全 文 ：·研究论文 ·
[ 基金项目] 国家教育部“春晖计划”项目(编号:Z2004-2-15001);内蒙古自治区自然科学基金资助项目(编号:200408020908)　[ 作者简介] 刘
小玲 ,女 ,主任药师 ,电话:0471-6620060　[ 通讯作者] 刘小雷 ,男,教授 ,电话:0471-4306348 , E-mail:lx lei56 @126.com
广枣总黄酮体外抗CVB3病毒活性
刘小玲1 ,梁彬2 ,张勇1 ,刘小雷2 　(1.内蒙古自治区医院 ,内蒙古 呼和浩特 010018;2.内蒙古医学院药学院 , 内蒙古 呼和
浩特 010059)
[ 摘要] 　目的:研究广枣总黄酮(TFFC)体外抗柯萨奇 B 组 3型病毒(CVB3)作用及其作用机制 , 探究其作用靶点 ,为 TFFC 进
一步开发利用奠定基础。方法:采用差速贴壁法培养原代乳鼠心肌细胞 ,镜下观察心肌细胞搏动次数 , 使用α-actin 免疫组化
法鉴定培养心肌细胞的纯度;在细胞水平测定阳性药盐酸胍以及 TFFC 的药物毒性;以 CVB3感染心肌细胞建立病毒性心肌
炎细胞模型;M TT 染色分析 TFFC 对病毒感染后的 H ela细胞及心肌细胞是否有保护作用;病毒繁殖抑制实验比较不同分组
间 TCID50的差别以验证 TFFC 在 H ela细胞及心肌细胞上的抗病毒活性;测定各实验组心肌细胞培养上清液中心肌酶 LDH 、
CK-MB 的变化;测定各实验组心肌细胞培养上清液中肿瘤坏死因子 TNF-α含量的变化;运用逆转录聚合酶链式反应测定心
肌细胞内病毒相关基因的表达。结果:经过在 Hela细胞及心肌细胞水平的初筛 , 确定 TFFC 具有保护细胞免受 CVB3病毒侵
袭的作用。病毒繁殖抑制实验显示 TFFC 的高 、中剂量组 TCID50与病毒对照组 TCID50相差一个以上对数值;TFFC 能使心肌
酶(LDH 、CK-M B)的释放较病毒组显著降低(P<0.05),还可抑制被病毒感染的心肌细胞 TNF-α的分泌;同时 , TFFC 还可明
显抑制 CVB3相关基因 c-Myc、TNF-α、Fas 的表达。结论:通过建立病毒性心肌炎细胞模型 , 证实 TFFC 在体外细胞培养物上
具有抗 CVB3病毒活性作用。
[ 关键词] 　广枣总黄酮;CVB3病毒;心肌酶
[中图分类号] R96　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2007)12-1637-06
Anti-Coxsackievirus B3effects of Total Flavones of Fructus choerospondiatis in vitro
LIU Xiao-ling 1 , LIANG Bing2 ,ZHANG Yong1 ,LIU Xiao-lei2(1.Inner Mongolia Autonomous Region hospital , In-
ner Mongo lia Huhehao te 010018 , China;2.Depa rtment of pha rmacolo gy , Inner Mongolia Medical Co lleg e , Inner Mongolia Hu-
hehaote 010059 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　A cell-based assay w as established to resea rch effect o f To tal F lav ones of F ructus choer ospondia tis
(TFFC)on cox sackieviruses g roup B3(CVB3)-induced viral myocardiam and its action mechanism , w hich have facilita ted its
further development in clinical trials.METHODS　Ce ll-based viral myocardial model wa s established by using CVB3 to infect
ca rdiomyocytes.Cardiomyocy tes derived from neonatal mice w ere purified by differential adhesion me thod and cha racterized by
immunohistochemica l staining me thod.Their rhy thmica l beat w ere obse rved , too.Protection effects o f TFFC on virus-infected
Hela ce lls and cardiomyocy tes we re detected by M TT assay s.At the same time , its anti-virus activity wa s verified by compa ring
diffe rence o f TCID50 be tw een various g roups.In addition , changes of activities of LDH and CK-MB in cell-free re leastes were
mea sured by LDH kit and CK-M B kit , respectively.At last , the supe rna tants of cultured fluid in each expe rimental g roups
were analyzed to investig ate levels of TNF-αby usage o f the co r responding kits.RT-PCR assays w ere used to determine expres-
sion o f CVB3-associca ted genes in ca rdiomyocytes.RESULTS　The results o f primary screening based on CVB3-induced viral
myocardial model have desmonstrated tha t TFFC could protect Hela cells and cardiomyocy tes from CVB3 .TFFC at high and
middle do sages can significantly inhibit viral repr oduction , decrease r elease of LDH and CK-MB and suppress serection of TNF-
αfrom cardiomyocy tes infected by CVB3 .At the same time , TFFC could significantly inhibit expre ssion o f c-Myc、TNF-α、Fas
genes.CONCLUSION　The outcomes of cell-ba sed assay s have identified the anti-CVB3 activity o f TFFC in vitro.
