全 文 ：品适量 , 按 [含量测定 ]方法测定 ,计算回收率。结果见表 7。
表 7　回收率实验结果
取样量
m/g
供试品含
量m/mg
对照品加
入量 m/mg
测得量
m/mg
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
0.1497 0.256 0.507 94.00
0.1331 0.228 0.474 92.13
0.1634 0.280 0.267 0.550 101.1 97.74 4.54
0.1765 0.302 0.575 102.2
0.1624 0.278 0.543 99.25
　　n=5
2.4.6　样品含量测定 按上述 “ 2.3”项下方法操作 , 分别精密吸
取对照品溶液与供试品溶液各 5 μl, 注入液相色谱仪 , 测定 ,即
得。结果见表 8。
表 8　含量测定结果
样品(批号) 取样量m/g 含量＊m/mg
平均含量＊
m/mg
糖乐胶囊(080902) 0.300 9 0 0
0.312 4 0
糖乐胶囊(080901) 0.302 6 0 0
0.314 3 0
消和胶囊(060810) 0.300 7 0 0
0.310 0 0
平糖宝胶囊(0080908) 0.303 1 0.526 0.522
0.302 3 0.518
夷宝降糖胶囊(无批号) 0.302 2 0.472 0.476
0.301 8 0.481
　　＊每粒中的含量
本文建立的 LC-MS方法 , 采用选择性离子检测(SIM), 试
验结果表明 , 样品中杂质对格列本脲无干扰 , 样品峰形良好 ,最低
检测限达到 0.8ng, 平均回收率为 97.74%, 并且样品前处理程序
简单 , 结果准确 , 专属性好。因此本方法为打击在降糖中成药中
擅自添加西药成分格列本脲的违法行为提供了有利的技术依据。
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收稿日期:2009-08-05;　修订日期:2010-03-20
作者简介:吴斐华(1972-),女(汉族),福建莆田人 ,现任中国药科大学中
药学院副教授 ,博士学位 ,主要从事抗糖尿病药物研究及药理学教学工
作.
风轮菜乙醇提取物对血管内皮细胞的保护作用研究
吴斐华 ,田冬娜 ,刘　洋 ,王　辉 ,田少琼
(中国药科大学 ,江苏 南京　211198)
摘要:目的 研究风轮菜乙醇提取物(EJCT)对血管内皮细胞的保护作用及机制。 方法 分别用过氧化氢 (H2O2)和高糖
建立体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型 。MTT法检测细胞存活率;用试剂盒方法检测细胞超氧化物歧化
酶 (SOD)和乳酸脱氢酶 (LDH)活力;用 Griess法测定上清液中 NO2 -浓度反映内皮细胞释放的一氧化氮 (NO)。结果
不同浓度的 EJCT能明显提高 H2O2和高糖损伤的内皮细胞存活率 , 使 H2O2损伤的内皮细胞内低下的 SOD活力回升 , 降
低高糖诱导的内皮细胞 LDH释放。另外 , EJCT(3, 10, 30, 100mg/L)能增加 HUVECs培养液中 NO含量。结论 风轮菜乙
醇提取物对血管内皮细胞具有保护作用 ,机制可能与其抗氧化和促进 NO的合成有关。
关键词:风轮菜;　内皮细胞;　过氧化氢;　高糖;　一氧化氮
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.08.107
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)08-2074-03
　　血管内皮细胞介于血液与组织间 , 发挥着屏障作用 , 同时具
有多种生理功能 , 对维持健康或病理环境下内环境的稳定起着积
极作用。大量的研究表明 , 内皮功能异常已经成为 2型糖尿病患
者血管并发症的始发因素 [ 1] 。氧化应激是导致糖尿病患者血管
内皮功能异常的重要因素 [ 2, 3] 。因此 ,氧化应激在血管病变的发
病中起关键作用 , 抗氧化治疗具有重要的临床意义。
唇形科风轮菜属植物主要的化学成分为黄酮类 、皂苷类 、有
机酸类 、芳香族类 、三萜类 、甾体类等。目前的研究发现风轮菜属
植物主要的药理作用为止血 、抗菌 、抗炎及免疫作用 、抗辐射 、抗
肿瘤等 [ 4] 。风轮菜属植物风轮菜在福建民间用于治疗糖尿病 ,
提示其可能具有保护血管内皮细胞损伤的作用。本实验室前期
研究结果表明风轮菜乙醇提取物具有明显的降血糖作用 [ 5] 。为
了探讨风轮菜是否具有保护血管内皮细胞的作用 , 本研究采用
H2O2和高糖分别建立氧化应激损伤内皮细胞的模型 , 观察不同
