全 文 ：2011 年 11 月 Vol． 29 No ． 11
November 2011 Chinese Journal of Chromatography 1103 ～ 1106
研究论文 DOI:10． 3724 /SP． J． 1123． 2011． 01103
* 通讯联系人:黎其万，研究员，研究方向为农产品安全． E-mail:cmliu_0@ sina． com ．
基金项目:云南咖啡产业技术标准体系建设基金项目(2010-009)和云南省地方标准建立基金项目．
收稿日期:2011-06-05
超声波萃取-高效液相色谱测定咖啡粉和速溶咖啡中的葫芦巴碱
刘宏程， 黎其万* ， 邵金良， 严红梅， 兰珊珊
(云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650223)
摘要:建立了高效液相色谱测定咖啡粉和速溶咖啡中葫芦巴碱含量的方法。采用 Waters BondPak NH2 色谱柱
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ，以甲醇-水(82∶ 18，v /v)为流动相，流速 0. 8 mL /min，检测波长 260 nm。葫芦巴碱线
性范围为 1 ～ 40 mg /L (相关系数为 0. 999 8)。分别进行日内、日间和人员比对测定葫芦巴碱的重复性试验及加标
回收率试验。经测定，样品的加标回收率大于 90%，相对标准偏差小于 3%。比较了超声波萃取和热浸提萃取方法
测定葫芦巴碱含量的差异，两个方法的测定结果符合线性关系，相关系数为 0. 996 4。该法简便、快速、灵敏度高，适
用于咖啡豆中葫芦巴碱分析以及咖啡豆原料与制品的质量控制。
关键词:超声波萃取;高效液相色谱;葫芦巴碱;咖啡粉;速溶咖啡
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2011)11-1103-04
Determination of trigonelline in coffee powder and
instant coffee by ultrasonic extraction and
high performance liquid chromatography
LIU Hongcheng，LI Qiw an* ，SHAO Jinliang，YAN Hongmei，LAN Shanshan
(Ins ti tu te of Quali ty Standard and Tes ting Technology，Yunnan Academ y
of Agr icu ltu ral Sciences，Kunm ing 650223，China)
Abstract:A method of high performance liquid chromatography w as established for the analysis
o f trigonelline in coffee pow der and instant coffee． The separation w as performed on a Bond-
Pak NH2 column (250 mm × 4. 6 mm，5 μm)． The mobile phase w as methanol-w ater (82∶ 18，
v /v)at a flow rate of 0. 8 mL /min． The detection w avelength w as set at 260 nm ． The method
had good linearity in the range of 1 － 40 mg /L (the correlation coefficient w as 0. 999 8)． The re-
peatability o f the method w as performed at one day，different days，and by tw o analysts． The
accuracy of the method w as evaluated by recovery study． The recoveries w ere more than 90%
w ith the relative standard deviations less than 3%． The contents o f trigonelline in samples w ere
assessed w ith ultrasonic extraction and hot w ater extraction，separately，and the regression
coefficient betw een trigonelline contents obtained under the tw o extraction methods w as
0. 996 4． The method is simple，rapid，highly sensitive，and suitable for the analysis o f trigonel-
