全 文 ：红芪多糖诱导人肝癌 HEP-G2细胞
凋亡的作用机制研究
李世刚 ,张永琦
(三峡大学医学院 ,湖北 宜昌 443002)
　　摘要　目的:研究红芪多糖对人肝癌 HEP-G2细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用及其可能机制。方法:应用
MTT法 、显微荧光术和流式细胞术测定红芪多糖对 HEP-G2细胞的增殖 、细胞周期及凋亡的影响 , 并应用流式细胞
术测定其对 Bc1-2和 Bax蛋白表达的影响。结果:红芪多糖对 HEP-G2细胞的增殖抑制作用具有时间及剂量依赖
性 , 400μg/mL红芪多糖作用 72h后对 HEP-G2细胞抑制率达到 33.8%;显微荧光术发现作用 72 h后 , HEP-G2细
胞核明显固缩 、凝聚 , 出现浓染致密的颗粒块状荧光;流式细胞术检测显示 200、400 μg/mL红芪多糖作用 72 h, 可
以观察到 G0前期的亚二倍体 DNA峰 ,但对G0 /G1期细胞比例和 S期细胞比例无明显影响 , 而G2 /M期细胞比例显
著升高(P<0.05);Bc1-2蛋白表达水平降低 , Bax蛋白表达水平提高。结论:红芪多糖可通过抑制人肝癌 HEP-G2
细胞的生长增殖 、G
2
/M期阻滞 、诱导细胞凋亡 、降低 bcl-2蛋白 、提高 Bax蛋白表达等作用机制发挥抗肿瘤作用。
关键词　红芪多糖;肝癌;细胞周期;细胞凋亡;Bcl-2;Bax
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)08-1249-03
MechanismofHedysariPolysaccharideintheApoptosisofHuman
HepatocelularCarcinomaHEP-G2Cels
LIShi-gang, ZHANGYong-qi
(MedicalColege, ChinaThreeGorgesUniversity, Yichang443002, China)
Abstract　Objective:TostudytheefectsofHedysaripolysaccharide(HPS)ontheproliferationandapoptosisofhumanhepato-
cellularcarcinomaHEP-G2celsanditsmechanism.Methods:MTTassay, flowcytometryandfluorescencemicroscopywereusedtothe
efectsofHPSinanti-proliferation, cellcyclearrestingandapoptosisinduction.Flowcytometrywasalsousedtodetecttheefectsdetect
ofHPSonproteinexpressionsofBcl-2andBax.Results:HPScouldcauseapparentinhibitiononcelgrowth, induceG2 /Mphasear-
restandapoptosisonHEP-G2cels.HPScoulddown-regulatebcl-2proteinexpressionandup-regulateBaxproteinexpression.Conclu-
sion:HPShasanti-tumoreffects, maybebythewayofinhibitingthecellgrowth, arrestingtheG2 /Mphase, inducingapoptosis, down-
regulatingbcl-2 andup-regulatingBaxproteinexpression.
Keywords　Hedysaripolysaccharide;Hepatocelularcarcinoma;Celcycle;Celapoptosis;Bcl-2;Bax
收稿日期:2008-09-05基金项目:三峡大学科研基金项目(0620070105)作者简介:李世刚(1971-),男 ,副教授 ,博士 ,主要从事多糖药理研究;Tel:0717-8500478, E-mail:fox201@ 163.com。
　　红芪为豆科植物多序岩黄芪(Hedysayumpoly-
botrysHand.-Mazz.)的根 ,主产甘肃 ,效同黄芪。具
有补气固表 、托毒排脓 、敛疮生肌及利尿等功效。红
芪多糖 (HPS)是其主要活性成分 , 具有抑瘤效
应〔1, 2〕及提高免疫功能的作用 〔3, 4〕。笔者前期实验
证实 HPS具有一定的抗肿瘤作用〔5〕。为了探讨
HPS抗肿瘤作用的机理 ,笔者对 HPS诱导人肝癌
