全 文 ：第 21卷　第 4期　　　　　　　　　　　西　南　林　学　院　学　报　　　　　　 Vo1.21　No.4
　2001年 12月　　　　　　　　　JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY COLLEGE　　　　 Dec.2001　
海拔对旱冬瓜共生固氮放线菌基因多样性的影响
熊　智1 ,3 ,李文军2 ,张忠泽1 ,姜成林2
(1.中国科学院 沈阳应用生态研究所 ,辽宁 沈阳 110015;
2.教育部微生物资源重点实验室云南微生物所 ,云南 昆明 650091;3.西南林学院 资源学院 ,云南 昆明 650224)
摘要:直接从昆明西山 、武定狮山和大理苍山采集的旱冬瓜根瘤中提取 DNA ,扩增出
Frankia的 16S rDNA ,然后用ADARA技术研究不同海拔的旱冬瓜根瘤中共生固氮放
线菌 Frankia的遗传多样性.结果表明:(1)海拔是影响旱冬瓜共生 Frankia 的遗传多
样性的重要因素;(2)海拔梯度越大 ,则 Frankia 的遗传多样性越丰富;(3)某些基因类
型的 Frankia仅出现在某些海拔上 ,而另一些则分布在较广泛的海拔范围.
关键词:旱冬瓜;Frankia;ARDRA技术;海拔;遗传多样性
中图分类号:S792.15.06　文献标识码:A　文章编号:1003-7179(2001)04-0205-05
放线菌 Frankia 可与 24属木本植物共生 、接瘤和固氮.各国学者采用常规或分子生物学
方法对 Frankia 进行了大量的研究 ,发现它具有丰富的多样性[ 1～ 4] .这些研究表明 Frankia
的多样性与寄主植物 、地域 、海拔等因子有密切的关系[ 3] .虽然研究表明 Frankia 多样性与
生态因素有密切关系 ,但是对旱冬瓜共生固氮放线菌的基因多样性与海拔的关系研究不多.
旱冬瓜(Alnus nepalensis)属于典型的喜马拉雅植物区系成分 ,在云南省有广泛的分布.
云南省山地面积占全省面积的 63.5%,旱冬瓜一般分布在海拔 1 000 ～ 3 000 m的范围内[ 5] .
这给研究海拔因子对旱冬瓜共生固氮放线菌基因多样性研究提供了得天独厚的条件.本文
就是利用ARDRA法(扩增性 rDNA限制性内切酶切片段分析)[ 6]研究旱冬瓜中共生 Frankia
的遗传多样性与海拔的关系.
1 　材料与方法
1.1　供试根瘤
云南省旱冬瓜主要分布在南盘江流域 、滇西和滇中.本试验在大理苍山(海拔 1 974 ～
4 122 m)、昆明西山(海拔 1 900 ～ 2 507 m)、武定狮山(海拔 1 900 ～ 2 420 m)采集根瘤.根瘤
洗净后 ,置-20 ℃储存备用.供试样品采集地详细资料见表 1.
收稿日期:2001-11-14
　基金项目:云南省教育厅科学基金资助项目(0111468)
　作者简介:熊　智(1965-),男 ,重庆人 ,讲师 ,中国科学院沈阳应用生态研究所博士生 ,主要从事植物病理 、微生物
资源等方面的研究工作.
1.2　研究方法
1.2.1　Frankia 总DNA的提取　采
用CTAB 法[ 7] .取洗净的根瘤 3 ～ 5
个 ,用 30%过氧化氢表面消毒后 ,
将瘤磨碎 ,加入 CTAB 提取液〔1%
CTAB ,100 mM Tris(pH 8.0),20 mM
EDTA(pH 8.0), 1.4 M NaCl , 2%
PVP〕1 000μl ,在 65 ℃温育 2 ～ 3 h.
用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提 2次 ,用
表 1　实验用的根瘤
样号 地点 海拔/m 样号 地点 海拔/m
wm01 昆明西山 1 934 wd01 武定狮山 2 021
wm02 昆明西山 2 167 wd02 武定狮山 2 158
wm03 昆明西山 2 212 wd03 武定狮山 2 310
wm04 昆明西山 2 300 wd04 武定狮山 2 390
wm05 昆明西山 2 400 wd05 武定狮山 2 420
wm06 昆明西山 2 507 dl01 大理苍山 2 300
dl02 大理苍山 2 563 d103 大理苍山 2 600
dl04 大理苍山 2 800 d105 大理苍山 2 915
d106 大理苍山 3 000 d107 大理苍山 3 400
1/10体积 3 M的乙酸钠和 1倍体积冰乙醇沉淀 DNA.DNA沉淀用乙醇洗涤 ,用TE或去离子
水溶解 ,储存在-20℃备用.如有必要 ,用低熔点琼脂糖法纯化 DNA[ 8] .