KEY WORDS:TFFC;CVB3 ;LDH
　　广枣原为蒙医 、藏医常用药材 ,具有行气活血 , 养心安神的功效 ,用于气滞血淤 ,胸痹作痛 ,心悸气
·1637·中国医院药学杂志 2007年第 27卷第 12期 Chin H osp Pharm J , 2007 Dec , Vol 27 , No.12
短 ,心神不安等病症 。对广枣的成分分析发现 ,广枣
中含有糖 、氨基酸 、有机酸 、鞣质 、甾醇 、黄酮类及酚
性成分等[ 1] ,其有效成分广枣总黄酮(TFFC)是治
疗心血管系统疾病的主要活性成分[ 2-3] ,主要有抗心
律失常 ,Ca2+拮抗作用 ,改善心肌缺血 ,提高耐缺氧
能力 ,抑制血小板凝集 ,防止血栓形成 ,抗氧化作用
等几个方面。 TFFC的 Ca2+拮抗作用 ,改善心肌缺
血 ,提高耐缺氧能力以及其抗氧化作用都表明
TFFC 有很好的心肌保护作用 。病毒性心肌炎
(VMC)是以柯萨奇病毒性感染为主的临床常见心
脏疾患。在筛选具有抗柯萨奇 B 组 3 型病毒
(CVB3)病毒作用的中草药有效单体过程中 ,发现广
枣总黄酮在 VMC 细胞模型上具有低毒和明显的抗
CVB3病毒作用。本实验提取 、分离并纯化了广枣总
黄酮 ,并对其体外抗 CVB3病毒作用及机制进行了
研究 。
1　材料
免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司 ,
批号 SA1022);盐酸胍(中国华美生物工程公司 , 批
号 BR1366);IgG , IgM 试剂盒(北京中山生物技术
有限公司);酶标仪(Model680 , BIORAD 公司);
CO 2恒温细胞培养箱(MCO-15AC ,日本三洋公司);
水平电泳槽(Mupid-2 ,BIO 公司);PCR仪(美国 PE
公司);CVB3(中国科学院昆明病毒所 ,滴度:104.9
TCID50·0.1 mL -1);Hela 细胞(中国军事医学科学
院);TFFC(质量分数为97.0%以上 ,内蒙古大学化
学院);心肌细胞[ Wistar 新生乳鼠 ,内蒙古大学实
验动物中心 ,批准文号:SCXK(蒙)2002-0001] ;乳
酸脱氢酶试剂盒(中国华美生物工程公司 , 批号
031020);磷酸肌酸激酶试剂(中国华美生物工程公
司 ,批号 031104);噻唑蓝(MT T ,中国华美生物工
程公司 ,批号 BSO890);心肌细胞α-act in抗体(北京
中山生物技术有限公司 ,批号 31111003)。
2　方法
2.1　盐酸胍 、广枣总黄酮在 Hela细胞和原代培养
心肌细胞上的药物毒性测定[ 4-5] 　在 96孔培养板中
接种 2×105·mL-1Hela 细胞或 5×105·mL-1心肌
细胞 100μL/孔;用无血清培养基按 2倍剂距依次
稀释药物 ,形成 6个梯度;至 96孔板中形成单层的
Hela 细胞/心肌细胞后 ,弃上清 ,每孔加入无血清培
养基倍比稀释药物 100 μL ,每个浓度设置 7 个复
孔 ,同时设置正常细胞对照;置 37 ℃、5%CO 2培养
箱中培养 ,逐日观察 CPE;当细胞病变不再发展时 ,
应用 Reed-Muench 法计算最大无毒浓度(TD0)和
半数中毒剂量(TD50)。
2.2　体外抗病毒实验
2.2.1　广枣总黄酮对 CVB3感染的 Hela 细胞/心
肌细胞的保护作用[ 6] 　将 2×105·mL-1浓度的 He-
la细胞或 5×105·mL -1心肌细胞接种于 96 孔板 ,
100 μL/孔;培养 24 h 形成单层细胞后 , 以 100 倍
TCID50浓度进行病毒感染;吸附 1 h 后 ,弃病毒液 ,
将待测药物自最大无毒浓度开始稀释 3个稀释度加
入细胞孔中 ,每孔 100 μL;置 37 ℃、5%CO 2培养箱
中培养;每天于显微镜下观察 CPE 进展情况 ,并记
录结果;此实验分组中包括:细胞对照组 、病毒对照
组 、盐酸胍药物毒性对照组 、TFFC 药物毒性对照
组 、盐酸胍+病毒组和 TFFC+病毒组。
连续观察 96孔板中各组细胞 CPE 出现情况 ,
在病变最严重的实验组或对照组 CPE不再进展时 ,
进行 M TT 染色;MT T 储备液的配制:精密称取
200 mg M TT ,用 20 mL DMEM(无血清培养液)溶
解至完全均匀 ,0.22 μm 滤膜过滤 ,即得 10 g·L-1
