全 文 ：2013年 第 34卷 第 4期 中 北 大 学 学 报 (自然科学版 ) Vol. 34　 No. 4　 2013
(总第 150期 ) JOURNAL OF NORTH UNIVERSITYOF CHINA(NATURAL SCIENCE EDITION) ( Sum No . 150)
文章编号: 1673-3193( 2013) 04-0448-05
变构菌素类似物的分离鉴定及其
生物合成机制
孔日祥 1, 2 , 唐　莉 1, 2
( 1. 大连理工大学 环境与生命学院 , 辽宁 大连 116024; 2. 大连理工大学 分子药物研究中心 , 辽宁 大连 116024)
摘　要:　利用正相色谱、反相色谱法对灰产色链霉菌的发酵副产物进行了分离 , 采用波谱学方法进行了化
合物的结构鉴定 ;利用生物转化方法对其生物合成途径进行了研究 ; 采用 M TT法检测了化合物对 HC T-15
细胞的抗肿瘤活性 . 结果表明: 从灰产色链霉菌发酵产物中得到了变构菌素的结构类似物 A1, A1为全新结
构的天然产物 . 对比变构菌素 , A1对 HCT15的细胞毒性较差 ( IC50为 70μm) , 且 A1来自于变构菌素的异
常生物合成 .
关键词: 　变构菌素类似物 ; 分离纯化 ; 结构鉴定 ; 生物合成
中图分类号: 　 Q939. 97　　　文献标识码: A　　　　 doi: 10. 3969 /j. issn. 1673-3193. 2013. 04. 020
The Isolation and Identif ication of Tautomycetin
Analogue and Its Biosynthetic Mechanism
KONG Ri-xiang1, 2 , T ANG Li1, 2
( 1. School of Env ironm enta l and Bio lo gic Science and Techno lo g y,
Dalian Univ ersity of Tech no lo gy , Da lian 116024, China;
2. Resea rch Cente r of Molecular Medicine, Dalian Univ ersity o f Techno lo g y, Dalian 116024, China )
Abstract: The structural analogue f rom streptomyces g riseoch romogenes fermenta tion bro th w as isola t-
ed and identi fied, and its biosynthesis pathway was demonst rated and propo sed. A1 w as isolated by use
o f the normal phase and reverse phase chromatog raphy methods. It s st ructure w as elucidated from spec-
troscopic analy sis. The bio t ransfo rmation experiment w as used to confi rm its biosynthetic pathway , and
i ts anti-tumor activi ty ag ainst HCT-15 was analy zed w ith M T T method. A novel metabo li te is isolated
and characterized as A1, a tautomycetin amide analogue, which has a modera te anti-tumor activi ty ( IC50
= 70μm) compa red to tautomycetin. As a major by-product , A1 deriv es f rom the abno rmal bio synthesis
o f tautomycetin production.
Key words: tautomycetin analogue; isolation and puri fica tion; st ructural identification; bio synthesis
　　众所周知 , 蛋白磷酸酶在细胞生长过程中起
着不可缺少的作用 , PP1和 PP2A经常被归类为
细胞周期的负向调节剂 , 在细胞增殖和分化中起
着非常重要的作用 . 蛋白磷酸酶抑制剂已被证明
对一些肿瘤细胞具有毒性作用 , 而且在临床中已
被试验用于肿瘤治疗 [1 ] .
收稿日期: 2013-03-20
　基金项目: 国家杰出青年科学基金资助项目 ( 30688003)
　作者简介: 孔日祥 ( 1976-) , 男 , 博士生 . 主要从事微生物与生化药学研究
　通信作者: 唐莉 ( 1963-) , 女 , 教授 , 博士 . 主要从事微生物与生化药学研究 .
变构菌素 ( Tautomycetin, TMC, 图 1)是在
1989年从灰产色链霉菌发酵产物中分离得到的一
种聚酮类抗生素 [2 ] . 该物质对各种真核细胞 ,包括
真菌和动物细胞表现出了强大的抗生素活性 [3 ] .
后来一系列的研究发现 , TMC具有对 T细胞的
免疫抑制活性 , 而且 TMC能特异性地抑制蛋白
磷酸酶 PP1( IC50为 1. 2～ 2 nm , 而对 PP2A为
46～ 62 nm ) , 而对 PP2B的活性却没有抑制作用
( IC50 > 1μm) ,显示了高度的特异性 [ 4] . 因此 ,
TMC在被发现许多年后又引起了科学界研究的
广泛兴趣 . 美国的 Shen Ben小组 , 韩国的 Kim小
组 , 大连理工大学分子药物研究中心已经克隆了
TMC的完整生物合成基因簇 [ 5-7 ] , 并对其基因结
构与功能以及基因间的相互作用进行了深入研
究 [8-9 ] . TMC结构中的马来酸酐环 ( C8环 )由
TauO PQ R负责催化合成 , 而其自身的长链是在 I
型 PKS聚酮合酶的生物催化下合成的 .