浓度的风轮菜乙醇提取物对氧化应激损伤内皮细胞的保护作用 ,
并初步探讨其作用机制 ,为将其开发为糖尿病及其并发症治疗药
物奠定基础。
1　材料与仪器
1.1　药材与试剂 风轮菜全草采集于福建省莆田县萩芦镇 ,经中
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.8
国药科大学中药资源学研究室秦民坚教授鉴定为 Clinopodium
chinense(Benth.)O.Kuntze。 风轮菜全草的 80%乙醇提取物
(EJCT,中国药科大学中药药理教研室提供 , 得率 18%);胎牛血
清和 M199培养基(Gibco公司);胰蛋白酶 、Ⅱ型胶原酶和乙二胺
四乙酸二钠 (EDTA-2Na, 南京生兴生物技术有限公司);噻唑蓝
(MTT)和 Endothelialcelgrowthsupplementfrombovineneuraltis-
sue(ECGS, Sigma公司);三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl,
南京创瑞生物技术有限公司);磺胺 和 N-(1-萘基)乙二胺盐
酸盐(国药集团化学试剂有限公司);硝普钠粉针(北京双鹤现代
医药技术有限公司 , 批号 20060609);乳酸脱氢酶试剂盒(南京建
成生物工程研究所 , 批号:20080331);超氧化物歧化酶试剂盒
(南京建成生物工程研究所 , 批号:20070619)。其它试剂均为市
售分析纯。
1.2　仪器 MultiskanspectrumMSS1500-320酶标仪 , 702型超低
温冰箱和 3111型细胞培养箱(ThermoElectron公司);SW-CJ-
IF超净台(苏州安泰空气技术有限公司);XSZ-D2倒置显微镜(重庆光学仪器厂);1-15K低温离心机(Sigma公司)。
2　方法
2.1　原代人脐静脉内皮细胞的培养 [ 6] 采用胶原酶灌注消化法
分离原代人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。无菌条件下 ,选取健康
产妇脐带 (长度约 20 cm), 除掉两端破损及水肿 , 4℃保存于磷
酸缓冲液(PBS)中 , 4 h内进行分离。先用 PBS溶液冲洗静脉腔
内血液 , 然后置于 37℃培养箱内 , 用 0.1%Ⅱ型胶原酶消化 15 ～
20 min, 收集消化液于 1 000 r/min离心 5 min, 弃上清 ,收集沉淀
细胞。细胞重悬于 M199培养液 (含 10%胎牛血清;青霉素 、链
霉素各 100 U/ml;ECGS20mg/L)中 , 移入预先铺好明胶的培养
瓶内 , 于 37℃、5%CO2的培养箱中培养。 24 h后 PBS冲洗 、换新
鲜培养基 , 2～ 3d更换培养基 , 约接种后 4 ～ 6d,当细胞生长覆盖
80%左右培养面时 , 0.25%胰酶消化 , 1∶2比例传代。内皮细胞
Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞所特有 ,用免疫组织化学法检测到分
离培养的人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原为阳性。
2.2　EJCT对 H2O2致 HUVECs脂质过氧化损伤的保护
2.2.1　MTT法检测内皮细胞存活率 [ 7] 取对数生长期 HUVECs
消化成单细胞悬液接种于 96孔细胞培养板 (2 ×104cel/孔)内 ,
37℃, 5% CO2预培养 24h后 , 更换M199培养液 ,分为 5组 ,每组
3个平行。正常组为 HUVECs的自然培养 , 模型组为 HUVECs与
500μmol/LH2O2共培养 , 其余 3组为 EJCT(3, 10, 30 mg/L)与HUVECs及共培养 , 药物温育 24 h之后 , 与 H2O2共培养 4 h,加
入含 0.5% MTT的培养基 20 μl, 再培养 4 h后 , 弃培养液 , 加入
150μl的 DMSO原液 ,振荡 10 min, 待结晶完全溶解后 , 用酶联免
疫仪于 490nm波长处测定吸光值(A值)。实验重复 3次 ,每次 3
个复孔。
2.2.2　SOD活性的检测 细胞传代培养后随机分为正常组 、模型
组及各浓度药物作用组 ,给药剂量及方法同 “ 2.2.1”。实验结束
时 , 弃细胞上清液 ,每孔加入 50 μl细胞裂解液(20 ml含:40 μl
0.5 mol/LEDTA;4ml10% SDS;1ml1mol/LTris-HCl;14.96ml
