全 文 ：浙江中医药大学学报 2014年 10月第 38卷第 10期
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2014
论
著
山核桃（CaryacathayensisSarg.）又名小核桃，是胡
桃科（Juglandaceae）山核桃属的一种落叶乔木，是我
国特有的名优干果和木本油料作物，主要分布在浙
皖交界的天目山区[1]，其中浙江临安地区分布最为广
泛，是浙江特有的一种经济作物。山核桃是一种药食
两用的植物，民间将山核桃入药的历史由来已久。本
实验室长期从事山核桃叶的研究工作，并从中分离
鉴定出含量较高的 5种黄酮苷元物质，分别是汉黄
芩素、白杨素、球松素查尔酮、小豆蔻明和松属素[2]。
经过进一步的研究发现，山核桃叶总黄酮苷元具有
抗肿瘤[3-4]、抗心肌缺血和抗氧化[5]、抗动脉粥样硬化
[6]、抗炎镇痛[7]等药理生理活性。检索文献未见黄酮
类化合物具有明显毒性，且国内外对山核桃叶的研
究甚少，本研究将在前期的工作基础之上，进一步对
山核桃叶总黄酮苷元的急性毒性进行实验研究，为
阐明山核桃叶总黄酮苷元的毒效关系奠定基础，同
时也为深入的药理实验和临床用药提供实验依据。
1 材料
1.1 实验药物 山核桃叶于 2012 年 11 月采自浙
江省临安市，经浙江中医药大学生命科学学院丁志
山教授鉴定，为胡桃科（Juglandaceae）植物山核桃的
叶子。山核桃叶干粉用 95%的乙醇提取，提取液用聚
酰胺树脂吸附，40%乙醇洗脱，蒸干即得试药。此部
位包含有汉黄芩素、白杨素、球松素查尔酮、小豆蔻
明和松属素，分别以五种化合物的标准品为对照，
HPLC法作出标准曲线，得山核桃叶总黄酮苷元的纯
度为 77.25%。受试药物用 1%的吐温 80生理盐水溶
液溶解，得山核桃叶总黄酮苷元混悬液。
1.2 实验动物 KM小鼠，雌雄各半，体重 18～22g，
购于浙江省医学科学院，动物实验条件合格证：
山核桃叶总黄酮苷元对小鼠的急性毒性研究
徐正虹 张坤 付宇航 史珍珍 俞杭苏 金波 蒋福升 丁志山
浙江中医药大学 杭州 310053
摘要：[目的]研究山核桃叶总黄酮苷元对小鼠的急性毒性作用。[方法]KM小鼠灌胃（ig）不同浓度的山核桃叶总黄酮苷元溶液，观察并记录小鼠饮食、
日常活动及死亡情况，利用改良寇氏法计算半数致死量（LD50）、最大耐受量（MTD），并通过 HE染色法观察小鼠肝脏、肾脏的病理切片，从而研究
山核桃叶总黄酮苷元对小鼠的急性毒性作用。[结果]实验过程中小鼠的饮食活动无异常，且无死亡现象发生，故无法得出山核桃叶总黄酮苷元对小
鼠的 LD50值，实验小鼠对山核桃叶总黄酮苷元的最大耐受量为 1130.7 mg·kg-1（相当于人用剂量 125.6 mg·kg-1），HE染色结果显示各组小鼠的肝
脏、肾脏均正常，无病变现象出现。[结论]山核桃叶总黄酮苷元对实验小鼠几乎无急性毒性作用。
关键词：山核桃叶；总黄酮苷元；急性毒性；最大耐受量；半数致死量；实验研究；中药
中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1005-5509（2014）10-1141-05
Acute Toxicity Test of the TotalFlavonoid Aglycon From the Leaves of CaryacathayensisSarg in Mice Xu Zhenghong, Zhang Kun, Fu Yuhang, et
al Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053), China
Abstract:[Objective ]To study the acute toxic effects of the total flavonoid aglycon from leaves of CaryacathayensisSarg. [Method ]Gavaging(ig) the mouse
with different concentrations of the total flavonoid aglycon from leaves of CaryacathayensisSarg, then observed and recorded the diet of mouse, daily
activities, the death numbers, so as to calculate the median lethal dose(LD50) and maximum tolerated dose(MTD). After that, we observed the mouse liver
and kidney biopsy by HE staining, with all these methods we could evaluate the acute toxicity of pecan leaf total flavonoid aglycone on mouse. [Results]
The diet of the mouse was normal, and there was no mice died, so there were no available LD50 values of the pecan leaf total flavonoid aglycone on mice,
the maximum tolerated dose was 1130.7 mg·kg-1(equivalent human dose 125.6 mg·kg-1), HE staining showed that every group of the mouse liver and
kidneys were normal. [Conclusions] The total flavonoid aglycon from the leaves of CaryacathayensisSarg has no toxic effects on mouse.
