全 文 ：26 2013, Vol.34, No.14 食品科学 ※工艺技术
采用美拉德反应提高灰树花多肽的
抗氧化活性
陈贵堂1，周琼飞1，朱艳丽1，赵立艳2，刘 芳2，董满莉1
(1.中国药科大学药学院，江苏 南京 210009；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)
摘 要：为提高灰树花多肽的抗氧化活性，通过单因素试验和正交试验优化灰树花抗氧化肽的美拉德反应修饰工
艺。结果表明：灰树花抗氧化肽的最佳美拉德反应修饰工艺为，以果糖作为修饰反应物，抗氧化肽与果糖的质量比
2:1、反应初始pH12.0、反应时间100min，该条件下制备的美拉德反应产物的还原力大约是修饰前的7倍，对DPPH
自由基的清除率比修饰前增加了20.9%，其还原力和DPPH自由基清除能力与等质量浓度的抗坏血酸相当，提示美
拉德反应是提高灰树花多肽抗氧化活性的有效方法。
关键词：美拉德反应；灰树花；抗氧化肽
Improving of the Antioxidant Activity of Grifola frondosa Peptides by Maillard Reaction
CHEN Gui-tang1，ZHOU Qiong-fei1，ZHU Yan-li1，ZHAO LI-yan2，LIU Fang2，DONG Man-li1
(1. School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China；
2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract：The antioxidant activity of Grifola frondosa peptides was improved by Maillard reaction in this study. One-
factor-at-a-time and orthogonal array designs were employed to optimize the reaction conditions. The reducing power of
Grifola frondosa peptides was increased approximately 7 times by 100 min Maillard reaction with fructose at a peptide/
fructose ratio of 2:1 (m/m) and an initial pH of 12.0. In addition, the DPPH radical scavenging activity was elevated by
20.9% and the modifi ed antioxidant peptides had similar reducing power and DPPH radical scavenging activity to the
same concentration of ascorbic acid suggesting Maillard reaction to be effective in improving antioxidant activity of
antioxidant peptides.
Key words：Maillard reaction；Grifola frondosa；antioxidant peptide
中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)14-0026-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201314006
收稿日期：2013-04-01
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(31201344)；大学生创新药物研制能力提高项目(J1030830)；
国家级大学生创新创业训练计划项目
作者简介：陈贵堂(1977—)，男，副教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：caucgt@163.com
美拉德反应(Maillard reaction)是一种在食品加工过程中
广泛存在的非酶褐变反应，是指食品中的羰基化合物(还原
糖类)和氨基化合物(氨基酸、肽以及蛋白质)间发生的复杂反
应，它不仅赋予食品特殊的香味、滋味和颜色，而且可产生
具有较强抗氧化效果的活性物质[1-5]。美拉德肽是还原糖与
肽的美拉德反应产物(Maillard reaction products，MRPs)，具有
增强呈味食品的鲜味[6-8]、提高肽的抑菌活性[9-11]和抗氧化活
性[12-15]等多种作用，因此成为近年来的研究热点。
国内外对抗氧化肽的研究已持续多年，随着研究的
深入，人们发现，无论是选择不同的酶或底物，还是酶
解工艺的优化，酶解蛋白产物的抗氧化活性一直达不到
人工合成的抗氧化剂活性那么高，所以人们开始把目光
转向抗氧化肽的化学改性上来。大量实验结果证明，对
抗氧化肽进行美拉德反应修饰是提高其抗氧化活性的有
效途径。如张强等[16]以还原力为指标对双孢蘑菇源抗氧
化肽进行美拉德反应修饰研究，结果表明美拉德反应产
物的还原力大约是修饰前的5倍；乔路等[17]采用美拉德反
应处理皱纹盘鲍脏器肽，结果表明与反应前相比，美拉
德反应产物的DPPH自由基清除活性增强百倍，而羟自由
基清除活性及还原活性也增强数十倍；杨锋等[18]采用醋
蛋多肽与葡萄糖发生美拉德反应来改善醋蛋多肽的抗氧
化活性，结果表明与未反应的醋蛋多肽相比，反应产物
的DPPH自由基清除率从12.7%增加到了64.8%，Fe3+还原
能力(A700nm)从0.107增加到了0.718。
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.14 27
灰树花是一种药食兼用真菌，含有丰富的蛋白质、
多糖以及铁、锌等多种矿物元素，具有很高的营养保健
价值，目前有关灰树花多糖的研究已经取得了很多重大
突破，而利用灰树花子实体蛋白制备生物活性肽的研究
还未见报道。因此，本研究以灰树花子实体为原材料，
通过碱溶酸沉法提取灰树花蛋白，以碱性蛋白酶可控酶
解制备灰树花抗氧化肽，并以还原力为指标对灰树花抗
氧化肽进行美拉德反应修饰研究，以提高产物的抗氧化
活性，为灰树花抗氧化肽的化学改性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灰树花子实体干品，河北省迁西县板栗研发中心提