的 MT T 储备液;使用液的配制:取 1 mL MTT 储备
液 ,加入 9 mL DMEM 使成为 1 g·L-1的 MTT 液;在
超净台内吸去 96 孔板中原培养液 ,每孔加入 50 μL
的 MT T 染色液;将 96孔板放回孵箱 ,37 ℃、5%CO2
孵育 46 h ,蓝紫色甲瓒复合物形成后 ,弃上清;PBS清
洗细胞并重复一次 ,每孔加入 100 μL DMSO 以终止
显色反应;酶标仪 490 nm测定 OD值。
2.2.2　病毒繁殖抑制实验[ 7] 　收集上述实验组和
病毒对照组的细胞及培养液;反复冻融 ,使细胞充分
裂解 ,释放出胞浆内的病毒颗粒;离心后取上清 ,作
系列 10倍稀释;将稀释后的病毒液接种于已培养好
Hela细胞的 96孔板上 ,连续观察 96孔板中各组细
胞 CPE出现情况 ,记录结果 。Reed-Muench法计算
病毒感染组培养液上清接种后 TCID50及病毒+药
物组培养液上清接种后 TCID50 ;标准:以加药组
TCID50比病毒对照组降低 1 个对数数量级以上为
有效 。
2.3　心肌细胞释放酶的测定[ 8-9] 　按常规方法制备
乳鼠心肌细胞 ,置于 37℃,5%CO2培养箱中培养 72
h;加入 CVB3以及不同浓度的药物 ,继续培养 48 h;
收集上述各组心肌细胞培养上清液各 100 μL ;参照
试剂盒说明测定乳酸脱氢酶(LDH)及磷酸肌酸激
酶(CK-MB)活性。此实验分组中包括:空白对照 、
病毒对照 、阳性药物对照(盐酸胍)、药物毒性对照 、
病毒+药物实验组 。
2.4　肿瘤坏死因子的测定[ 10] 　常规方法制备乳鼠
心肌细胞 ,置于 37 ℃,5%CO 2培养箱中培养 72 h;
加入 CVB3以及不同浓度的药物 ,继续培养 48 h;收
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集上述各组心肌细胞培养上清液各 100 μL ;将上述
样品按照 TNF-α试剂盒说明书进行测定 。此实验
分组中包括:空白对照 、病毒对照 、阳性药物对照(盐
酸胍)、药物毒性对照 、病毒+药物实验组。
2.5　凋亡相关基因 mRNA 的转录水平检测———
RT-PCR方法[ 11]
2.5.1　用 TRIZOL提取细胞总 RNA 　倾去细胞培
养瓶中上清 ,并尽量吸除干净;加入 TRIZOL1.5 mL ,
吹吸使细胞溶于 T RIZOL中;取0.5 mL 上述液体于
1.5 mL 离心管中;加0.125 mL 氯仿 ,振荡混匀 15
min ,室温放置 3 min;离心:4 ℃, 12 000 r·min-1 ,
15 min;取上清 ,并转移入另一只离心管;加入0.25
mL 异丙醇 ,室温放置 10 min;离心:4 ℃, 12 000 r·
min
-1 ,5 min;去上清 ,加入 1 mL75%乙醇;离心:4
℃,7 500 r·min-1 , 5 min 。弃上清 , 室温干燥 10
min。加 DEPC水溶解 RNA ,在分光光度计上测定
RNA 值(OD260/OD280),并对 RNA 进行定量 ,电泳
鉴定 RNA条带。
2.5.2　在含有甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳　配
制甲醛凝胶电泳缓冲液:0.1 mo l·L-1 MOPS(pH
7.0)。制备凝胶:称取 0.6 g 琼脂糖凝胶 , 加入
52.2 mL 经 DEPC 处理过的水中 ,加热溶解 ,待胶
冷到 65 ℃,加入6.0 mL 10XMOPS , 1.8 mL 甲醛 ,
倒入胶槽;变性 RNA:加入2.0 μL 10XMOPS ,3.5
μL 甲醛 , 10 μL 甲酰胺 ,混匀;取 40 ～ 60 μg(4.5
μL)总 RNA ,65 ℃变性 15 min ,冰上冷却 2 min;加
入2.0 μL上样缓冲液 ,混匀;50 V 预电泳 5 min上
样;待染料全部进入胶后 ,电压降为 40 V , 10 min
混合一次电泳缓冲液 ,使电泳液两端的离子浓度
趋于一致;待溴酚蓝泳动到凝胶底部 ,停止电泳 ,
照相 。
2.5.3　RT-PCR　各实验组取同样量总 RNA 进行
RT -PCR扩增 ,扩增出条带亮度均一的管家基因
片断(GA PDH)。所扩增条带的引物序列:
基因名称 序　　列
GAPDH Sense 5 -CCC A TC ACC A TC T TC CAG GAG