HEP-G2细胞凋亡及其对相关蛋白表达的影响进行
了研究。
1　材料与仪器
1.1　材料　人肝癌 HEP-G2细胞(中科院上海细
胞生物研究所细胞库);红芪多糖(兰州大学药学院 ,
多糖含量达 96.6%,单糖的组成为鼠李糖 、木糖 、半乳
糖及葡萄糖 ,摩尔比为 0.04∶0.19∶0.19∶1.00)。
1.2　试剂 　小牛血清(GIBCO公司);RMPI-1640
培养液 (GIBCO公司);噻唑蓝(MTT)(SIGMA公
司);Hoechst-33258(BEYOTIME公司 );RNA酶
(SIGMA公司);碘化丙啶(PI)(SIGMA公司);OR-
THO-Permeafixt(ORTHO公司 );鼠抗 Bc1-2抗体
(DAKO公司 );兔抗 Bax抗体 (SANTACRUZ公
司);羊抗鼠荧光抗体(SIGMA公司);羊抗兔荧光抗
体(SIGMA公司)。
1.3　主要仪器　荧光显微镜 OLYMPUSIX70(O-
LYMPUS公司);流式细胞仪 EPICSXL(COULTER
公司)。
2　方法
·1249·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 8期 2009年 8月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.08.050
2.1　HEP-G2细胞培养　用含 10%小牛血清的
RMPI-1640培养液 ,在 5% CO2 、37 ℃细胞培养箱培
养 ,细胞呈贴壁生长 ,用 0.25%的胰酶消化传代 ,用
于实验的细胞均处于对数生长期。
2.2　HPS对 HEP-G2细胞的增殖抑制作用　采用
MTT法 〔6〕测定 ,即取对数生长期的 HEP-G2细胞 ,以
l×105 /孔接种于 96孔板 ,每孔设 4个复孔 , 24 h贴
壁后对照组换培养液 ,实验组加入不同质量浓度的
HPS(50、100、200、400μg/mL),于 24、48、72 h后应
用 MTT法比色检测细胞活力 。每孔中加入 MTT10
μL(5mg/mL),培养 4 h后 ,加入 10%酸化的十二
烷基磺酸钠(SDS)100μL,过夜 ,用 570nm波长在
酶标仪 Bio-Rad550上测定光密度 D(λ)值 ,并计算
细胞活力 。
　　细胞活力(%)=D(λ)实验组D(λ)对照组 ×100%
2.3　细胞形态学观察　采用显微荧光术 ,即收集
作用到预定时间的 HEP-G2细胞 ,以 DNA特异性结
合的荧光染料 Hoechst-33258 0.5 mL室温染色 10
min,在荧光显微镜下观察照相 。
2.4　细胞周期分布和凋亡比例检测　应用流式细
胞技术 ,即收集作用到预定时间的 HEP-G2细胞 ,
70%冷乙醇 4 ℃固定过夜 ,上机前用 PBS洗两遍 ,
加入 100 μg/mLRNA酶 , 37 ℃消化 30 min, 酶切
RNA;加 50 μg/mL碘化丙啶 ,避光 4 ℃染色 30 min
后 ,用流式细胞仪检测 ,计算出细胞周期分布及凋亡
情况 。
2.5　Bcl-2和 Bax蛋白表达检测　应用流式细胞
技术 ,即收集作用到预定时间的 HEP-G2细胞 ,加入
细胞透膜剂 ORTHO-Permeafixt孵育 40 min, PBS洗
2遍 ,再加入鼠抗 Bc1-2抗体或兔抗 Bax抗体孵育
30 min, PBS洗涤后加入羊抗鼠荧光抗体或羊抗兔
荧光抗体 ,然后用流式细胞仪检测 ,计算出 Bcl-2和
Bax蛋白表达情况。
2.6　统计学处理　采用 SPSS11.0软件进行 t检
验和方差分析 。
3　结果
3.1　HPS对 HEP-G2细胞的增殖抑制作用　HPS
对 HEP-G2细胞的增殖抑制作用具有时间及剂量依
赖性 , 400 μg/mLHPS作用 72 h后对 HEP-G2细胞
抑制率达到 33.8%。见图 1。
3.2　HPS对细胞形态学的影响　HEP-G2细胞随
HPS作用浓度增高出现不同程度的凋亡改变 ,荧光
显微镜下对照组细胞核形状正常 ,呈圆形 , 染色均
匀 ,其核内染色质呈均匀分布(图 2-A);而 400μg/
mLHPS作用 HEP-G2细胞 72 h后 ,其细胞核明显
固缩 、凝聚 ,出现浓染致密的颗粒块状荧光(图 2-
B)。
图 1　HPS对 HEP-G2细胞增殖抑制的影响( x±s, n=4)
注:与对照组比较 , ＊P<0.05
图 2　HPS对 HEP-G2细胞形态学的影响(×400)
A.对照组　B.HPS用药组
3.3　HPS对 HEP-G2细胞周期分布的影响及诱导
凋亡的作用　流式细胞术检测显示 200、400 μg/L
HPS作用 72 h,可以观察到 G0 前期的亚二倍体
