全 文 ：第 25卷第 1期
2006年 1月
水 产 科 学
F ISH ERIES SCIENCE Vol.25 No.1Jan.2006
灰树花多糖对鲫鱼免疫功能的影响
王高学1 ,白 冰1 ,崔 婧1 , 李西汉2
(1.西北农林科技大学 动物科技学院 , 陕西 杨凌 712100;2.陕西省兽药监察所 , 陕西 西安
710016)
摘 要:以灰树花多糖(Polysaccharide of Gri fola f rondosa , PGF)药饵连续投喂鲫鱼 35 d , 通过测定血清凝集抗体
效价 、超氧化物歧化酶(Superoxide dismu tase , SOD)活性 、离体白细胞吞噬活性(phagocytic activi ty)、吞噬细胞杀菌
活性(bactericidal act ivi ty),研究灰树花多糖对水产动物特别是鲫鱼免疫功能的影响。试验设计以不同剂量(分别为
250 m g/ kg 鱼体重 、400 mg/ k g 鱼体重 、500 mg/ kg 鱼体重 、600 mg/ kg 鱼体重 、1000 m g/ kg 鱼体重)的灰树花多糖药
饵饲喂试验鲫鱼 ,分别于第 0 、7 、14 、21 、28 、35 d用血凝板法 、MT T 染色法进行免疫学指标测定。结果表明 ,各添
加水平均可增强鲫鱼的免疫功能 ,其中剂量为 400 mg/ kg 、500 mg/ k g 和 600 mg/ kg 的吞噬活性及杀菌活性与对照
组相比存在极显著性差异(P <0.01),而剂量为 250 mg/ kg 、1000 mg/ kg 时 ,杀菌活性均与对照组相比存在显著性
差异(P <0.05);400 mg/ kg 组 、500 mg/ kg 和 600 mg/ kg 组的 SOD 活性与对照组相比存在极显著性差异(P <
0.01);400 m g/ kg 组 、500 mg/ kg 和 600 m g/ kg 组的血清凝集抗体效价最高为 1∶256 , 250 mg/ kg 和 1000 mg/ kg 组
的血清凝集抗体效价最高为 1∶32。各项指标的峰值出现在第 2～ 3周。
关键词:灰树花多糖;鲫鱼;免疫功能
中图分类号:S965.117 文献标识码:A 文章编号:1003-1111(2006)01-0009-04
收稿日期:2005 07 18. 作者简介:王高学(1965 ),男 ,副教授 ,硕士生导师;主要研究方向:生物工程制药.
灰树花多糖(Poly saccharide of Gri f ola f rondosa ,
PGF)是从真菌灰树花中提取的一种生物活性多糖。灰树
花(Gri f ola f rondosa)又名贝叶多孔菌 、栗蘑 、莲花菌 , 日
本俗称舞蘑。分类学上属担子菌纲 , 多孔菌科 , 树花菌属 ,
是一种药 、食兼用的珍稀食用菌。 近 20 年来 , 国内外深入
开展了作为生物反应调节剂的真菌多糖的研究 , 灰树花多
糖显著的疗效也逐渐被人们所认识。经过大量的化学和药
理分析发现 ,灰树花多糖具有明显的抗肿瘤 ,抗 HIV 病毒 ,
改善免疫系统功能 , 调节血糖 、血脂及胆固醇水平 , 降血压
等作用[ 1 ～ 4] , 且无任何毒副作用 , 是一种极具开发潜力的珍
贵食 、药用真菌[ 2] 。 因此 , 很多学者对其进行了大量研究 ,
但试验对象多为哺乳动物 ,而有关灰树花多糖应用在水产
动物上的研究目前尚未见报道。因此 , 为探讨灰树花多糖
对水产动物免疫系统的作用及其在水产养殖上的应用性 ,
本研究以灰树花多糖为研究对象 , 以鲫鱼为试验材料 ,研究
多糖对鱼类免疫系统的增强效果 , 以期为进一步开发出新
一代 、无公害渔药提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
灰树花多糖 ,含量 32 %, 由西安恩慈制药厂提供;健康
鲫鱼(Carassius auratus), 平均体重为(42 ±3)g , 雌雄随
机 , 由陕西省水产研究所渔场提供;肠形点状气单胞菌
(Aeromonas punctata f .interinalis)、 鳗 弧 菌( Vibrio
anguillarum)均由中国科学院水生生物研究所鱼病室细菌
组提供 , 金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)由西北农
林科技大学水产实验室提供。肝素钠购于天津生物化学制
药厂;淋巴细胞分离液购于上海华精生物高科技有限公司;
M TT 购于 Sigma 公司;MEM 培养基购于 Gibco 公司;SOD