CGA G-3
Anti-sense 5 -CGC CTG CTT CAC CTT CTT GAT
GT-3
C-Myc Sense 5 -GCC GTA T TT CTA CTG CGA CGA
GGA G-3
Anti-sense 5 -GCT GG T GGT GGG CGG TG T CT-3
T NF-α Sense 5 -GCC TCT TCT CA T TCC TGC T T-3
Anti-sense 5-ACT TGG TGG TT T GCT ACG AC-3
Fas Sense 5-ATG CTG GGC ATC TGG ACC-3
Anti-sense 5-CTG T TC TGC TGT GTC TTG G-3
CT-1 Sense 5-GAG ACA GTG CTG GCC GGC GCT G-
3
Anti-sense 5-AGA GGA GAG CAG AAG AGA GAG
A-3
　　循环参数为:
基因名称 循环参数
GAPDH
37 ℃/ 50 min※94 ℃/ 5 min※
(94 ℃/ 30 s ※ 58 ℃/ 30 s ※72 ℃/ 50 s)×30
※72 ℃/ 7 min※4 ℃
C-My c
37 ℃/ 50 min※94 ℃/ 5 min※
(94 ℃/ 30 s ※ 57 ℃/ 30 s ※72 ℃/ 1 min)×32
※72 ℃/ 7 min※4 ℃
TNF-α
37 ℃/ 50 min※94 ℃/ 5 min※
(94 ℃/ 30 s ※ 59 ℃/ 30 s ※72 ℃/ 1 min)×32
※72 ℃/ 7 min※4 ℃
Fas
37 ℃/ 50 min※94 ℃/ 5 min※
(94 ℃/ 30 s ※ 56 ℃/ 30 s ※72 ℃/ 1 min)×30
※72 ℃/ 7 min※4 ℃
CT-1
37 ℃/ 50 min※94 ℃/ 5 min※
(94 ℃/ 30 s ※ 55 ℃/ 30 s ※72 ℃/ 1 min)×32
※72 ℃/ 7 min※4 ℃
2.6　统计学处理　运用 SPSS 11.0软件包对数据
进行 t检验 ,结果进行显著性分析。
3　结果
3.1　盐酸胍 、广枣总黄酮在 Hela 细胞/心肌细胞
毒性测定　见表 1。
表 1　盐酸胍 、广枣总黄酮在 H ela细胞/心肌细胞毒性测定
结果(mg·L-1)
Tab 1　Cy topathic effects caused by guanidine hydro chlor ide
and a series o f matrine in H ela cell and myoca rdial cell(mg·
L -1)
组别 Hela细胞测定 心肌细胞毒性测定
TD0 TD 50 TD 0 T D50
盐酸胍 129.6 322.5 129.6 322.5
TFFC 155.5 387.0 129.6 322.5
3.2　广枣总黄酮对 CVB3感染的 Hela 细胞/心肌
细胞的保护作用　结果见表 2 ,表 3。
3.3　病毒繁殖抑制实验　结果见表 4。
3.4　心肌细胞释放酶的测定　结果见表 5。
3.5　肿瘤坏死因子的测定　结果见表 6。
表 2　TFFC 对 CVB3病毒感染的 He la细胞的保护作用( x±
s , n=8)
Tab 2 　P ro tection effect o f TFFC on CVB3-infected Hela
cells( x ±s , n=8)
组别 剂量/mg·L-1 OD 值(490 nm)
细胞对照组 - 0.85±0.07
病毒对照组 100 T CID50 0.46±0.14d
盐酸胍药物毒性对照组 125.00 0.80±0.09b
T FFC药物毒性对照组 125.00 0.82±0.14b
盐酸胍+病毒组 15.62 0.55±0.11
31.25 0.65±0.20a
62.50 0.67±0.12aa
125.00 0.79±0.20bc
T FFC+病毒组 15.62 0.50±0.14
31.25 0.60±0.10a
62.50 0.67±0.20a
125.00 0.76±0.20bc
注:与病毒对照组比较 , a P<0.05 , cP <0.01;与细胞对照组比较 , bP
>0.05 , dP <0.01