Key words: leaves of CaryacathayensisSarg; total Flavonoid Aglycon; acute toxicity; maximum tolerance dose; median ldthal dose; experimental study; TCM
————————
基金项目：国家自然科学基金（81303258）
Fund project: National Natural Science Fund（81303258）
通讯作者：丁志山，E-mail：zjtcmdzs@sohu.com
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DOI:10.16466/j.issn1005-5509.2014.10.022
浙江中医药大学学报 2014年 10月第 38卷第 10期
SYXK(浙)2008-0115；许可证：SCXK(沪)2008-0016。
小鼠饲养温度为 25℃，相对湿度为 40%～70%，自然
光照，专用饲料，自由饮水。
1.3 试剂 吐温 80（Sigma公司，批号：085K00961），
生理盐水（浙江省中医院购买），多聚甲醛(国药集团
化学试剂有限公司,批号 F20090113)，无水乙醇（天
津市永大化学试剂有限公司，批号：20131026），二甲
苯 （天津市永大化学试剂有限公司，批号：
20130911），苏木精（上海三爱思试剂有限公司，批
号：20070306），醇溶性伊红 Y（上海三爱思试剂有限
公司，批号：20070607），石蜡（上海华灵康复机械厂，
批号：130829）。
1.4 仪器 万分之一精密电子天平（AR2130 Ohaus-
Corp.Pine Brook，NJ,USA），恒温干燥箱（DGG-9070A
型，上海森信实验仪器有限公司），KD-BM生物组织
石蜡包埋机（浙江金华科迪仪器设备有限公司），
FINESSE 325 组织切片机（Thermo），KD-T电脑生
物组织摊烤片机（浙江金华科迪仪器设备有限公
司），ECLIPSE Ti-DH荧光倒置显微镜（Nikon）。
2 方法
2.1 半数致死量 LD50值测定 参照文献[8-9]，KM小鼠
饲养 3d，使其适应饲养环境，随机选取 20 只，雌雄
各半。实验小鼠分为 5组，每组 4只，实验前禁食
12h，自由饮水。将山核桃叶总黄酮苷元用 1%吐温80
生理盐水溶解，浓度为 20mg·mL-1，此为最高浓度给
药组，并在此基础上继续稀释得到 15mg·mL-1、10mg·
mL-1、5mg·mL-1、2.5mg·mL-1 4组不同浓度的山核桃总
黄酮苷元试药。5组样品分别灌胃（ig）给药，给药体积
为 0.4mL/10g。给药后观察并记录小鼠 7d内死亡情
况，确定山核桃叶总黄酮苷元对于小鼠的 0致死量
（Dn）和 100%致死量（Dm）。
2.2 最大耐受量（MTD）测定 由预实验结果可知，
各组小鼠均正常生长，无死亡情况出现，故无法计算
其半数致死量 LD50值。参照文献[10-11]，实验随机选
取 48 只 KM 小鼠，雌雄各半，随机分为 4 组，每组
12 只，分别为：空白对照组、溶媒对照组、给药组
（Ι）、给药组（ΙΙ）。空白对照组灌胃（ig）生理盐水；溶
媒对照组灌胃（ig）1%吐温 80 生理盐水；给药组（Ι）
灌胃（ig）山核桃叶总黄酮苷元溶液，浓度为 20mg·
mL-1；给药组（ΙΙ）灌胃（ig）山核桃叶总黄酮苷元溶
液，浓度为 20mg·mL-1，8h 后再 1 次灌胃（ig），各组
小鼠灌胃（ig）体积均为 0.4mL/10g。
给药后 1h内观察并记录小鼠的行为活动、皮毛
及眼口鼻的分泌液以及呼吸等生理状况，3h后再观
察 1次，之后持续 7d每天定时观察，记录 7d内小鼠
的饮食情况，且每 2d记录 1次小鼠体重。
2.3 病理学检查 实验期间死亡小鼠及时解剖，肉
眼观察其心、肝、脾、肺、肾等器官有无明显病变，并