1.2.2　PCR扩增 16S rDNA　选用桤木属共生的 Frankia 特异引物 FGPS2-255(5′-TG-
GAAAGCTTGATCCTGGCT-3′)和 TGPS1509′-153′(5′-AAGGAGGGGATCCAGCCGCA-3′)[ 9] ,
进行扩增.总反应体积50 μl中 ,含1×的反应缓冲液(TaKaRa公司),2.5 mM 的MgCl2 ,dNTP
200μM/每种 ,两种引物(TaKaRa 公司合成)各 0.5 μM , DNA 模板 1 μl(102 ～ 105 靶分子),
TagDNA聚合酶 2U(TaKaRa 公司),补充水到 50 μl.95 ℃预变性 5 min后 , 94 ℃变性 40 s ,
54 ℃退火 40 s ,72 ℃延伸 1 min ,共 35个循环 ,最后在 72 ℃下延伸 6 min.用 1%的琼脂糖电
泳检测到约1 500 bp的PCR产物.-20℃储存备用.
1.2.3　RELP分析　选用 HaeⅢ ,Hha Ⅰ ,AluⅠ ,MspⅠ和 Afa Ⅰ5种限制性内切酶(TaKaRa 公
司)对 10μl样品 PCR产物进行双酶和单酶切.酶切反应严格按照供应商的规则.酶切后的
产物用不连续聚丙烯酰胺电泳(PAGE)电泳检测.用改进的 Bassam等的方法[ 10]银染.胶片制
成干胶保存.
1.2.4　多样性分析　胶片用GeneGenius的凝胶成像仪拍照.图像由 GeneGenius提供的软件
判读成二元性状(Binary Character)编码.人工验证二元性状编码矩阵.二元性状编码矩阵用
Phyltool 1.2计算出距离矩阵.用PHYLIP 3.0处理距离矩阵得到树状图.
2 　结果与讨论
以西山 、狮山和苍山旱冬瓜根瘤中提取的 DNA ,用引物 FGPS2-255和 FGPS1509′-153
能扩增出 Frankia的 16S rRNA基因约 1 500 bp 片段.用 5种限制性内切酶进行单酶和双酶
切 ,发现HaeⅢ和Afa Ⅰ双酶切的结果分辨率高 、重复性和稳定性好.对西山 、狮山和苍山旱
冬瓜中 Frankia 的 16S rRNA基因约 1 500 bp片段 HaeⅢ和AfaⅠ双酶切 ,结果见图 1 ～ 3.
多态性指数是反映物种多样性的重要指标.多态性指数越高物种的多样性越丰富.多态
性=(总带数-共有带数)/总带数×100[ 11] .西山 、狮山和苍山分别为 66.7%[(9-3)/9] ,
58.3%[(12-5)/12]和 75.0%[ (12-3)/12] .苍山海拔梯度大于西山 ,而西山海拔梯度大于
狮山 ,Frankia 多态性指数似乎说明海拔梯度决定了Frankia 的多样性.
为了进一步说明海拔与 Frankia的多样性关系 ,用 PHYLIP 3.0处理(UPGMA方法)二元
性状编码矩阵得到树状图 ,见图4 ～ 6.
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图 1　大理苍山样品 PCR产物用HaeⅢ和 AfaⅠ
双酶切产生的 ARDRA带型
M为DNA 100bp Ladder分子标记;di 01～ di 06为不同海拔样品
图 2　昆明西山样品 PCR产物的用 HaeⅢ和 AfaⅠ
双酶切的ARDRA 带型
M为DNA 100bp Ladder分子标记;wm 01～wm 06为不同海拔样品
图 3　武定狮山样品 PCR产物用HaeⅢ和 AfaⅠ
双酶切产生的 ARDRA带型
M为DNA 100 bp Ladder分子标记;wd 01～wd 06为不同海拔样品
图 4　基于 UPGMA方法建立的大理苍山 Frankia 样品
16S rDNA的酶切带型差异的树状图
标尺代表 10%的差异
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图5　基于UPGMA方法建立的武定狮山 Frankia 样品
16S rDNA 的酶切带型差异的树状图
标尺代表 10%的差异;1～ 5为样品 wd 01～ wd 05
图 6　基于UPGMA方法建立的昆明西山 Frankia 样品
16S rDNA的酶切带型差异的树状图
标尺代表 10%的差异;1～ 6为样品wm 01～ wm 06
图4表明:苍山的 Frankia 的 16S rRNA ARDRA带型可分为 4组 ,组间带型差异平均为
33.1%.在海拔 3 400 m和2 915m 处都出现独特的带型 ,它与其他海拔的样品带型差异可平
均分别达到 30.3%和 22.2%;海拔 2 021 m和 2 420 m的带型为一组;海拔 2 310 m 和 2 390
m的带型为一组.