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表 3　TFFC 对 CVB3病毒感染的心肌细胞的保护作用( x±
s , n=8)
Tab 3　P ro tection effect of TFFC on CVB3-infected cadio-
myocy te s( x±s , n=8)
组别 剂量/mg·L -1 OD值(490 nm)
细胞对照组 - 0.95±0.23
病毒对照组 100 TCID 50 0.48±0.10d
盐酸胍药物毒性对照组 125.00 0.89±0.09b
TFFC药物毒性对照组 125.00 0.91±0.14b
盐酸胍+病毒组 15.62 0.60±0.11a
31.25 0.61±0.10a
62.50 0.70±0.15c
125.00 0.86±0.12c
TFFC+病毒组 15.62 0.56±0.09
31.25 0.60±0.13a
62.50 0.72±0.16bc
125.00 0.80±0.10bc
注:与病毒对照组比较 , aP <0.05 , cP<0.01;与细胞对照组比较 , bP
>0.05 , dP<0.01
表 4　TFFC 对 CVB3病毒繁殖抑制作用( x±s , n=8)
Tab 4　Inhibito ry effect of TFFC on CVB3 reproduction( x±
s , n=8)
组别 剂量/mg·L -1 lg(TCID50) 与病毒对照组升高对数单位
病毒对照组 - -5.3 0
盐酸胍+病毒组 62.50 -3.4 1.9a
TFFC+病毒组 31.25 -4.5 0.8
62.50 -4.0 1.3a
125.00 -3.6 1.7a
注:a 为 lg(TC ID 50)与病毒对照组相比升高 1个或 1 个以上对数单
位则有抑制作用
表 5　TFFC 对 CVB3病毒感染的心肌细胞酶 LDH 和 CK-
MB的影响( x ±s , n=8)
Tab 5　I nhibito ry effect of TFFC on release o f LDH and
CK-MB from CVB3-infected cardiomyocy tes( x±s , n=8)
组别 剂量/
mg·L-1
LDH/
IU·mL -1
CK-MB/
IU·mL -1
细胞对照组 - 6015.5±275.0 66.3±7.2
病毒对照组 250TCID50 7729.1±331.4 130.9±22.1b
盐酸胍毒性对照组 62.50 6261.5±361.6 71.6±7.0
盐酸胍+病毒组 15.63 6991.8±400.6c 124.6±18.3
31.25 6160.4±575.4c 101.9±14.0c
62.50 6465.9±632.5c 74.4±10.1c
TFFC毒性对照组 - 6015.5±275.0 66.3±7.2
TFFC+病毒组 3.91 7326.6±457.9 132.9±17.7
7.82 7091.0±584.6a 131.3±14.2
15.63 6755.4±632.9c 119.9±11.7
31.25 6502.1±345.9c 93.8±13.5c
62.50 6337.8±294.2c 76.2±7.7c
注:与病毒对照组比较 , aP <0.05 , cP<0.01;与细胞对照组比较 , bP
<0.05
3.6　相关基因 mRNA 的转录水平检测 ———RT-
PCR方法　见图 1。
4　讨论
自 20世纪 80年代以来 ,国内运用中医药或中
西医结合对防治 CVB3病毒性心肌炎进行临床研
究 ,结果表明 , 大部分单味中药不影响 CVB3的吸
附 、穿入过程 ,但能于细胞外直接杀灭 CVB3病毒或
表 6　TFFC 对肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响( x±s , n=8)
Tab 6　Inhibito ry effect o f TFFC on release of TNF-α( x±s ,
n=8)
组别 剂量/mg·L-1 TNF-α/μg·L-1
细胞对照组 - 47.6±6.7
病毒对照组 250 T CID50 124.0±12.1
盐酸胍药物毒性对照组 62.50 54.4±5.0d
盐酸胍+病毒组 15.63 104.4±13.8c
31.25 67.6±8.1c
62.50 57.8±8.1c