本文采用从野生型中分离鉴定 TMC结构类
似物的手段来进一步阐述 TMC的生物合成机制 ,
为开发新型的结构衍生物提供基础 . 经过发酵、分
离、纯化得到一个新的 TMC结构类似物 ( A1) ,
并对其进行结构确证 ; 采用 M TT方法测定了 A1
的抗肿瘤细胞活性 ,采用生物转化方法对其生物合
成机制进行了初步研究 .
图 1　 TM C和其类似物的化学结构
Fig. 1　 St ructu re of TM C and i t s analogu e
1　实验仪器与材料
1. 1　实验仪器
摇床 (美国 N BS, E25R) ; 旋转蒸发仪 (瑞士
Buchi R200) ; 冷冻干燥机 (德国 Christ Alpha 1-
4) ; 高效液相色谱仪 (美国 Agilent 1200-DAD);核
磁共振仪 ( Bruker Avance-400) ;质谱仪 ( Agi lent
1100M SD) .
1. 2　实验材料
研 究 所 采 用 的 发 酵 菌 株 Streptomyces
Griseochromogenes 及生物转化用两个突变株
( (ΔtauO 及 Δtau K )由本实验室保存 . 其中 ,
ΔtauO突变株由于 tauO基因破坏 , 使得无法合成
C8环从而破坏了 TMC的合成 ; 而在 ΔtauK突变
株中 C8与聚酮链的连接由于酯酶 TauK的失活
而无法连接 , 从而使得 TMC的合成被终止 .
发酵需要的培养基及其试剂购买自北京奥博
星公司 ; 柱层析用硅胶 (青岛海洋化工厂分厂 ,
75μm); ODS分析柱 ( Agilent公司 , 4. 6 mm×
150 mm ZORBAX-SB-C18柱 , 5μm); O DS半制
备柱 ( Agilent公司 , 9. 4 mm× 250 mm ZORBAX-
SB-C18柱 , 5μm);所用的化学试剂均为分析纯或
色谱纯 .
2　实验方法
2. 1　发酵生产
取 100μL冻存于 20% 甘油的 Streptomyces
Griseochromogenes孢子直接接入 50 mL的胰酶大
豆肉汤种子培养基 ( TSB) , 在 28℃ 和 220 rpm下
培养 24 h; 然后按 5% 的接种量转接入 1 L发酵
培养基中 ( 2% 可溶性淀粉 , 1% 葡萄糖 , 2. 5% 豆
粉 , 0. 4% 干酵母 , 0. 1% 牛肉膏 , 0. 2% 聚蛋白
胨 , 0. 5% 碳酸钙 , 0. 2% 氯化钠 , 0. 005% 磷酸
氢二钾 , 0. 000 1% 氯化钴 , pH调节至 7. 0) , 于
相同条件下继续培养 96 h, pH自然 .
2. 2　提取及分离
将发酵液 4 000 rpm离心 20 min, 收集菌丝
体和上清液 ( L1 ) , 菌丝体用丙酮浸泡 2 h, 离心收
集上清液 ;旋转蒸发去除上清液中的丙酮 , 得到溶
液 ( L2 ) , 将 L1和 L2合并 , 用 1 mo l /L HCl调节
pH至 4. 0, 用乙酸乙酯萃取 ;减压浓缩萃取液得
粗品 . 用三氯甲烷作为溶剂溶解粗品 , 加样于硅
胶柱 , 依次用 CHCl3-M eOH 100∶ 1, 75∶ 1,
50∶ 1, 30∶ 1, 20∶ 1, 10∶ 1洗脱 , 分管收集洗脱
液 , 用 HPLC分析检测 ; 将含有 TMC及其类似
物的组分收集 , 减压浓缩后上样于半制备柱 , 用
70% 的乙腈水溶液洗脱 , 流速 2 mL /min; 洗脱液
去除乙腈后冷冻干燥分别得到 TMC, 3’ -脱羟基
TMC和 A1纯品 .
449(总第 150期 ) 变构菌素类似物的分离鉴定及其生物合成机制 (孔日祥等 )
2. 3　 A1的光谱分析
将 A1溶于乙腈进行 UV和 MS测定 , 溶解
于氘代氯仿中进行 NMR测定 , 而采用薄膜法进
行 IR测定 .
2. 4　 A1的生物转化试验
将 A1用乙腈配制成一定浓度后直接加入到
已培养 48 h的两种突变株培养物内 (培养条件同
发酵条件 ) , 用 HPLC检测 A1在 48 h内的生物
转化情况 , 并用化合物 4(图 3中 4)作为阳性对
照 .