试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 药饵的制作及分组 药物剂量按每千克鱼体重来
添加制作药饵 , 剂量分别为 250 mg/(kg · d)、400 mg/
(kg· d)、500 mg/(kg · d)、600 mg/(kg · d)、1000 mg/
(kg· d), 标记为 1～ 5 组。
1.2.2 试验动物的处理 选择体色鲜亮 、体表无病无伤 、
体格健壮的鲫鱼 ,经过 30 d 的暂养消除干扰因素 , 分 6 组进
行试验。每组 15 尾 ,置于相同水环境中 , 控制水温为(25±
1 )℃。其中 1 ～ 5 组为试验组 , 6 组为对照组。投饵率为
1 %,每日换一定量的新水 ,连续饲养 35 d。
1.2.3 菌悬液的制备 对试验使用的肠形点状气单
胞菌 、鳗弧菌 、金黄色葡萄球菌分别接种普通肉汤培养 , 平
板计数法计数后再用生理盐水稀释至 1.0×108 cfu/ ml。 于
金黄色葡萄球菌 、鳗弧菌菌悬液中加入福尔马林灭活 24 h。
均置 4℃保存备用。
1.2.4 采血 于投喂多糖药饵的第 0 、7 、14 、21 、28 、35 d
对各组试验鱼随机取样 , 每组取 3 尾。用一次性注射器进
行尾静脉采血 , 抽取测定血清凝集抗体效价所需的血液 0.2
ml ,再用吸有肝素钠的注射器抽取测定白细胞吞噬活性及
杀菌活性所需的抗凝血 0.5 ml。
1.2.5 白细胞悬液的制备 将备用的 0.5 ml抗凝血加注
到装有 0.8 ml淋巴细胞分离液的大离心管中 , 按照余氵贺
等[ 5]的方法 , 以 2500 r/min 的转速离心 15 min 后 , 吸取白
细胞层 , 用 Hanks 液将细胞浓度调整至 1×107/ ml ,并按照
DOI :10.16378/j.cnki.1003-1111.2006.01.003
司徒镇强等[ 6]的方法检测白细胞活率 ,活细胞不少于 90%。
1.2.6 血清抗体凝集效价及 SOD活性测定 取 0.5 ml上
述血样置于 1.5 ml离心管中 , 2000 r/ min ,离心 10 min 分离
血清。一部分血清用灭活的金黄色葡萄球菌 、鳗弧菌为反
应抗原 ,采用血凝板法进行血清抗体凝集效价的测定。 取
另一部分血清按照 SOD 检测试剂盒说明的方法使用紫外
分光光度计测定 SOD 活性。
1.2.7 白细胞吞噬活性的测定 取制备的 100 μl白细胞
悬液 ,参照陈昌福[ 8]等的方法进行吞噬活性的测定。
1.2.8 白细胞杀菌活性的测定 另取 400 μl的白细胞悬
液 ,参照陈昌福等[ 8]的方法进行杀菌活性的测定。
2 结果
2.1 血清凝集抗体效价
由表 1 可见 , 从投喂后第 7 d 开始 , 400 mg/ kg 组 、500
mg/ kg 组和 600 mg/ kg 组均表现出较高抗体水平并于第 21
d达到峰值 1∶256 , 之后则呈平缓下降趋势。而 250 mg/kg
组和 1000 mg/ kg 组于第 14 d 达到峰值 1∶32 , 但峰值明显
低于 400 mg/ kg 组 、500 mg/kg 组和 600 mg/kg 组。 6 组作
为对照组一直维持在较低抗体水平。
2.2 SOD 活性
由表 2 可见 , 从第 7 d 开始 , 400 mg/ kg 组 、500 mg/kg
组和 600 mg/ kg 组鲫鱼 SOD 活性增强 , 与对照组相比存在
极显著性差异(P <0.01), 500 mg/ kg 组在投喂的第 14 d
出现峰值(97.68 ± 0.65)U/ ml , 400 mg/ kg 组和 600 mg/
kg 组在第 21 d 出现峰值(86.43±0.16)U/ ml和(87.59 ±
0.43)U/ml。而 250 mg/kg 组和 1000 mg/ kg 组与对照组
相比则无明显变化。
2.3 白细胞的吞噬活性
试验结果表明 , 从投喂第 7 d 开始 400 mg/ kg 组 、500
mg/kg 组和 600 mg/ kg 组鲫鱼白细胞吞噬活性增强 , 其吞
噬活性与对照组相比表现出显著性差异(P <0.05), 500
mg/kg 组在第 14 d 即达到吞噬峰值 , 而 400 mg/kg 组和
600 mg/ kg 组于第 21 d达到吞噬峰值。而 250 mg/ kg 组和
1000 mg/kg 组与对照组相比则无明显变化。
2.4 吞噬细胞的杀菌活性
由表 3看出 , 从第 7 d 开始 , 1～ 5 组鲫鱼吞噬细胞杀菌
活性均增强 , 其中 250 mg/ kg 组 、1000 mg/ kg 组与对照组