T FFC药物毒性对照 62.5 54.6±6.8d
T FFC+病毒组 3.91 109.5±18.2
7.82 111.4±20.1
15.63 104.4±19.7a
31.25 75.4±10.8c
62.50 53.0±9.9c
注:与病毒对照组比较 , a P<0.05 , cP <0.01;与细胞对照组比较 , bP
<0.05 , dP <0.01
图 1　凋亡早期基因 C-Myc及凋亡相关因子 TNF-α、Fas、CT-1表达
的变化情况
Fig 1　The changes of gene C-Myc , T NF-α, Fas , CT-1 exp ression
进入细胞内影响病毒侵入细胞后的生物合成 ,部分
中药还能调节机体免疫功能 、保护心肌细胞。本课
题主要通过已建立的 VMC 病理模型来研究 TFFC
在体外抗 CVB3病毒的作用。
病毒在敏感细胞中繁殖 ,常可致细胞代谢改变
和出现细胞病变(CPE),可以此来判定病毒感染的
存在。在 CVB3病毒感染心肌细胞后 ,细胞出现圆
缩 、坏死等形态学改变 ,随感染时间延长 ,病变范围
扩大 ,CPE 可达 75%～ 100%;免疫组化 ,胞质内可
·1640· 中国医院药学杂志 2007年第 27卷第 12期 C hin H osp Pharm J , 2007 Dec , Vol 27 , No.12
见棕黄色 、丝装物质 ,显示免疫组化染色阳性 。本实
验在 CVB3 感染 Hela/心肌细胞上的研究证实
TFFC 对其有保护作用 。同时 , TFFC 不仅能够有
效抑制 CVB3 病毒的繁殖 ,而且在子代接种中仍能
发挥作用 ,使病毒繁殖指数下降0.8 ～ 1.7个以上对
数值 。
VMC 是侵犯心肌实质的炎症性疾病 ,病毒侵
蚀细胞后 ,其 LDK 、CK-MB 通常都升高 ,心肌酶升
高时有心肌细胞受损 ,酶的漏出可以认为是细胞完
全坏死前的改变 ,故有学者认为 ,心肌酶谱(特别是
同工酶)的改变可以作为预测病变范围程度以及判
断疾病转规与愈后的指标 。本实验观察结果表明给
药组与对照组比较 ,心肌酶 LDH 、CK-MB均明显降
低(P<0.01),说明 TFFC 在降低被病毒感染心肌
酶 LDH 及 CK-MB 方面占有一定优势 。其作用机
制可能与下列因素有关:①减轻心肌细胞的炎性浸
润;②抗自由基的心肌细胞损害作用;③提高心肌细
胞对缺氧的耐受性;④保护凋亡细胞并促进其功能
恢复;⑤减少心肌细胞炎性坏死 ,最终降低心肌酶的
释放 ,从而达到保护心肌细胞的作用。 TFFC 能抑
制心肌酶升高和抑制心肌细胞病变 ,有利于促进机
体特异性免疫充分发挥 ,具有免疫调节和抗病毒双
重作用。
TNF-α是一种有多种生物活性的细胞因子 ,参
与多种病理过程 ,与许多疾病有关[ 10] 。最近的研究
表明 ,在 CVB3诱发的 VMC 中 , TN F-α等细胞因子
的释放可导致心肌细胞的损伤[ 11] 。VMC 心肌病变
(炎细胞浸润和坏死)与 TNF-α的水平有关 , TNF-α
水平越高 ,心肌损伤越严重[ 12] 。TNF-α主要由单核
巨噬细胞产生的具有多种生物学活性的多肽调节因
子 ,心肌感染病毒后可诱导 TNF-α等细胞因子大量
和产生和聚集。同时 , TNF-α还可进一步诱导 IL-
6 、IL-8 、IL-10 等因子的产生。 TNF-α对心肌还有
负性肌力作用 ,导致心肌收缩及舒张功能的低下 ,心
肌炎症加剧 。TNF-α还可导致基因调控的异常 ,通
过坏死或凋亡引起心肌细胞死亡[ 13] 。在本研究中
提示 TFFC可以调节心肌细胞免疫功能 ,使心肌细
胞中 TNF-α的含量显著降低 ,从而减少免疫效应细
胞对心肌的攻击 ,减轻心肌的免疫性炎症。
C-Myc基因是一种原癌基因 ,它在细胞增殖及
凋亡的调节中具有重要作用 。C-Myc 蛋白存在于
核中 ,C-Myc蛋白作为调节因子 ,一方面激活介导
细胞增殖的基因;另一方面也激活诱导凋亡的基因 。
对于它的作用目前较一致的结论是:C-Myc 信号传
递系统激活后 ,如果培养体系中有足够的生长因子
持续存在 ,则细胞增殖并分裂;否则诱导细胞凋亡。
在病毒性心肌炎发病过程中 , C-Myc 表达水平增
高 ,其在心肌细胞内的主要作用是激活诱导凋亡的
基因 。另外 , C-Myc基因表达失调被认为是心肌细
胞凋亡的主要诱因 。Fas是细胞膜表面受体蛋白 ,