2. 5　 A1的抗肿瘤活性测定
采用人体肿瘤细胞 HCT-15作为测试菌株 ,
按照常规 M T T方法进行 TMC及 A1的 IC50值测
定 .
3　结果与讨论
3. 1　 A1的发酵生产
在 TMC的发酵过程中 , 伴随着主产物 TMC
的生物合成有两个主要的代谢副产物也逐步合成
( A1和 3’ -脱羟基 TMC). 随着培养过程中控制
溶解氧的升高 , 3’ -脱羟基 TMC和 A1的产量基
本上保持不变 ; 当溶解氧降低或者培养基葡萄糖
起始浓度提高至 3% 时 , TMC 和 3’ -脱羟基
TMC的生物合成均受到抑制 , 而 A1则大量合成 .
在此基础上分离得到 A1,并对其进行结构鉴定 .
3. 2　结构解析
A1, 无色油状固体 , 易溶于甲醇、 乙腈、 氯
仿 , 难溶于水 . 由 ESI-M S中两种模式下不同的
准分子离子峰 m /z 654. 3 [M+ Cl ]- , m /z 620. 5
[M+ H]
+及 m /z 642. 4 [M+ Na ]+ , 确定其分子
量是 619. 根据氮原则 , 分析得 A1中应该含有奇
数个 N原子 . 在 A1测试的红外光谱图中 (略 ) ,
1 666 cm
- 1的吸收带可以间接说明化合物中存在
酰胺基团 .
从 A1的 NMR图谱中可以看出 , A1和
TMC具有非常接近的图谱结构 , 可以基本确认它
们 具有相同的 主体结构 . 相 比于 TMC 的
1H-NM R, A1图谱中共有 41个质子信号和 34个
C信号 , 分别比 TMC的 NMR多两个信号和一
个信号 . A1的 1 H-NMR图谱有三个主要变化:
① C8环上 C-3’ 的氢信号丢失 , 而在 W2. 71处观
察到两个 H( 2H, m )的信号 , 因此可以推断 C3’位
缺少羟基 ; 而且 , 这种丢失在 3’ -脱羟基 -TMC也
得到验证 . ② 在 A1中无法观察到 TMC中 C-4
的单峰信号 , 相反可以发现一个三重峰信号
(W5. 83, 1H, t, J= 7. 4 Hz) ; 而且比原来的信号中
增添了两个 H信号 , 因此可以显示出 C5位缺少
酮基 ; 对应的 C6-CH2和 C7-CH信号往高场移动 .
③ TMC的 3-vinyl-CH的 dd峰以及 3-viny l-CH2
的两个双峰在 A1图谱中观察不到 , 可以确认在
此处也有结构上的变化 ; 相反在 W7. 16和 W5. 79
化学位移处 A1中出现两个 H的信号 (均为 1 H,
d, J= 15. 5 Hz) , 这两个信号构成了顺式双键结
构 , 因此多余的 1个含 C官能团应连接在此处 .
与之相对应的 13 C-NM R中 , C-3’ , C-5, C-a, C-b
的信号均发生了明显的移动 . 因此可以初步认为
A1是 C3’缺失羟基 , C-5位缺失酮基 , 而在共轭
双键处形成酰胺的结构 . 随后又进行了 A1的
HMBC, HMQC,
1
H-
1
H CO SY分析测定 (图 2) ,
并进行了确证 . 结合上面的推断以及 TMC与 3’ -
脱羟基 TMC的 1H-NM R, 13 C-NM R图谱 , 对 C,
H信号进行进一步归属 (表 1) , 并确定 A1为
TMC的酰胺类似物 , 其化学结构如图 1所示 , 分
子式是 C34 H53NO9 .