供。用中草药粉碎机粉碎，80目过筛，脱脂，50℃真空
干燥，备用。
胰蛋白酶(250U/mg，牛胰)、D-葡萄糖、D-果糖、乳
糖、麦芽糖 国药集团化学试剂有限公司；L-抗坏血酸
(分析纯) 上海研生生化试剂有限公司；三氯乙酸、磷
酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、铁氰化钾均
为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；DZF-
6050MBE型真空干燥箱 上海博迅实业有限公司；万分
之一天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；85-2A
型磁力搅拌器 南京科尔仪器有限公司；PHS-3C型精
密pH计 上海雷磁仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅 国
华电器有限公司；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器
厂；旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；TU1901紫
外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 灰树花子实体蛋白的提取
称取100g灰树花干粉，按质量比1:30添加蒸馏水，
搅拌均匀。用1mol/L NaOH溶液调pH值至10.0，磁力搅拌
器搅拌，40℃水浴保温1h，4500r/min离心10min。上清液
用1mol/L HCl溶液调pH值至3.5，4500r/min离心10min。
弃上清液，取沉淀真空干燥得灰树花子实体蛋白粉。
1.3.2 灰树花抗氧化肽的制备
采用本实验室得到的酶解工艺，将10g灰树花蛋白
粉加入200mL蒸馏水中，制成悬浮液，90℃水浴20min，
冷却后调pH值至9.0，加入0.2g胰蛋白酶，37℃水解4h，
期间用1mol/L NaOH溶液维持pH值恒定。沸水浴5min，
5000r/min离心15min，取上清液，旋转蒸发浓缩，真空干
燥，得灰树花抗氧化肽。
1.3.3 灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰的单因素试验
1.3.3.1 糖种类对美拉德反应产物还原力的影响
将10mg/mL的灰树花抗氧化肽溶液2.5mL分别与
10mg/mL的葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖溶液各2.5mL
混合于具塞试管中，用1mol/L的HCl和NaOH溶液调pH
10.0，再分别用蒸馏水将体积补足至10mL。将试管置于
100℃水浴中加热60min，然后立即在冰浴中冷却，测定
产物的还原力。
1.3.3.2 反应时间对美拉德反应产物还原力的影响
分别按肽糖比1:1量取10mg/mL 的灰树花抗氧化肽溶
液和10mg/mL的果糖溶液于具塞试管中，按上述方法测
定不同反应时间下产物的还原力。
1.3.3.3 pH值对美拉德反应产物还原力的影响
分别按肽糖质量比1:1量取10mg/mL的灰树花抗氧化
肽溶液和10mg/mL的果糖溶液于具塞试管中，按上述方
法测定不同pH值条件下产物的还原力。
1.3.3.4 肽糖比对美拉德反应产物还原力的影响
分别按肽糖比4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4量
取10mg/mL的灰树花抗氧化肽溶液和10mg/mL的果糖溶液，
按上述方法测定其在初始pH12.0条件下产物的还原力。
1.3.4 灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰的正交试验
根据单因素试验结果，按照L9(33)正交表进行正交试
验设计。
1.3.5 还原力的测定
参照Oyaizu[19]描述的方法略加修改。在试管中分别
加入样品溶液1mL，磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.6)
1.5mL和0.01g/mL的铁氰化钾5mL，摇匀，置于50℃水浴
中反应20min，然后加入0.1g/mL的三氯乙酸5mL，混合
后以3000r/min离心10min。取上清液2.0mL和2.0mL的蒸
馏水，加入0.4mL 1.0g/L三氯化铁，静置10min，然后在
700nm波长处测定吸光度。以0.2mg/mL的抗坏血酸代替
样品作为阳性对照，吸光度越大，还原力越强。
1.3.6 清除DPPH自由基能力测定
参照Chen Guitang等[20]描述的方法，略有改动。利
用DPPH溶液的特征紫红色团的吸收峰，以分光光度法测
定加不同浓度的抗氧化剂或样品后517nm吸收的变化表
示其对有机自由基的清除能力。取2.0mL水解液，加入
1.0mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)和2.0mL 0.2mmol/L
DPPH乙醇溶液，混合均匀，于室温暗处放置20min，然
后在517nm波长处测定其吸光度。以抗坏血酸为阳性对
照，DPPH自由基的清除能力以清除率计算。
清除率/%＝(1－A1－A2
A0
)×100
式中：A1为DPPH溶液＋样品溶液的吸光度；A2为乙
醇(DPPH溶剂)＋样品溶液的吸光度；A0为DPPH溶液＋水
(样品溶剂)的吸光度。
1.4 统计分析
实验数据以平均值±标准差表示，用SPSS 11.0软件
包进行方差分析。
28 2013, Vol.34, No.14 食品科学 ※工艺技术
2 结果与分析
2.1 糖种类对美拉德反应产物还原力的影响
cc
a
b
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
㨵㧘㊪ ᵰ㊪ 呺㢑㊪ ч㊪
A 7
00
nm
不同字母表示差异显著，P＜0.05。下同。
图 1 糖种类对美拉德反应产物还原力的影响
Fig.1 Effect of different sugars on reducing power of Maillard
reaction products
由图1可见，相同条件下以果糖对灰树花抗氧化肽进
行美拉德反应修饰的效果最好，葡萄糖次之，麦芽糖和
乳糖最差且差异不显著。所以选定果糖为美拉德反应的
供羰基底物。
2.2 反应时间对美拉德反应产物还原力的影响
