全 文 ：响应面法优化多棘海盘车消化腺、
生殖腺酶解工艺
曹荣1，张媛2，刘淇1，*，李幸1
（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，碳汇渔业实验室，山东青岛 266071；
2.獐子岛集团股份有限公司，辽宁大连 116001）
摘 要：多棘海盘车在我国黄海、渤海海域分布广泛，严重危害贝类养殖。为丰富其高值化加工利用的基础理论，本实
验以多棘海盘车消化腺、生殖腺为研究对象，以水解度为主要指标，结合酶解液风味分析，对水解用蛋白酶的种类进行
了筛选。在此基础上，进行了酶解工艺的单因素分析，并采用响应面中心组合设计建立了二次回归模型。结果表明，中性
蛋白酶适宜作为水解用酶，底物质量浓度、酶用量和水解时间对水解度影响较大，所建立的二次回归模型经方差分析和
实验验证，证实能够较好地反映多棘海盘车消化腺、生殖腺水解度的变化规律，最佳的水解工艺条件为：底物质量浓度
11.0 %、酶用量 1 768 U/g（以原料计）、水解时间 140 min，在此条件下水解度可达 45.67 %。
关键词：多棘海盘车；酶解工艺；响应面优化
Application of Response Surface Methodology on Enzymatic Hydrolysis of
Digestive Gland and Gonad of Asterias amurensis
CAO Rong1，ZHANG Yuan2，LIU Qi1，*，LI Xing1
（1. Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，
Shandong，China；2. Zhangzidao Group Co.，Ltd.，Dalian 116001，Liaoning，China）
Abstract：Asterias amurensis are widely distributed in China， and endanger shellfish aquaculture seriously. To
enrich the basic theory of high-valued processing of starfish， enzymolysisexperiment was designed and carried
out with digestive gland and gonad as the research object， and degree of hydrolysis as the main index. Protease
screening was done according to degree of hydrolysis and flavor analysis. Then， effect of single factorssuch as
substrate concentration， dosage of enzyme， hydrolyzation time， pH and temperature on the degree of hydrolysis
was analyzed. Central composite design was carried out to optimize the hydrolysis process and quadratic
regression model was established. Results showed that neutral protease is suitable as the hydrolysis enzyme.
Substrate concentration， enzyme dosage， and hydrolyzation time have significant influence on the degree of
hydrolysis.The quadratic regression model could reflect the hydrolyzation process， which was confirmed by
variance analysis and the experimental verification. Based on response surface analysis， the optimum conditions
were obtained as follows： substrate concentration of 11.0 %， enzyme dosage 1768 U/g material， and hydrolyzation
time of 140 min， under which the degree of hydrolysis could be 45.67 %.
Key words：Asterias amurensis；enzymatic hydrolyzation technology；response surface optimization
基金项目：中央级公益性科研院所专项资金项目（20603022011005）
作者简介：曹荣（1981—），男（汉），博士，研究方向：水产品高值化利用。
*通信作者：刘淇（1964—），男（汉），研究员，研究方向：水产品加工。
食品研究与开发
Food Research And Development
2014年 5月
第 35卷第 9期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.09.020