H2O, pH6.8), 吹打细胞 , 然后取裂解液 50 μl, 试剂盒方法测定SOD活性。实验重复 3次 ,每次 3个复孔。
2.3　EJCT对高糖致 HUVECs损伤的保护 [ 8]
2.3.1　MTT法检测内皮细胞存活率 取对数生长期 HUVEC消
化成单细胞悬液接种于 96孔细胞培养板(1×104 cel/wel), 培
养 24h后更换 M199培养基 , 将细胞分为 5组 , 正常组为 HU-
VECs的自然培养 ,模型组为 HUVECs与 30 mmol/L葡萄糖共培
养 , 其余组为 EJCT(3, 10, 30mg/L)与 HUVECs及葡萄糖共培养。
培养 72h后 , 各孔加入含 0.5% MTT的培养基 20μl,再培养 4 h
后 , 弃培养液 ,加入 150 μlDMSO原液 , 振荡 10 min, 待结晶完全
溶解后 , 用酶联免疫仪于 490 nm波长处测定吸光值(A值)。实
验重复 3次 , 每次 3个复孔。
2.3.2　LDH活性的检测 细胞传代培养后随机分为正常组 、模
型组及各浓度药物作用组 ,给药剂量及方法同 “ 2.3.1”。实验结
束时 , 收集细胞上清液 , 按试剂盒方法测定 LDH活性。各实验重
复 3次 , 每次 3个复孔。
2.4　EJCT对内皮细胞培养液中 NO含量的影响 取对数生长期
细胞消化成单细胞悬液接种于 96孔细胞培养板(2 ×104cell/
孔), 37℃, 5% CO2预培养 24h后 ,更换 M199培养液 ,将细胞分
为 6组即正常组 、EJCT(3, 10, 30, 100 mg/L)、硝普钠 (10 mg/L)
组。正常组为 HUVECs的自然培养 ,药物组为不同浓度的药物与
HUVECs共培养 24 h后 ,以 Griess法 [ 9]测定细胞培养液中 NO含
量。即 100 μl细胞培养液与 100 μl的 Griess试剂(1%磺胺溶于
2.5%磷酸与等体积的 0.1%萘乙二胺盐酸盐混合液)在室温下
反应 10min,在酶标仪上于 540 nm测定吸光度。再根据 NaNO2
的标准曲线 ,计算出细胞培养液中 NO2-的含量。每次实验为 3
个平行 , 重复实验 3次。
2.5　统计学处理 所有实验数据均以 x±s表示 , 采用 t检验进行
组间比较 , P<0.05认为有统计学差异。
3　结果
3.1　EJCT对 H2O2损伤内皮细胞存活率的影响 如图 1所示 , 与
正常组比较 , 模型组 A490值极明显降低(P<0.01)。与模型组相
比 , EJCT10, 30 mg/L组的 A490值分别明显和极明显高于模型组(P<0.05, P<0.01)。 可见 , EJCT10, 30 mg/L明显提高损伤的
内皮细胞的存活率。
3.2　EJCT对 H
2
O
2
损伤的内皮细胞 SOD活性的影响 如图 2所
示 , 与正常组比较 , H
2
O
2
损伤组内皮细胞 SOD活性显著降低(P
<0.01)。 EJCT3 mg/L组 SOD活性显著升高(P<0.05), EJCT
10, 30mg/L组 SOD活性极显著升高(P<0.01)。 表明 EJCT能
明显抑制 H2O2所致细胞的脂质过氧化损伤 , 表现为细胞内 SOD
活性显著升高。
与正常组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01
图 1　EJCT对 H2O2损伤的内皮细胞存活率的影响( x±s)
与正常组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊ P<0.05, ＊＊ P<0.01
图 2　EJCT对 H2O2损伤的内皮细胞 SOD活性的影响( x±s)
3.3　EJCT对高糖损伤的内皮细胞存活率的影响 如图 3所示 ,
与正常组比较 ,模型组内皮细胞 A
490
值极明显降低(P<0.01)。
与模型组相比 , EJCT3 mg/L组的 A
490
值明显高于模型组 (P<
0.05), EJCT10, 30 mg/L组的 A490值极明显高于模型组 (P<
0.01)。可见 EJCT3, 10, 30mg/L明显提高高糖损伤的内皮细胞
的存活率。
3.4　EJCT对高糖损伤的内皮细胞 LDH的影响 如图 4所示 , 与
正常组比较 ,高糖损伤组细胞培养液中 LDH水平极显著升高(P
<0.01), EJCT3, 10, 30 mg/L剂量组极显著降低高糖所致脐静
脉内皮细胞 LDH释放(P<0.01)。提示 EJCT对高糖所致脐静
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.8 时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期