把肝脏和肾脏固定在 10%中性福尔马林溶液中。肝
脏和肾脏做石蜡切片，HE染色，光镜下观察。
2.4 数据处理 实验结果中数据以平均数±标准差
（x±s）的形式表示，采用方差分析，用 SPSS16.0软件
处理，P<0.05 为有统计学意义，P>0.05 为无统计学
意义。
3 结果
3.1 半数致死量 LD50值测定 预实验期间，各组
小鼠均正常饮食、正常活动，无小鼠死亡情况出现，
故无法测定山核桃叶总黄酮苷元对小鼠的半数致死
量 LD50，见表 1。
3.2 最大耐受量（MTD）测定 测定得出山核桃叶
表 1 小鼠灌胃急性毒性死亡数及 LD50值
Tab.1 Lavage in mice to get the acute toxic deaths and LD50 value
组别 小鼠（只） 剂量（mg/kg） 死亡数（只） 死亡率（%） LD50及置信区间
1
2
3
4
5
5
5
5
5
5
800
600
400
200
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
无法测定
总黄酮苷元对小鼠最大耐受量为 1130.7mg·kg-1（相
当于成人剂量 125.6mg·kg-1）。实验期间，小鼠的日
常活动正常，且皮毛光泽、眼睛无不适症状出现，口
鼻分泌物没有明显变化，呼吸正常、无急促或缓慢
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束实验后脱颈椎处死小鼠，解剖，肉眼观察小鼠脏
器，发现各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾色泽艳丽，质
地鲜嫩，外观无明显变化。各组小鼠肝脏和肾脏的
石蜡切片采用 HE 染色，光学显微镜下观察其细胞
和组织结构，见图 1和图 2。由图 1可知，各组小鼠
肝小叶结构清晰，中央静脉血管内皮细胞结构无异
表 2 山核桃叶总黄酮苷元对小鼠饮食情况的影响
Tab.2 The influence of the total flavonoid aglycon from leaves of CaryacathayensisSarg to the diet in mice
第 1d（g） 第 2d（g） 第 3d（g） 第 4d（g） 第 5d（g） 第 6d（g） 第 7d（g）
空白组
溶媒组
给药（Ⅰ）
给药（Ⅱ）
79.1
88.4
95.2
78.7
84.1
88.1
101.7
84.2
74.6
68.5
77.1
75.0
78.0
74.9
72.8
73.3
77.0
68.1
66.8
65.2
70.9
65.3
71.5
73.7
85.0
77.4
71.2
64.6
表 3 山核桃叶总黄酮苷元对小鼠体重的影响（n=12，x±s）
Tab.3 The influence of the total flavonoid aglycon from leaves of CaryacathayensisSarg to on body weight in mice（n=12，x±s）
第 1d（g） 第 3d（g） 第 5d（g） 第 7d（g）
空白组
溶媒组
给药（Ⅰ）
给药（Ⅱ）
26.9±4.59
27.4±2.14
26.6±2.46
28.3±2.48
31.6±5.70
31.7±2.93
31.8±2.38
32.1±3.19
32.1±5.41
31.8±3.35
31.7±2.54
32.5±3.09
32.6±5.36
32.1±3.06
32.4±3.16
32.7±3.05
注：给药组与空白组和溶媒组比较，P＞0.05，无统计学意义。
Note: Dosage group compared with blank group and solvent group, P>0.05, there was no statistically significant difference.