line and quality contro l o f co ffee samples．
Key words:ultrasonic extraction;high performance liquid chromatography (HPLC) ;trigonel-
line;coffee pow der;instant coffee
葫芦巴碱(3-碳酸-N-甲基吡啶) (结构见图 1)
是咖啡焙烤过程中形成风味成分的主要化学物质之
一［1］。现代药理学表明葫芦巴碱具有降血糖［2，3］、
抗肿瘤等作用［4，5］。咖啡中葫芦巴碱的含量与咖啡
品种、生长环境和加工工艺有关［6 － 8］。因此葫芦巴
碱含量可作为鉴定咖啡质量或者咖啡加工过程的有
效手段之一。
葫芦巴碱含量的测定方法有薄层色谱(TLC)、
高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(HPLC-
MS)［9，10］、亲水作用色谱(HILIC)［11，12］、毛细管电泳
色 谱 第 29 卷
图 1 葫芦巴碱的化学结构
Fig． 1 Chemical structure of trigonelline
(EC)［13］和核磁共振(NMR)［14］等。目前咖啡葫芦
巴碱含量测定常用方法为 HPLC 法。Casal 等［6］采
用 ODS-C18 柱、甲醇和磷酸缓冲盐梯度洗脱分离咖
啡中的葫芦巴碱。Franca 等［15］采用 C18 柱、甲醇
和乙酸梯度洗脱分离咖啡中的葫芦巴碱。这些方法
大部分采用热水浸提 2 h 以上，无净化处理，耗时、
污染仪器，不利于日常、大批量样品的检测。
随着国际咖啡企业对云南小粒咖啡品种的认可
并收购其原材料，云南省也投入巨资大力发展咖啡
产业，但尚欠缺科学系统的质量控制与综合评价体
系。本文建立了简单、快速测定咖啡中葫芦巴碱的
地方标准，对云南省咖啡豆原料及其制品的质量控
制、资源合理开发利用具有重要的指导意义。
1 实验部分
1． 1 仪器及试剂
Alliance 2695 型高效液相色谱仪(Waters 公
司) ，配四元泵溶剂淋洗系统、自动进样系统、2487
紫外检测器;HB50 型超声波萃取仪(功率 50 W，频
率 40 kHz，容量 2 L，南京莱步科学器材公司) ;
HS20500D 型超声波萃取仪(可选三档，最大功率
500 W，频率 40 kHz，容量 20 L，天津恒奥科研有限
公司) ;Arium 611DI型纯水器(Sartorius 公司)。
标准品和试剂:葫芦巴碱(纯度 98%) ，中国生
物药品检定所研制。色谱纯甲醇(Fisher 公司) ，醋
酸锌、亚铁氰化钾、磺基水杨酸均为分析纯(国药集
团化学试剂有限公司)。
通过企业送检方式收集焙烤咖啡粉和速溶咖啡
样品各 5 份，均为云南小粒咖啡。将样品于常温下
保存。
1． 2 色谱条件
色谱柱:BondPak NH2(250 mm × 4. 6 mm，5
μm;Waters 公司) ;流动相:甲醇-水(82∶ 18，v /v) ，
柱温:30 ℃;流速:0. 8 mL /min;检测波长:260 nm;
进样量:10 μL。
1． 3 标准曲线
精密称取葫芦巴碱标准品 10 mg，置于 10 mL
容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，得葫芦巴
碱贮备液 1 000 mg /L。用水将其分别稀释为 1、4、
10、20、40 mg /L系列质量浓度的标准溶液。分别取
10 μL进样测定，以葫芦巴碱的峰面积对其质量浓
度作标准曲线。
1． 4 超声萃取样品前处理
精密称取 0. 5 g 咖啡样品，置于 250 mL锥形瓶
中，加入 80 mL水，室温下超声萃取 5 min，滤纸过
滤，加入 1 mL 5%磺基水杨酸溶液于滤液中，摇匀，
转移定容于 100 mL 容量瓶中，经 0. 45 μm 滤膜过
滤，滤液供 HPLC 分析。
1． 5 热浸提样品前处理
参照文献［6，8，15］的方法，精密称取 0. 5 g 样
品，置于 250 mL 锥形瓶中，加入 80 mL 热水(沸
腾) ，于 80 ℃水浴中萃取 2 h，过滤，冷却后加入 1
mL 5%的磺基水杨酸于滤液中，摇匀，转移定容于
100 mL 容量瓶中，经 0. 45 μm 滤膜过滤，滤液供
HPLC 分析。
2 结果与讨论
2． 1 超声萃取时间的优化
试验在 HB50 超声波萃取仪的功率(50 W)和
频率(40 kHz)固定条件下，比较不同的超声萃取时
间(0 ～ 30 min)时葫芦巴碱的提取率，每个试验重
复 3 次。由于葫芦巴碱的水溶性好，超声萃取前
76%的葫芦巴碱能溶解于水。萃取时间在 5 ～ 30
min 内，葫芦巴碱萃取率的变化值小于 1%，因此 5
min 能完全萃取葫芦巴碱。
2． 2 超声波功率对萃取葫芦巴碱的影响
在 HS20500D 超声波萃取仪的频率设定为 40
kHz，功率分别设定为 125、250 和 500 W条件下，分
别对咖啡样品进行 30 s、1 min、2 min 和 3 min 的萃
取。在 125 W下萃取 3 min，葫芦巴碱的萃取率可