图5表明:狮山的 Frankia 的 16S rRNA ARDAR带型可分为 3组 ,组间带型差异平均为
24.4%.在海拔 2 158 m 处出现独特的带型 ,它与其他海拔的样品带型差异可平均达到
29.2%;海拔 2 021 m和 2 420 m的带型为一组;海拔 2 310 m 和 2 390 m的带型为一组.
图6表明:西山 Frankia 的16S rRNA ARDRA带型可分为 3组 ,组间带型差异平均 30.0%.
海拔2 507m的 Frankia出现独特的带型 ,它与其他海拔的样品带型差异平均达到 45.0%;在海
拔2 167 ,2 300 ,2 400 m处出现相同带型;海拔 1 934 m和2 212 m出现相似的带型.
根据上述结果讨论如下:
根据多态性指数可以得出 ,不同海拔与旱冬瓜共生的 Frankia 存在丰富的多样性.海拔
梯度越大 ,多样性越丰富.
从树状图分析可以得到 ,海拔梯度越大产生的 Frankia 16S rDNA 的 ARDRA 带型越复
杂 ,带型之间的差异越大.苍山 、西山和狮山不同海拔 Frankia带型平均差异分别为:33.1%,
30.0%和 24.4%.这说明 Frankia 的多样性与海拔因子有密切的关系 ,海拔梯度越大多样性
越丰富.
在群落中 ,由于生境梯度与物种的生物学特征的不同 ,经常会出现(1)群落中物种交错
重叠 ,呈现极为复杂的关系.(2)群落中物种相互不发生交错关系 ,呈现明显的分布界限.(3)
群落中某一个或几个物种生态适应性较宽一些 ,但是其他物种(或类型)由于生境梯度的急
剧变化 ,而严格被限制在某种生境中.从树状图分析可以发现第 3 种模式解释了 Frankia
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16S rDNA的ARDRA带型变化与海拔的关系.如在西山海拔 2 507 m ,狮山 2 158 m ,苍山 3 400
m和 2 915 m 出现独特 ARDRA带型 ,这说明在 Frankia中 ,存在着对海拔条件要求严格的类
型;而在西山 1 934 ～ 2 400 m ,狮山2 021 m ,2 310 ～ 2 390 m ,苍山 2 300 ～ 2 800 m出现的带型
相互交错 ,出现极为复杂的情况.在一定的海拔处呈现明显的生态交错区(Ecotone),这说明
在 Frankia 中 ,存在适应性很广的种类.
[参　考　文　献]
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The Influence of Altitude on the Genetic Diversity
of Microsymbionts of Alnus nepalensis ———Frankia
XIONG Zhi1 , 3 , LI Wen-jun2 ,ZHANG Zhong-ze1 , JIANG Cheng-lin2
(1.Institute of Applied Ecology , Academia Sinica ,Shenyang Liaoning 110015 ,China;
2.Key Lab for M icrobial Resources of EducationMinistry , Yunnan University ,Kunming Yunnan 650091 , China;
3.Resources Forestry ,Southwest Forestry College , Kunming Yunnan 650224 , China)
Abstract:In this paper , we extracted the genomic DNA of Frankia from the nodules of Alnus
nepalensis in Xishan mountain , Shishan mt.and Cangshan mt., and amplified the 16S rDNA of
Frankia , then applied ARDRA(amplified Ribosomal Restriction Analysis)to study the influence of alti-
tude an the genetic diversity of Frankia symbiozing with Alnus nepalensis.The results show that(1)
The altitude is very important factor which can decided the genetic diversity of Frankia ,(2)the higher
the altitude gradient is , the more abundant the genetic diversity of Frankia , (3)some genotypes
Frankia are restricted in a certain altitude height , and some appear in wide range of altitudinal height.
Key words:Alnus nepalensis;Frankia ;ARDRA;altitude;genetic diversity
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