属于肿瘤坏死因子及神经生长因子受体超家族成
员 ,其主要表达于成熟的淋巴细胞 、心肌细胞等。
Cardio trophin-1(CT-1)很可能是一种心肌细胞保护
因子 ,它属于 IL-6家族 ,可以抑制由细胞因子所介
导的细胞凋亡 。实验结果显示 , C-Myc 、TNF-α、Fas
的 mRNA 表达量存在改变 ,正常细胞对照组和药物
对照组细胞分泌因子的量都很低 ,而且二者之间的
差异很小 。在受表达侵袭之后 ,表达量明显上升 ,在
药物的干预作用下 ,表达量有所下降。而 CT-1 的
表达在不同分组差别不明显 。
本实验主要研究 TFFC 的体外抗 CVB3病毒活
性 ,其抗病毒的作用机制以及应用免疫组化技术对
CVB3病毒感染引起的免疫病理反应的抑制作用将
在进一步实验中加以探讨。
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[收稿日期] 2007-06-03
[ 基金项目] 广东省科技计划项目(编号:2005B30101004)　[ 作者简介] 刘韬 ,女 ,硕士研究生 ,主管药师 ,电话:020-87343329 , E-m ail:liutao@
m ail.sysu.edu.cn 　[ 通讯作者] 黄红兵 ,副主任药师
多西紫杉醇脂质体家兔体内药动学
刘韬 ,黄红兵 ,林子超 ,叶娟平 ,钟锦堂 ,刘庆 ,邓丽婷 ,廖海　(华南肿瘤学国家重点实验室 , 中山大学附属肿瘤医院 ,
广东 广州 510060)
[ 摘要] 　目的:研究多西紫杉醇脂质体在家兔体内的药动学。方法:18 只家兔随机分为 3 组 , 分别在耳缘静脉单剂量(7.5
mg·kg -1)注射多西紫杉醇普通脂质体 、长循环脂质体和市售注射液 , 用高效液相色谱法测定各时间点血药浓度。 结果:血
药浓度-时间数据均符合二房室模型;t1/2α分别为(0.31±0.11),(0.32 ±0.06),(0.17±0.04)h;t1/2β分别为(11.2±1.3),
(10.5±1.1),(8.5±1.0)h;Vd 分别为(8.6±1.1),(6.3±0.6),(13.7±3.6)L;AUC0※24分别为(22.8±3.6),(29.3±
6.0),(13.4±2.4)mg·h·L-1 ;AUC0※∞分别为(28.7 ±5.0),(37.0±9.1),(15.1±2.8)mg·h·L-1 ;CL 分别为(0.54±
0.08),(0.42±0.07),(1.10±0.18)L·h -1 。 2 种脂质体与注射液相比 , t1/2α, t1/2β , Vd , CL , AUC0※24及 A UC0※∞均有显著性
或极显著性差异;脂质体之间 Vd 和 CL 差异有显著性。结论:与普通注射液相比 , 家兔静注两种脂质体后 , 均具有较长的消
除半衰期 , 更大的药-时曲线下面积 , 较低的总体消除率和较小的表观分布容积 , 说明脂质体制剂具有长效和缓释的特点;
经 PEG 修饰的长循环脂质体较之普通脂质体 , 在能够维持较长的体内循环时间的同时 , 能够更好地浓集于靶组织 ,减少药
物对其他组织的不良反应并增加疗效。
[ 关键词] 　多西紫杉醇;脂质体;药动学;高效液相色谱法
[中图分类号] R969.1　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2007)12-1642-04
Study on pharmacokinetics of docetaxel liposome in rabbits
LIU Tao ,H UANG Hong-bing , LIN Zi-chao , YE Juan-ping , ZHONG Jin-tang , LIU Qing , DENG Li-ting ,
LIAO Hai(Tumo r Hospital A ffiliated to Sun Yat-Sen Unive rsity , Guangdong Guang zhou 510060 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To compa re the pharmacokinetics charac te ristics o f docetax el lipo some injection(L-DOC)and peg-
