表 2，K 值均在 0． 5 ～ 2． 0 范围内，符
合高速逆流分离条件。K=固定相峰面积 /流动相峰面
积，溶剂体系上相为固定相，下相为流动相。
表 2 不同分配体系比例所得的分配系数
Tab． 2 The distribution coefficient of different
proportion of the distribution system
体系比例
固定相中
保留峰的面积
流动相中
保留峰的面积
分配
系数(K)
1∶0． 3∶1． 5 1 044 584 1 298 566 0． 804 4
1∶0． 5∶1． 7 1 770 041 1 089 954 1． 624 0
1∶0． 5∶1． 5 1 719 634 1 075 976 1． 598 2
1∶0． 3∶1． 2 1 357 455 1 275 448 1． 063 5
1∶0． 3∶1． 7 1 472 623 1 326 647 1． 110 0
经高速逆流考察以上几种比例，因出峰的分离度
和峰形的原因，本实验选择溶剂体系比例为 1∶0． 3∶
1． 5 进行高速逆流实验，分配系数为 0． 804 4。当所取
同体积的两相溶液未烘干时，发现出峰时间很不稳定，
故无法计算其分配系数。而后来经过烘干的出峰时间
较稳定，可用上式计算其分配系数。
2． 2． 2 两相溶液的配置 按 1∶0． 3∶1． 5 的分配比
例取乙酸乙酯 350 mL、正丁醇 105 mL、水 525 mL于分
液漏斗中静置过夜，分别收集上下层为体系上、下相，
超声 0． 5 h排除气泡。
2． 2． 3 样品溶液的配置 精密称取木芙蓉叶粗提物
0． 08 g，用等体积上下相溶液各 10 mL超声溶解待用。
2． 2． 4 HSCCC 分离 按下列条件操作高速逆流色谱
仪，得到色谱分离图。溶剂体系:乙酸乙酯-正丁醇-水
(1∶0． 3∶1． 5) ，紫外波长:365 nm，转速:830 r·min－1，
流速:2 mL·min－1，温度:25 ℃，保留率:42． 86%。
2． 2． 5 HSCCC 影响因素考察 HSCCC 影响条件较
多，如紫外波长、转速、流速、温度等。本实验选取转
速、流速、紫外波长对芸香苷分离的影响作了比较。发
现转速提高时，出峰时间提前;流速加大时，出峰时间
亦提前;紫外光波长应与高效液相色谱条件统一，不然
出峰较杂，分离效果差。
2． 2． 5． 1 流速的考察 紫外光波长:365 nm;转
速:830 r·min－1;温 度:25 ℃;流 速 分 别 为 1．
5，2． 0 mL·min－1。流速为 1． 5 mL·min－1 的高速逆
流色谱分离图见图 1，2。
从图 1，2 可以看出，当流速为 1． 5 mL·min－1 时，
出峰时间相对较迟;当流速为 2． 0 mL·min－1 时，出峰
时间较早。
2． 2． 6 样品浓缩处理 将 HSCCC收集的 4 个峰收集
液分别合并，于旋转蒸发仪中 65 ℃下蒸除溶剂，蒸干
后用甲醇 5 mL溶解，备用。
·977·医药导报 2013 年 6 月第 32 卷第 6 期
图 1 流速为 2 mL·min－1 时的 HSCCC分离图
1，2，3．未知; 4．芸香苷
Fig． 1 HSCCC separated spectrum at the flow rate of
2 mL· min－1
1，2，3． unknown; 4． rutoside
图 2 流速为 1． 5 mL·min－1 时的 HSCCC分离图
1，2，3．未知; 4．芸香苷
Fig． 2 HSCCC separated spectrum at the flow rate of
1． 5 mL· min－1
1，2，3． unknown; 4． rutoside
2． 3 HPLC成分分析
2． 3． 1 芸香苷对照品溶液的配制 精密称取芸香苷
对照品 3． 48 mg，置于 25 mL量瓶中，用少量甲醇超声
溶解，并用甲醇定容至刻度，配成 139． 2 μg·mL－1 对
照品液，冷藏备用。
2． 3． 2 色谱条件 色谱柱为 Waters xterra C18
(4． 6 mm×150 mm，5 μm) ，流动相为乙腈-甲醇-水为
17 ∶ 8 ∶ 75，检 测 波 长 为 360 nm，流 速
为 1． 0 mL·min－1;进样量为 10 μL。
2． 3． 3 芸香苷标准曲线 取 139． 2 μg·mL－1 芸香苷
标准溶液各 0． 5，1． 0，1． 5，2． 0，2． 5，3． 0 mL 置于 50 mL
量瓶中用甲醇定容至刻度。以“2． 3． 2”项色谱条件依次
进样测定。以含量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性
回归，回归方程为 Y=2×106X－150 103，r=0． 999 9。
2． 3． 4 木芙蓉叶粗提物的测定 木芙蓉叶粗提物样
品适量，按照以“2． 3． 2”项色谱条件进样测定，得知含
有芸香苷峰，见图 3。
2． 3． 5 高速逆流分离产物的测定 将高速逆流接出的4
个峰(从主峰开始记为 1，2，3，4号峰)通过高效液相色谱
分析后发现:一号峰无明显高纯度峰出现;二号峰出现一
个出峰时间为5． 964 min，纯度为83%的峰，见图4A;三号
峰出现一个出峰时间为 8． 443 min，纯度 86． 88%的峰，见
图 4B;四号峰出现一个出峰时间为 8． 582 min，纯度
为 98． 6%的峰，见图 4C。因三号峰与四号峰的出峰时间
很相近，故将两液混合后再分析，得到一个出峰时间