图 2　化合物 A1的 HMBC和 CO SY相关图
Fig. 2　 HM BC and COSY correlat ion diag ram of compound A1
450 中 北 大 学 学 报 (自然科学版 ) 2013年第 4期
表 1　化合物 A1的核磁数据 ( CDCl3 )
Tab. 1　 NM R data of com pound A1 in CDCl3
Post ion WH WC Postion WH WC
C-1 1. 01( 3H, dd, J= 8. 9, 4. 6 Hz) 13. 41 C-13 2. 63( 1H, m) 52. 77
C-2 2. 24( 2H, dd, J= 14. 9, 7. 3 Hz) 19. 83 13-CH3 1. 08( 3H, d, J = 7. 0 Hz) 13. 58
C-3 - 138. 45 C-14 - 215. 3
C-a 7. 16( 1H, d, J = 15. 5 Hz) 146. 85 C-15
2. 39( 1H, dd, J = 12. 6, 4. 2 Hz)
2. 83( 1H, dd, J = 15. 8, 8. 5 Hz)
46. 69
C-b 5. 79( 1H, d, J = 15. 5 Hz) 115. 86 C-16 4. 17( 1H, m) 66. 18
C-c - 170. 35 C-17 1. 58( 1H, m) 42. 78
C-4 5. 83( 1H, t, J= 7. 4 Hz) 142. 14 17-CH3 0. 91( 3H, d, J = 7. 0 Hz) 9. 13
C-5 2. 18( 2H, m) 26. 04 C-18 4. 93( 1H, m) 73. 19
C-6 1. 37( 2H, m) 37. 04 18-CH3 1. 22( 3H, d, J = 6. 3 Hz) 17. 93
C-7 1. 24( 1H, m) 29. 71 C-1’ - 171. 86
7-CH3 0. 85( 3H, d, J = 6. 6 Hz) 19. 28 C-2’ 2. 76( 2H, m) 19. 91
C-8 1. 08( 2H, m) 44. 77 C-3’ 2. 71( 2H, m) 31. 32
C-9 1. 50( 1H, m) 29. 96 C-4’ - 142. 36
9-CH3 0. 83( 3H, d, J = 6. 6 Hz) 19. 38 C-5’ - 142. 15
C-10 1. 30( 2H, m) 32. 95 C-6’ - 165. 90
C-11 1. 39( 2H, m) 31. 73 C-7’ - 165. 74
C-12 3. 72( 1H, m) 73. 72 5’ -CH3 2. 13( 3H, s ) 9. 74
3. 3　 A1的生物活性
研究表明 , 相比于 TMC, 对于 HCT-15肿瘤
细胞 A1具有较低的抗肿瘤活性 (二者的 IC50值分
别是 0. 4μm和 70μm) , 这可能与其 C3’位缺少
羟基 , C5位缺少酮基有关 [10 ] .
3. 4　 A1的生物合成机制
与 TMC的生物合成相同 , A1的生物合成也
包括 4步 (图 3): ① C8环的生物合成 ;② C8与
聚酮链的连接 ; ③ 聚酮链的延伸与终止 ; ④ 聚酮
链的后修饰步骤 . 在未对 TauF, TauD及 TauI进
行功能定位前 , A1就已经从野生型中分离获得 .
A1的结构中 C5-OH的缺失以及聚酮链共轭双键
的形成 , 可以充分说明 TMC的生物合成后修饰
过程必须是先脱水 , 再脱羧 , 然后 C5氧化的先后
顺序 , 而 C3’ -OH的缺失证明 C8环的形成应该
在 PKS链终止前形成 . 目前 , Tau F, TauD及
TauI的基因功能定位已完成 [8-9 ] , 与最初的假设
完全一致 . 然而 , A1中酰胺基的形成必须经过酰
胺化的过程 , 这种现象在一般的聚酮类化合物的
生物合成中比较少见 ; 而且 , 在现有的灰产色链
霉菌的生物合成基因序列以及已发现的蛋白功能
上 , 并没有发现可以完成酰胺化的酶或者 PKS中
TE酶是否也可以完成这步功能 , 这还需要进一步
的研究 .
图 3　 A1的生物合成路径
Fig. 3　 Biosynthesis pathw ay of A1
研究中 , 为了进一步证明 A1是否是生物合
成的终端产物 , 本文对 A1进行了 TMC突变株
(ΔtauO及 Δtau K )的一系列生物转化试验 , 并用
化合物 4(图 3)作为阳性对照 . 结果表明: A1在
两株突变株内的培养中 , 尽管延长了转化时间 ,
但均未能转化为对应的 3’ -羟基 TMC, 而化合物
451(总第 150期 ) 变构菌素类似物的分离鉴定及其生物合成机制 (孔日祥等 )
4在 24 h内均可以合成对应的 3’ -羟基 TMC, 从
而说明 A1必须是 TMC合成的代谢副产物或终
端产物 , 而非中间产物 . A1的生物合成必须来自
于变构菌素合成过程中的异常生物合成 .
4　结　论
作者从 TMC发酵生产过程中分离得到一种
全新的结构类似物 A1, 并完成了其结构确证和活
性分析 . 鉴于 A1的独特化学结构 , 可以直接推断
出 TMC的后修饰步骤的先后顺序 . 由于能直接
完成酰胺化作用的聚酮类抗生素的生物合成比较
少见 , 究竟是哪个酶完成聚酮链的酰胺化仍需要
进一步研究 . 即便如此 , A1的分离也为今后深入
研究 TMC的生物合成机制以及采用组合生物合
成方法获得其它新型的结构类似物带来启示 .
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452 中 北 大 学 学 报 (自然科学版 ) 2013年第 4期