docetax el long-circulating liposome injection(PEG-DOC-LCL)w ith market docetax el injection(M-DOC)in r abbits by int ravenous
administration.METHODS　L-DOC , PEG-DOC-LCL and M-DOC we re intrav enously administr ated to r abbits a t a sing le dos-
age of 7.5 mg·kg -1 .The concentration- time data o f docetaxe l(DOC)in pla sma sample s we re determined by HPLC , and the
pharmacokine tic par ame te rs wer e calculated and analyzed by means o f 3p97 and SPSS so ftwa re.RESULTS　The concentration-
time data of L-DOC , PEG-DOC-LCL and M-DOC w ere all fitted to tw o compa rtment-mode l , and the main pharmacokine tic pa-
rameters as follow s:t1/2αwe re(0.31±0.11),(0.32±0.06),(0.17±0.04)h respectively;t1/2βwe re(11.2±1.3),(10.5±1.1),
(8.5±1.0)h re spectively;Vd we re(8.6±1.1),(6.3±0.6),(13.7±3.6)L respectively;AUC0※24 w ere(22.8±3.6),(29.3±
6.0),(13.4±2.4)mg·h·L-1 respectiv ely;AUC0※∞ w ere(28.7±5.0),(37.0±9.1),(15.07±2.76)mg·h·L-1 respectively;
CL w ere(0.54±0.08),(0.42±0.07),(1.10±0.18)L·h -1 respectively.t1/2α, t1/2β , Vd , CL , AUC0※24 and AUC0※∞ of two kinds
of docetax el liposomes all had significant differ ence repectively f rom those o f M-DOC , V d and CL o f PEG-DOC-LCL had signifi-
cant difference f rom tho se of L-DOC.CONCLUSION　There w ere several significant differences be tw een the pha rmacokine tics
propertie s o f L-DOC , PEG-DOC-LC L and M-DOC injection in r abbits.Com pared with the M-DOC , L-DOC and PEG-DOC-
LCL contained characteristic of sustained-release and higher effect.At the same time , the docetaxe l of PEG-DOC-LCL could be
concentra ted at the targ et tissue and be advantageous to reduce tox icity and im prove therapeutic effect.
KEY WORDS:doce ta xel;lipo somes;pharmacokinetics;HPLC
　　多西紫杉醇(docetaxel)是半合成的抗肿瘤植物
药 ,对非小细胞肺癌 、乳腺癌和卵巢癌有良好疗效 ,
近年来在临床应用广泛。多西紫杉醇水溶性差 ,市
售注射剂均采用聚山梨醇酯-80和 13%乙醇溶液作
·1642· 中国医院药学杂志 2007年第 27卷第 12期 C hin H osp Pharm J , 2007 Dec , Vol 27 , No.12