相比存在显著性差异(P <0.05), 而 400 mg/ kg 组 、500
mg/kg 组和 600 mg/ kg 组与对照组相比存在极显著性差异
(P <0.01)。 250 mg/ kg 组 、500 mg/ kg 组和 600 mg/ kg组
在第 14 d 达到峰值 , 400 mg/ kg 组和1000 mg/ kg 组在第21
d 达到峰值。
表 1 不同剂量灰树花多糖投喂鲫鱼后的血清凝集抗体效价
组别 不同天数的凝集抗体效价
0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d
1
J 2.8(2～ 4) 7.3(4～ 8) 12.0(8～ 32) 8.0(4～ 8) 11.1(8～ 32) 12.1(8～ 32)
M 3.1(2～ 4) 6.8(4～ 8) 12.0(8～ 32) 9.3(4～ 32) 12.0(4～ 32) 8.0(8～ 8)
2
J 2.8(2～ 4) 62.2(32～ 64) 122.5(64～ 128) 175.7(128～ 256) 84.5(32～ 128) 65.5(16～ 128)
M 3.2(2～ 4) 42.0(16～ 32) 135.7(64～ 128) 186.8(128～ 256) 120.0(64～ 128) 72.3(32～ 128)
3
J 2.7(2～ 4) 113.4(64～ 128) 171.4(64～ 256) 185.2(64～ 256) 163.1(64～ 256) 86.1(32～ 128)
M 3.0(2～ 4) 128.5(64～ 256) 180.2(64～ 256) 201.3(128～ 256) 117.3(64～ 128) 92.5(32～ 128)
4
J 2.6(2～ 4) 24.3(16～ 32) 113.5(64～ 128) 127.0(64～ 128) 118.4(32～ 128) 85.7(64～ 128)
M 3.0(2～ 4) 24.3(32～ 64) 102.2(32～ 128) 183.4(64～ 256) 133.5(64～ 128) 76.3(32～ 128)
5
J 2.8(2～ 4) 12.1(8～ 32) 19.8(8～ 32) 13.2(8～ 16) 15.7(8～ 16) 8.0(8～ 8)
M 3.1(2～ 4) 11.6(8～ 32) 23.0(16～ 32) 22.8(16～ 32) 18.3(8～ 32) 9.5(8～ 16)
6
J 2.9(2～ 4) 3.1(2～ 4) 3.5(2～ 4) 2.8(2～ 4) 2.8(2～ 4) 3.0(2～ 4)
M 3.1(2～ 4) 2.7(2～ 4) 4.0(2～ 8) 3.2(2～ 4) 3.0(2～ 4) 3.1(2～ 4)
注:J:金黄色葡萄球菌 M:鳗弧菌 表中数据表示几何平均数
表 2 不同剂量灰树花多糖投喂鲫鱼后不同天数的 SOD活性
组别 不同的天数 SOD 活性/U ·ml
-1
0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d
1 24.35±0.23 41.23±0.19 39.69±0.38 43.46±0.61 4 0.11±0.51 31.04 ± 0.41
2 26.24±0.25 65.59±0.52＊ 73.69±0.19 ＊＊ 86.43±0.16 ＊＊ 74.36±0.35＊＊ 68.48 ± 0.34 ＊
3 24.49 ± 0.35 71.24 ± 0.29＊＊ 97.68 ± 0.65＊＊ 84.27 ± 0.26＊＊ 80.14± 0.48＊＊ 73.42 ± 0.36＊＊
4 26.13 ± 0.28 65.42 ± 0.39＊ 74.81 ± 0.32＊＊ 87.59 ± 0.43＊＊ 74.41 ± 0.18＊＊ 67.56 ± 0.44＊
5 26.25 ± 0.34 39.03 ± 0.68 41.16 ± 0.43 42.37 ± 0.27 41.11 ± 0.53 31.04 ± 0.26
6 26.49±0.63 38.39±0.54 39.43±0.24 41.83±0.64 40.32±0.0.51 29.61 ± 0.41
注:和 6组比较 , ＊表示显著性差异 , ＊＊表示极显著性差异(下表同)
10 水 产 科 学 第 25卷
表 3 受免鲫鱼离体白细胞吞噬活性的变化
组别 不同天数的吞噬活性
0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d