现象出现。各组小鼠的饮食情况均正常，日间无差
异，小鼠体重出现正常增长现象。每隔 2d测定小鼠
体重，各组数据用 SPSS 软件处理，组间 P＞0.05，无
统计学意义。小鼠饮食情况和体重增长情况见表
2、表 3。
3.3 病理学检查 实验期间无小鼠死亡现象，结
图 1 小鼠肝脏切片 HE染色(x20)
Fig.1 Mice liver biopsy,HE staining（x20）
注：A1为空白组，B1为溶媒组，C1为给药（Ι）组，D1为给药（ΙΙ）组。
Note: A1 is blank group,B1 for solvent group,C1 for medicine (Ι) group, D1 for medicine (ΙΙ) group.
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图 2小鼠肾脏切片 HE染色
Fig.2 Mice kidney biopsy, HE staining
注：40倍镜下观察，A2为空白组，B2为溶媒组，C2为给药（Ι）组，D2为给药（ΙΙ）组。
Note: Microscopic observation at 40 times , A2 is blank group, B2 for solvent group, C2 for medicine(Ι) group, D2 for medicine(ΙΙ) group.
常，肝板结构正常，细胞未发生溶解或空泡化等现
象，肝窦清晰可见。且给药（Ι）组和给药（ΙΙ）组与空
白组和溶媒组相比无明显差异。图 2中各组肾脏组
织切片，如图示肾小球及肾小管上皮细胞结构无异
常，细胞排列致密。肾小球轮廓清晰，肾小球囊腔结
构完整，给药组与对照组相比，球内细胞数目无明
显增多，系膜未见增宽，且系膜细胞数量正常。以上
结果均表明给药（Ι）组、给药（ΙΙ）组、空白组和溶媒
组小鼠脏器均无病理组织学变化。
4 讨论
药物安全性评价是判断候选新药安全性的关键，药
物安全性评价结果是决定候选新药能否进入临床试
验的重要参照依据[12]。急性毒性一般是指 24小时内
单次或多次大剂量给予某药物时所出现的有害作
用，急性毒性试验可以提供药物对机体毒效应的初
步资料[13]。由此可见，药物毒理学研究在药物的安全
性评价中占有极其重要的地位和作用。
本实验结果显示小鼠对山核桃叶总黄酮苷元
的最大耐受量为 1130.7mg·kg-1（相当于成人剂量为
125.6mg·kg-1）。实验期间，小鼠活动饮食正常，实验
结束后，肉眼观察小鼠脏器均未发现明显病变现象，
肝脏和肾脏的病理切片也未发现细胞和组织异常。
研究结果表明，山核桃叶总黄酮苷元对小鼠几乎无
急性毒性作用。本实验仅专注于山核桃叶总黄酮苷
元对小鼠的急性毒性试验，在长期毒性方面还需进
行深入的实验研究。
国内外均有文献报道[14]，黄酮类化合物对心血
管疾病有较好的药理和生理活性，同时有文献报道
沙青子总黄酮对小鼠有毒性作用[15]，但毒性较低。可
见不同来源的黄酮类化合物是否具有毒性不可一概
而论。本次研究选用山核桃叶总黄酮苷元为研究对
象，结果表明山核桃叶总黄酮苷元对小鼠几乎无急
性毒性作用，为进一步开发利用山核桃叶总黄酮苷
元提供了实验基础和理论依据。
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