为 8． 664 min，纯度为 98． 39%的峰，见图 4D。
图 3 木芙蓉叶粗提物 HPLC图
1，2，3．未知; 4．芸香苷
Fig． 3 HPLC chromatogram of hibiscus mutabilis leaf
extracts
1，2，3． unknown; 4． rutoside
图 4 高速逆流接出的 4 个峰 HPLC图
2，3．未知; 4．芸香苷; 3+4．未知
Fig． 4 HPLC chromatogram of the four peaks of high-
speed countercurrent
2，3． unknown; 4． rutoside; 3． plus 4． unknown
·087· Herald of Medicine Vol. 32 No. 6 June 2013
3 讨论
将芸香苷的甲醇标准溶液在紫外分光光度计上进
行扫描，在 200 ～ 400 nm范围内有 360，254 nm特征吸
收峰，在 254 nm处芸香苷吸收较 360 nm大，但由于芙
蓉叶粗提物中其他物质的影响，以 254 nm作为检测波
长干扰因素多，所以选择 360 nm作为检测波长。
本实验采用 HSCCC对木芙蓉叶粗提物进行进一步
分离，得到 4 个比较明显的峰。通过液相色谱检测，发
现 4号峰即为高纯度的芸香苷。但是，其他 3 个峰究竟
是何物质，其结构又如何，3 号峰如果也是芸香苷，高速
逆流为何将其明显分开等，还有待进一步研究。
参考文献
［1］ 郭清凤，郭田秀．消肿散治疗献血后局部血肿形成［J］．
中国民间疗法，2002，10 (2) :32－33．
［2］ 王金洪．木芙蓉根外敷治疗阑尾脓肿 42 例体会［J］．中
国乡村医生杂志，1996，5 (1) :39－40．
［3］ 任敬威，张增图．外敷木芙蓉花治流行性腮腺炎［J］．新
中医，1994，26 (2) :44．
［4］ 姚莉韵，陆阳，陈泽乃．木芙蓉叶化学成分研究［J］．中草
药，2003，34 (3) :201－203．
［5］ 曾超珍，刘志祥，韩磊．黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活
性研究［J］．时珍国医国药，2009，20(6) :1342－1343．
［6］ 刘昌，魏元锋，刘新国，等．利用大孔吸附树脂对黄芩总
黄酮的纯化研究［J］．云南中医学院学报，2007，30(3) :
40－41．
［7］ 耿岩玲，李福伟，王晓，等．罗布麻中黄酮的超声波强化
提取及高速逆流色谱分离纯化［J］． 食品科学，2007，28
(12) :47－49．
［8］ 祝顺琴，刘万宏，谈锋．高速逆流色谱法纯化曼地亚红豆
杉枝 叶 提 取 物 中 紫 杉 醇［J］． 中 草 药，2007，38
(10) :1491－1492．
［9］ PENG J Y，FAN G R，CHAI Y F，et al． Efficient new
method for extraction and isolation of three flavonoids from
Patrinia villosa Juss． by supercritical fluid extraction and
high-speed ounter-current chromatography ［J］． J Chrom
A，2006，1102(1 /2) :44－50．
［10］ WEI Y，XIE Q Q，DONG W T，et al． Separation of epi-
gallocatechin and flavonoids from Hypericum perforatum L．
by high-speed counter-current chromatography and
preparative high-performance liquid chromatography［J］． J
Chrom A，2009，1216(19) :4313－4318．
［11］ 李爱峰，刘宁宁，柳仁民．高速逆流色谱原理及其在天然
产物化学成分分离中的应用研究进展［J］．理化检验:化
学分册，2008，44(5) :481－488．
［12］ 顾铭，苏志国．高速逆流色谱用于天然产物分离和指纹
图谱构建［J］．生物加工过程，2003，1 (2) :59－61．
［13］ 沈平孃． 高速逆流色谱(HSCCC)技术与色谱指纹谱
［J］．中成药，2001，23 (5) :313．
DOI 10． 3870 /yydb． 2013． 06． 029
櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆
关于启用《科技期刊学术不端文献检测系统》的说明
为了保证学术论文的真实性与原创性，抵制论文抄袭与剽窃、伪造、篡改、不当署名、一稿多投等学术界的不
正之风，本着对《医药导报》论文作者和读者负责任的态度，本刊于 2010 年 1 月开始启用《科技期刊学术不端文
献检测系统(AMLC)》。该系统以《中国学术文献网络出版总库》为全文比对数据库，本刊编辑对作者投来的稿
件，在送外审之前使用该系统对稿件的文字复制情况进行检测，检测结果包括与已发表论文比对后的文字复制比
例，所涉及论文的题目、作者、发表期刊和发表时间。按规定文字复制比超过 30%的来稿即疑有学术不端行为，
将不能进入下一步审稿程序，特此提醒广大投稿作者，注意所投稿件的原创性与真实性。特此说明。
《医药导报》编辑部
·187·医药导报 2013 年 6 月第 32 卷第 6 期