1 0.342±0.005 0.348±0.009 0.343±0.009 0.346±0.007 0.342±0.005 0.344±0.005
2 0.341±0.004 0.402±0.012＊ 0.477±0.018＊ 0.601±0.010 0.586±0.012＊＊ 0.455±0.008＊
3 0.343±0.007 0.514±0.009＊＊ 0.589±0.008＊＊ 0.574±0.013＊＊ 0.561±0.010＊＊ 0.555±0.010＊＊
4 0.341±0.004 0.393±0.013 0.442±0.013＊ 0.573±0.008＊＊ 0.554±0.009＊＊ 0.467±0.007＊
5 0.342±0.004 0.365±0.005 0.386±0.004 0.401±0.007＊ 0.392±0.006 0.387±0.005
6 0.340±0.006 0.339±0.005 0.338±0.003 0.341±0.004 0.342±0.006 0.342±0.006
表 4 受免鲫鱼吞噬细胞杀菌活性的变化
组别 不同天数的杀菌活性
0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d
1 0.985±0.006 0.962±0.004 0.766±0.005＊ 0.775±0.005＊ 0.794±0.006＊ 0.783±0.004＊
2 0.985±0.004 0.841±0.004＊ 0.538±0.007＊＊ 0.512±0.010＊＊ 0.584±0.009＊＊ 0.627±0.007＊
3 0.983±0.007 0.783±0.006＊ 0.281±0.012＊＊ 0.303±0.008＊＊ 0.349±0.006＊＊ 0.331±0.007＊＊
4 0.984±0.004 0.838±0.006＊ 0.496±0.010＊＊ 0.532±0.007＊＊ 0.548±0.005＊＊ 0.579±0.006＊＊
5 0.985±0.005 0.957±0.005 0.745±0.009＊ 0.723±0.007＊ 0.758±0.005＊ 0.799±0.008＊
6 0.988±0.003 0.980±0.004 0.984±0.003 0.985±0.004 0.987±0.004 0.982±0.005
3 讨论
本试验采用的灰树花多糖是从一种名为灰树花的真菌
中提取得到的 ,灰树花是一种药 、食兼用的珍贵菌类 , 营养
丰富 ,易于获得。已有报道 , 灰树花多糖提取物是一种 β -
葡聚糖[ 9] ,具有调节机体免疫力和抗肿瘤活性。大量报道
显示 ,灰树花多糖提高机体免疫力的作用是多方面的 ,不仅
能够提高机体的非特异性免疫 , 而且能够提高机体的特异
性免疫功能 ,它可激活自然杀伤细胞(NK)、细胞毒 T 细胞 ,
促进巨噬细胞的活性 , 并刺激巨噬细胞加速释放细胞因
子[ 10] 。 Nanba[ 11]等研究了灰树花 D—组份对小鼠机体的免
疫激活作用 ,发现小鼠体内自然杀伤细胞 ,细胞毒 T 细胞 ,
迟敏 T 细胞均被激活 1.5～ 2.2 倍 , Ⅰ L-1 、Ⅰ L-2 和超氧
负离子含量均得到不同程度的提高 , 而且腹腔注射和口服
均有效;李小定[ 12]等研究发现灰树花均一多糖 PGF-1 经
口服给药能全面增强荷瘤小鼠的非特异性免疫 、细胞免疫
及体液免疫功能 , 即不仅能显著增加荷瘤小鼠免疫器官的
重量 ,且能明显增强 1%二硝基氟苯(DNFB)引起的迟发型
超敏反应作用 ,提高荷瘤小鼠淋巴细胞转化能力与脾抗体
生成能力 , 以及血清溶血素 IgG 、IgM 的含量。 Adachi Y[ 13]
观察到小鼠静脉注射灰树花多糖 4 ～ 7 d 后 , 小鼠枯氏细胞
产物-细胞因子和 NO 含量明显提高。 Zhuang C[ 14] 和
Okazaki M [ 15]的研究均证实灰树花多糖可以刺激巨噬细胞
加速释放细胞因子。
为探讨灰树花多糖对水产动物机体免疫功能的作用 ,
本试验经对鲫鱼投喂自制的灰树花多糖药饵 ,于不同的投
喂天数分别检测鲫鱼的四项免疫指标。试验结果表明 , 经
投喂含灰树花多糖的药饵后 , 鲫鱼的血清凝集抗体效价 、
SOD活性 、离体白细胞吞噬活性 、吞噬细胞杀菌活性均较空
白饲料组有增高或加强 , 表明灰树花多糖确实具有增强水
产动物细胞免疫功能和体液免疫功能的作用 ,即免疫调节
功能 , 它可以极大地激活细胞免疫功能 , 提高机体免疫力。
本试验所设定的各剂量组的检测结果显示出 , 剂量为 400