达 97%;在 500 W下萃取 1 min，葫芦巴碱萃取率可
达 98%。结果表明，超声波功率大，短时间内萃取效
率高。本实验选择在 HS20500D 超声波萃取仪最大
功率(500 W)下进行萃取。
2． 3 蛋白质沉淀剂的选择
由于速溶咖啡中蛋白质较多，萃取液混浊，经滤
纸过滤后直接用 0. 45 μm 的滤膜很难过滤，需净化
处理。比较了 5%磺基水杨酸和 10%醋酸锌 + 10%
亚铁氰化钾混合溶液对咖啡中蛋白质的沉淀作用。
通过加标试验可知，在经滤纸过滤后的萃取液中加
入 1 mL 10%醋酸锌 + 1 mL 10%亚铁氰化钾沉淀
剂，葫芦巴碱的回收率为 0;加入 1 mL 5%磺基水杨
酸沉淀剂，葫芦巴碱的回收率为 94%。进一步试验
表明，在咖啡粉的萃取液中加入磺基水杨酸沉淀剂，
·4011·
第 11 期 刘宏程，等:超声波萃取-高效液相色谱测定咖啡粉和速溶咖啡中的葫芦巴碱
由于产生共沉淀，葫芦巴碱的回收率为 0，推测是由
于磺基水杨酸在沉淀蛋白质过程中，包裹了水不溶
性颗粒，形成了带电大分子胶体，吸附了葫芦巴碱;
当咖啡萃取液过滤后再加入磺基水杨酸，消除了咖
啡萃取液中的不溶性颗粒，降低了形成大分子胶体
的几率，葫芦巴碱的回收率可达到 97%。本实验选
择在过滤后的萃取液中加入 1 mL 5%磺基水杨酸
来除去样品中的蛋白质。
2． 4 色谱条件的优化
葫芦巴碱为极性的水溶性酸，在反相 C18 柱上
有弱的保留。为了提高葫芦巴碱在反相 C18 柱上
的保留，需要在流动相中添加酸、缓冲盐［6，8，15］或者
离子对试剂，但这导致色谱柱的平衡时间较长，保留
时间的重现性差。葫芦巴碱分子中有游离的氢，能
与 NH2 填料形成强的分子间作用力，使得葫芦巴碱
在 NH2 柱上比在反相 C18 柱上的柱效高，故本实验
选择以 NH2 柱作为分离柱。
流动相为甲醇-水(10∶ 90，v /v)时，葫芦巴碱在
NH2 柱上的保留相对较弱，保留时间为 3. 271 min，
样品中的杂质峰干扰其测定;增加流动相中有机相
的比例能延长葫芦巴碱在 NH2 柱上的保留时间，当
甲醇-水的比例为 82 ∶ 18(v /v)时，葫芦巴碱和样品
中的杂质有好的分离度，其保留时间为 7. 068 min
(见图 2)。
图 2 (a)葫芦巴碱标准溶液和(b)咖啡样品的色谱图
Fig． 2 Chromatograms of (a)trigonelline standard
solution and (b)a coffee sample
2． 5 超声波萃取与热浸提萃取的比较
比较了超声波萃取和热浸提萃取方法测定葫芦
巴碱含量的差异。每个样品均重复测定 3 次，计算
平均值，两种萃取方法的测定结果呈线性关系，其方
程 Y = 0. 989X，其中 Y 为采用超声波萃取测得的葫
芦巴碱含量，X 为采用热浸提萃取测得的葫芦巴碱
含量，相关系数为 0. 996 4，表明超声波萃取效率与
经典的热浸提效率相当。
2． 6 标准曲线、日内稳定性、检出限及定量限
对 1 ～ 40 mg /L质量浓度范围的 5 个标准溶液
分别进行测定，结果表明葫芦巴碱的质量浓度 Y
(mg /L)与其峰面积 X 呈线性关系，线性方程为 Y
= 2. 12 × 103X － 3. 10 × 103，相关系数 r 2 为0. 999 8。
对同一份咖啡样品萃取液每隔 1 h 进样 1 次测
定，8 h 内峰面积的相对标准偏差(RSD)为 3. 02%，
表明萃取液在 8 h 内稳定。
根据信噪比(S /N)= 3 确定方法的检出限
(LOD)为 0. 2 mg /L，以 S /N = 10 确定方法的定量
限(LOQ)为 1. 0 mg /L。
2． 7 精密度试验
2． 7． 1 日内测定的重复性试验
由相同人员使用相同的仪器，在日内测定 2 份
咖啡粉(Coffee pow der-1 和 Coffee pow der-2)和 2
份速溶咖啡(Instant coffee-1 和 Instant coffee-2) ，
每个样品重复测定 5 次。结果表明，在相同条件下，
日内重复测定葫芦巴碱含量的 RSD 均小于 3%(见
表 1)。
表 1 日内测定葫芦巴碱的重复性结果(n =5)
Table 1 Repeatability of trigonelline content determined
in intraday test (n =5)
Sample Content /(g /kg) RSD /%
Coffee pow der-1 2． 44 1． 72
Coffee pow der-2 3． 89 0． 77
Instant co ffee-1 0． 506 2． 54
Instant co ffee-2 0． 304 2． 34
2． 7． 2 日间测定的重复性试验
由相同人员使用相同的仪器，在一个月的第 10
天、第 20 天和第 30 天分别对 2 份咖啡粉(Coffee
pow der-1 和 Coffee pow der-2)和速溶咖啡(Instant
coffee-1 和 Instant coffee-2)进行测定，每个样品重
复测定 5 次。从结果(见表 2)可以看出，日间重复