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
20 40 60 80 100 120 140
ডᑨᯊ䯈/min
A 7
00
nm
图 2 反应时间对美拉德反应产物的影响
Fig.2 Effect of reaction time on reducing power of Maillard reaction products
由图2可知，反应产物的还原力随着反应时间的延长
呈现先升后降的趋势，在反应进行到100min时，反应产
物的还原力趋于最大，120min时略有下降，140min时还
原力明显下降。因此，选择反应时间为100min。
2.3 pH值对美拉德反应产物还原力的影响
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
7 8 9 10 11 12 13
pH
A 7
00
nm
图 3 pH值对美拉德反应产物还原力的影响
Fig.3 Effect of initial pH on reducing power of Maillard reaction
products
由图3可知，当反应体系的pH值小于9时，反应
微弱，产物的还原力很小，而当pH大于9.0时，还原
力开始迅速增加，pH12.0时还原力达到最大，再增大
pH值，还原力开始下降。因此，选择pH12.0进行后
续实验。
2.4 肽糖比对美拉德反应产物还原力的影响
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
4:1 3:1 2:1 1:1 1:2 1:3 1:4
㚑㊪↨
A 7
00
nm
图 4 肽糖比对美拉德反应产物还原力的影响
Fig.4 Effect of peptide/sugar ratio on reducing power of Maillard
reaction products
由图4可见，随着反应体系中灰树花抗氧化肽与果糖
所占比例的变化，修饰产物的还原力呈先上升后下降趋
势，当肽糖比为2:1时还原力达到最大值，故灰树花抗氧
化肽与果糖以质量比2:1进行反应效果最佳。
2.5 灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰的正交试验
正交试验设计与结果见表1。可以看出，极差值R反
映影响灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰的各因素的排列
顺序为A＞B＞C，即反应pH值＞反应时间＞肽糖比；最
佳反应组合为A2B2C2，即以灰树花抗氧化肽和果糖质量比
2:1、初始pH12.0条件下进行美拉德反应修饰，反应时间
为100min。经验证，在此条件下灰树花抗氧化肽美拉德
反应修饰产物的还原力最强，A700nm为1.993。
表 1 正交试验设计与结果
Table 1 Results and analysis from the orthogonal array design
试验号 A反应pH B反应时间/min C肽糖比 A700nm
1 1(11) 1(80) 1(3:1) 1.051
2 1 2(100) 2(2:1) 1.362
3 1 3(120) 3(1:1) 1.123
4 2(12) 1 2 1.836
5 2 2 3 1.981
6 2 3 1 1.429
7 3(13) 1 3 1.387
8 3 2 1 1.585
9 3 3 2 1.432
k1 1.179 1.425 1.355
k2 1.749 1.468 1.543
k3 1.468 1.328 1.497
R 0.570 0.315 0.122
2.6 灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰前后还原力的比较
灰树花抗氧化肽及其美拉德反应修饰产物的还原力
如图5所示。可知，灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰产物
的还原力明显提高，大约是修饰前的7倍，与阳性对照物
L-抗坏血酸无显著性差异。
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.14 29
aa
b
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
ডᑨࠡ ডᑨৢ ᡫണ㸔䝌
A 7
00
nm
图 5 灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰前后还原力的比较
Fig.5 Comparison of the reducing power of original and modifi ed
antioxidant peptides
2.7 灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰前后清除DPPH自
由基能力的比较
为进一步确证美拉德反应修饰对灰树花多肽抗氧化
能力的促进作用，考察灰树花多肽及其美拉德修饰产物
对DPPH自由基的清除效果，并与同质量浓度的阳性对
照物抗坏血酸进行比较，结果如图6所示。
aa
b
0
20
40
60
80
100
120
ডᑨࠡ ডᑨৢ ᡫണ㸔䝌
⏙
䰸
⥛
/%
图 6 灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰前后对DPPH自由基
清除能力的比较
Fig.6 Comparison of the DPPH radical scavenging activity of original
and modifi ed antioxidant peptides
由图6可以看出，美拉德反应修饰后，灰树花多肽
对DPPH自由基的清除能力也得到了显著提高，清除率
由反应前的66.4%升高到了87.3%，虽低于抗坏血酸的
90.5%，但无统计学差异。
3 结 论
灰树花抗氧化肽美拉德反应修饰的最佳工艺为以果
糖为修饰反应物，灰树花抗氧化肽与果糖的质量比2:1，
反应初始pH12.0，反应时间100min，该条件下得到修饰
产物的还原力大约是修饰前的7倍，DPPH自由基清除率
比修饰前提高了20.9%，表明美拉德反应修饰是提高抗氧
化肽抗氧化活性的有效手段，但由于美拉德反应是一个
复杂的反应体系，其产物具体组成、结构和性质等依然
尚未十分清楚，所以对美拉德反应产物的分离、纯化及
鉴定等工作有待进一步研究。
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