mg/kg 、500 mg/ kg 和 600 mg/ kg 时效果最显著 ,而添加剂
量过高(1000 mg/ kg)或过低(250 mg/kg)效果均不显著 , 可
见并不是添加剂量越大越有效 , 添加量过大可能反而会抑
制免疫效果。因此 , 可得出 400～ 600 mg/ kg 体重为灰树花
多糖的最佳添加量。由于灰树花多糖所表现出的较强免疫
增强活性 , 有必要对其进行深入研究 ,并将其作为新的生物
反应调节剂进行开发和利用 , 特别是推广其在水产养殖领
域的应用。
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Effect of Polysaccharides from Gri f ola f rondosa on Immunological
Functions of Crucian Carp Carassius auratus
WANG Gao-xue1 , BAI Bing1 , CUI Jing1 , LI Xi-han2
(1.College o f Animal Science and Technology , Northwest Sci-Tech Unive rsity of Ag riculture and Fo restry , Yang ling 712100 ,
China;2.The I stitute o f Shanx i P rov incial Veterina ry D rug Contr ol , Xian 710016 , China)
Abstract:Crucian carp (Carassius auratus)were fed wi th the medicated feed containing po ly saccharide
f rom Gri f ola f rondosa(250 mg/kg , 400 mg/kg , 500 mg/kg , 600 mg/kg and 1000 mg/kg)for 35 days
and analy sed fo r agg lutinating antibody t iter , supero xide dismutase (SOD)activi ty , phagocy tic activi ty
and bacte ricidal activi ty on day 7 , 14 , 21 , 28 and 35 by the agglutinate board method and M T T dying
method to investig ate the effect o f polysaccharide of Gri f ola frondosa on immunolog ical funct ion of cru-
cian carp.The resul ts show ed that the po ly saccharide of Gri fola f rondosa enhanced the immune o f the
fish.There w ere significant dif fe rence in phagocy tic activity , SOD activi ty and bactericidal activity (P <
0.01)in the 400 , 500 , and 600 mg/kg g roups compared w ith the control group.In the 250 and ,1000 mg/
kg , how ever , there w ere signif icant dif ference in bactericidal activity(P <0.05).The maximum aggluti-
nating antibody t iter of 1∶256 occurred in 400 , 500 and 600 mg/kg groups.In the 250 , and 1000 mg/kg
groups , the maximum agglutinating antibody titer w as 1∶32.The climax of every index w as observed
from w eek 2 to w eek 3.
Key words:poly saccharide of Gri fola f rondosa;Carassius auratus;immuno logical funct ion
(责任编辑:晓 荷)
12 水 产 科 学 第 25卷