测定葫芦巴碱含量的 RSD≤7%。
2． 7． 3 人员比对重复性试验
由两个试验人员使用相同的仪器设备，在一天
内对相同的咖啡粉(Coffee pow der-1 和 Coffee
pow der-2)和速溶咖啡(Instant coffee-1 和 Instant
coffee-2)进行测定，每个样品重复测定 5 次。结果
(见表 3)表明不同人员重复测定葫芦巴碱含量的相
对偏差(RD)≤0. 012%。
·5011·
色 谱 第 29 卷
表 2 日间测定葫芦巴碱含量的重复性
Table 2 Repeatability of trigonelline content
determined in interday test
Sample
Test time
in month
Content
(n = 5)/
(g /kg)
RSD
(n = 5)/
%
Mean content
(n = 3)/
(g /kg)
RSD
(n = 3)/
%
Coffee 10th day 2． 44 1． 72 2． 38 2． 17
pow der-1 20th day 2． 33 1． 93
30th day 2． 37 3． 36
Coffee 10th day 3． 89 0． 621 3． 76 3． 15
pow der-2 20th day 3． 73 1． 25
30th day 3． 66 2． 12
Instant 10th day 0． 506 2． 55 0． 47 6． 96
coffee-1 20th day 0． 465 6． 97
30th day 0． 441 2． 49
Instant 10th day 0． 304 2． 32 0． 29 3． 88
coffee-2 20th day 0． 291 3． 39
30th day 0． 281 3． 22
表 3 不同人员测定葫芦巴碱含量的重复性
Table 3 Repeatability of trigonelline contents
determined by two analysts
Sample Analyst
Content
(n = 5)/
(g /kg)
RSD
(n = 5)/
%
Mean content
(n = 2)/
(g /kg)
RD
(n = 2)/
%
Coffee 1 2． 33 1． 93 2． 36 0． 07
pow der-1 2 2． 40 2． 79
Coffee 1 3． 73 1． 25 3． 78 0． 11
pow der-2 2 3． 84 2． 52
Instant 1 0． 440 2． 44 0． 446 0． 011
coffee-1 2 0． 451 4． 64
Instant 1 0． 290 3． 39 0． 297 0． 012
coffee-2 2 0． 302 5． 33
RSD:relative standard deviation;RD:relative deviation．
2． 8 回收率试验
在已知葫芦巴碱含量的咖啡粉(或速溶咖啡)
中分别加入 1. 0、2. 0、4. 0 g /kg (或 0. 2、0. 4、0. 8
g /kg)3 个含量水平的葫芦巴碱，每个添加水平样
品重复测定 5 次，计算回收率。从结果(见表 4)可
知，所有样品中葫芦巴碱的加标回收率大于 90%以
上，RSD≤3. 01%。
表 4 咖啡样品中葫芦巴碱的加标回收率(n =5)
Table 4 Recovery of trigonelline spiked in
coffee samples (n =5)
Sample
Background /
(g /kg)
Spiked /
(g /kg)
Recovery /
%
RSD /
%
Coffee pow der 2． 35 1． 0 92． 5 3． 01
2． 0 97． 5 2． 17
4． 0 93． 3 1． 51
Instant co ffee 0． 287 0． 2 98． 3 2． 25
0． 4 95． 2 1． 84
0． 8 97． 5 2． 61
2． 9 咖啡粉和速溶咖啡样品的测定
经测定，云南焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量范围
为 2. 35 ～ 4. 21 g /kg，是巴西焙炒咖啡中葫芦巴碱含
量［8］的 1 /2，说明云南省咖啡加工工艺导致葫芦巴
碱的损失大;速溶咖啡中葫芦巴碱的含量范围为
0. 287 ～ 0. 524 g /kg，比焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量
低一个数量级。因此，要品尝咖啡特殊的香气、口
感，最好饮用焙烤咖啡。
3 结语
采用超声波萃取咖啡中的葫芦巴碱能缩短分析
时间，提高分析效率;用 NH2 柱分离葫芦巴碱可以
弥补反相 C18 柱对葫芦巴碱吸附弱、柱效低等弱
点。准确度和精密度试验结果表明该方法准确可
靠，可以用于例行和大量样品的分析检测工作。
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