DNA峰 ,即凋亡峰 ,亚二倍体细胞比例与对照组比
较差异显著(P<0.01),表明 HPS作用 72 h后引起
HEP-G2肿瘤细胞凋亡;200、400μg/LHPS作用 72
h后对 G0 /G1期细胞比例及 S期细胞比例无明显影
响 ,而 G2 /M期细胞比例升高 ,与对照组比较差异显
著(P<0.05),结合 MTT结果与形态学观察 ,表明
HPS可通过细胞周期阻滞 , 诱导细胞凋亡 , 抑制
HEP-G2肿瘤细胞生长增殖。见表 1。
　表 1　　　HPS体外对 HEP-G2细胞周期分布
及凋亡比例的影响(%, x±s, n=4)
组别 剂量 /(μg/L) Sub-G1 /%
G0 /G1 /% S/%
G2 /M /%
对照组 - 0.4±0.03 52.9±2.74 43.7±1.80 4.4±1.06
HPS 200 5.2±0.05＊＊ 51.9±2.02 43.3±1.03 7.0±1.02＊
HPS 400 8.3±0.15＊＊ 50.3±1.51 42.9±1.30 7.9±1.22＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.4　HPS对 Bcl-2及 Bax蛋白表达的影响　与对
照组比较 , 200、400 μg/LHPS作用 72 h后 Bcl-2蛋
白表达水平显著降低(P<0.05), Bax蛋白表达水平
显著提高(P<0.05)。见表 2。
·1250· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 8期 2009年 8月
　表 2　　　HPS体外对 HEP-G2细胞 Bcl-2和 Bax
蛋白表达的影响(%, x±s, n=4)
组别 剂量 /(μg/L) Bcl-2/% Bax/%
对照组 - 66.3±1.55 28.2±1.44
HPS 200 62.3±1.05＊ 32.7±1.14＊
HPS 400 59.1±1.56＊ 37.2±1.13＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05
4　讨论
细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(pro-
grammedceldeath, PCD),即有核细胞在一定条件
下启动自身的内部机制使得内源性 DNA内切酶激
活而引起的细胞死亡过程 ,即受基因 、信使调控的单
个细胞自杀过程〔7〕。目前诱导癌细胞凋亡的西药
很多 ,但由于毒副作用较大使其应用受到一定限制 ,
因此中药诱导癌细胞凋亡受到越来越多的关注。
本实验采用多种方法对红芪多糖 HPS的抗肿
瘤作用机制进行研究。MTT法发现 HPS对 HEP-G2
细胞生长有抑制作用 ,并具有时间及浓度依赖性。
荧光显微镜观察显示 HPS诱导 HEP-G2细胞发生
了不同程度的凋亡。流式细胞仪检测发现 HPS将
HEP-G2细胞阻滞于 G2 /M期。实验结果表明 HPS
可通过细胞周期阻滞 ,诱导细胞凋亡 ,抑制 HEP-G2
肿瘤细胞生长增殖从而达到抗肿瘤作用 。
线粒体中的 Bcl-2和 Bax蛋白在细胞凋亡的控
制过程中扮演着相当重要的角色。 Bcl-2蛋白可抑
制线粒体膜的通透性 ,阻止细胞色素 C的释放 ,抑
制 caspase-3的激活 ,阻断生理性或病理性刺激对细
胞凋亡的诱导〔8〕。Bcl-2过表达可提高细胞的存活
率 ,而 Bax蛋白可促进细胞凋亡 。本实验通过流式
细胞技术检测对照组及 200、400 μg/LHPS作用 72
h后 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的表达 ,探讨 HPS诱导
HEP-G2细胞凋亡是否与线粒体途径有关。结果发
现 ,在 200、400μg/LHPS作用下 ,药物组 Bcl-2蛋白
的表达显著降低 , Bax蛋白的表达显著提高。
综上所述 , HPS可在一定程度上抑制人肝癌
HEP-G2细胞的体外增殖 ,其机制与细胞周期阻滞
在 G2 /M期 、诱导细胞凋亡有关 ,在此凋亡过程中发
现 Bcl-2蛋白表达显著降低 , Bax蛋白表达显著升
高 ,提示 HPS可能通过线粒体 Bcl-2 /Bax途径诱导
细胞凋亡 ,抑制 HEP-G2细胞生长增殖从而达到抗
肿瘤作用。
参 考 文 献
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《中药材》杂志为中国精品科技期刊。
·1251·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 8期 2009年 8月