脉内皮细胞损伤具有明显的保护作用。
与正常组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊ P<0.05, ＊＊P<0.01
图 3　EJCT对高糖损伤的内皮细胞存活率的影响
与正常组比较 , ##P<0.01;与模型组比较, ＊＊P<0.01
图 4　EJCT对高糖损伤的内皮细胞培养液中 LDH的影响( x±s)
3.5　EJCT对 HUVEC细胞培养液中 NO含量的影响 如图 5所
示 , 与正常组相比 , EJCT3, 10, 30, 100 mg/L均极明显增加 HU-
VEC细胞培养液中 NO含量 (P<0.01), 其增加百分率分别为
8.8%, 25.3%, 45.9%和 105.8%;硝普钠 10 mg/L极明显增加
HUVEC细胞培养液中 NO含量 (P<0.01), 其增加百分率分别
为 114.3%。
与正常组比较 , ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01
图 5　EJCT对 HUVEC细胞培养液中 NO含量的影响
4　讨论
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。 MTT能被活细
胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜
(formazan)并沉积在细胞中 , 而死细胞无此能力 , 因此可以间接
反映活细胞的数量 [ 10] 。用有机溶剂如 DMSO溶解甲臜结晶 , 然
后用酶标仪测定甲臜溶液光密度的 A值。相关研究表明 ,在一定
细胞数范围内 , 甲臜溶液的 A值与活细胞数呈正比。从本实验
MTT法结果中可以看出 , H2O2和高糖均使内皮细胞损伤 , 而EJCT具有抗 H2O2诱导和高糖诱导的内皮细胞损伤的作用。H2O2能很容易地穿透细胞膜自由进入细胞 , 在细胞核内的H2O2可转变成具有高活性羟自由基 , 从而造成 DNA链断裂 , 导
致细胞损伤。 H2O2可作为内皮细胞脂质过氧化反应的引发物。SOD是体内重要的抗氧化酶 , 能特异性地灭活并清除氧自由基 ,
其活性高低可间接反映细胞或机体清除氧自由基的能力 [ 11] 。本
研究显示 H2O2损伤组细胞 SOD活性显著降低 , 而用 EJCT预处
理后 , 各剂量均可提高内皮细胞 SOD活性 ,表明 EJCT可能是通
过抗过氧化损伤作用减轻 H2O2所致的内皮细胞损伤。
　　血管内皮细胞出现损伤是糖尿病血管并发症发生的前提 , 高
血糖可引起血管内皮细功能障碍和内皮细胞损伤。目前已有的
观点认为 , 高血糖状态下产生了过多的氧自由基最终导致内皮细
胞增殖受到抑制 [ 12] 。 LDH是细胞损伤后的代谢产物 ,它的活力
反映细胞损伤的程度。本实验中高糖(30 mmol/L)损伤组 HU-
VECsA490值极明显降低 , 培养液中 LDH含量明显升高。这表明
高糖能引起内皮细胞氧化损伤 ,同时也抑制了细胞的增殖代偿能
力。而用 EJCT预处理后 , 各剂量均可提高内皮细胞 A490值和降
低培养液中 LDH含量。表明 EJCT可明显减轻高糖引起的 HU-
VECs损伤 ,对血管内皮细胞损伤时的修复具有重要意义。
NO是由内皮细胞合成的血管活性物质 ,它能舒张血管平滑
肌 , 抑制异常增殖和炎症反应 , 以及抑制血小板聚集等作用。 可
见 , 内皮源性 NO对心血管系统的调控作用是广泛而又明确的 ,
维持正常的 NO水平 ,对心血管保护作用具有重要的意义。 2型
糖尿病患者常有血管内皮功能异常 ,已证实在血管内皮功能受损
时内皮源性 NO表达减少 [ 1] 。本实验中 EJCT(3, 10, 30, 100 mg/
L)均明显增加 HUVECs培养液中的 NO含量 , 提示 EJCT能促进
NO的合成和释放 ,这也是其保护血管内皮的作用机制之一。
综上所述 , 风轮菜乙醇提取物(3, 10, 30 mg/L)能明显提高
H
2
O
2
诱导的和高糖诱导的内皮细胞存活率 , 使 H
2
O
2
损伤的内皮
细胞内低下的 SOD活力回升 , 降低高糖诱导的内皮细胞 LDH释
放。另外 , EJCT(3, 10, 30, 100 mg/L)均明显增加 HUVEC培养液
中的 NO含量。可见 ,风轮菜乙醇提取物具有明显的保护血管内
皮细胞作用 , 其作用机制可能与其抗氧化活性和促进 NO的合成
与释放有关。鉴于风轮菜乙醇提取物具有降血糖活性 ,故在防治
糖尿病血管并发症方面具有良好的前景。
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