多棘海盘车（Asterias amurensis）（以下简称海星）
属于棘皮动物门（Echinodermata）、海星纲（Asteroidea）、
海盘车科（Asteriidae），主要分布在我国黄海、渤海海
域[1]。海星是一种底栖的海洋无脊椎动物，掠食扇贝、牡
蛎、鲍鱼等海珍贝类，对沿海的贝类养殖危害巨大[2]。
海星具有发达的消化腺和生殖腺（统称为海星
黄），其中含有丰富的营养成分[3]。另外，科研人员相继
从海星中分离到皂苷、甾醇、生物碱、多糖等多种结构
独特的化学物质[4]，这些化学物质表现出降血压、抑菌、
工艺技术
76
抗病毒等多种生理和药理活性[5]。海星在食品、动物饲
料、医药等领域均展现出良好的应用潜力。然而，海星
目前尚未得到有效的开发利用，有关海星黄蛋白水解
方面的研究也较少。大分子蛋白经酶解后，更有利于
后续的加工利用，为丰富海星高值化加工利用的基础
理论，本文以渤海产多棘海盘车为研究对象，研究了
生物酶法在海星黄蛋白水解中的应用效果，并采用响
应面法对酶解工艺进行了优化，以期为海星的开发利
用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
多棘海盘车由大连獐子岛集团股份有限公司提供。
中性蛋白酶（1.3×105 U/g）、菠萝蛋白酶（5.0×
105 U/g）、风味蛋白酶（1.5×104 U/g）、复合蛋白酶（1.5×
105 U/g）购于青岛诺马科生物科技有限公司。其他试剂
均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 可溶性蛋白含量测定
取 5.0 mL酶解液加入等体积的三氯乙酸（TCA）
溶液（质量分数 10 %），静置 20 min后，12 000 r/min离
心 20 min。取上清液，采用双缩脲比色法[6]测可溶性蛋
白含量。
1.2.2 氨基酸态氮含量测定
参照 GB/T 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方
法》，采用比色法测定[7]。
1.2.3 水解度测定
大分子蛋白通过酶的作用降解为小分子的可溶
性多肽和氨基酸，使得溶解性增加，因此可以用可溶
性蛋白和氨基酸含量的增加表征蛋白质水解的程度。
总蛋白含量的测定采用微量凯氏定氮法[6]。
按照如下公式计算水解度：
DH（%）= P2 - P1 +（N2 - N1）× 9.14N0 - P1 - N1 × 9.14
× 100
式中：DH（degree of hydrolysis）为水解度；P2为酶
解液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；P1为水解前海星黄匀
浆液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；N2为酶解液中氨基
酸态氮含量，（mg/g）；N1为水解前海星黄匀浆液中氨
基酸态氮含量，（mg/g）；N0为海星黄中蛋白质总含量，
（mg/g）；9.14为氨基酸态氮与氨基酸含量之间的换算
系数（以 20种氨基酸平均分子量 128计）。
1.2.4 气味组成分析
采用 PEN3便携式电子鼻（德国 AIRSENSE公司）
检测酶解液气味组成。取样品 1 mL，置于 20 mL顶空
瓶中，加盖密封。25℃恒温静置 20 min，用电子鼻采集
数据，采用系统自带软件进行数据处理。
1.2.5 水解用酶的筛选
取海星黄，加适量纯净水后匀浆。匀浆液分别添
加中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白
酶，在各自适宜条件下，进行水解试验，测定酶解液水
解度和气味组成。
1.2.6 单因素试验
确定试验用酶的基础上，进行底物质量浓度、酶
用量、水解时间、pH、温度等单因素试验，考察各因素
对水解度的影响。
1.2.7 响应面分析
应用 Design Expert7.0软件，以水解度为响应值，
基于单因素试验结果，选取底物质量浓度、酶用量和
水解时间进行响应面试验设计，因素水平见表 1。
1.2.8 数据处理
试验设 3个平行，试验结果以平均值±标准偏差
表示，采用软件 SPSS 17.0进行数据统计分析，显著性
检验采用 ANOVA，以 P＜0.01为极显著，P＜0.05为显
著，P＞0.05为不显著。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶种类筛选
中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋
白酶是水产动物蛋白水解的常用酶[8]。固定底物质量
分数 5 %、酶用量 2 000 U/g原料、水解时间 90 min，4种
蛋白酶在各自最适 pH和温度条件下，对海星黄进行
水解，其水解度分别为 38.00 %、25.64 %、8.24 %和
27.47 %。中性蛋白酶对应的水解度相对较高。
4种蛋白酶对应的酶解液气味如图 1所示。
表 1 响应面试验设计因素水平表
Table 1 Design of response surface analysis
水平
因素
A 底物质量浓度/%
B 酶用量（以原料
计）/（U/g）
C 水解时间/min
-1 5.0 800 30
0 10.0 1 400 90
1 15.0 2 000 150
图 1 酶解液气味组成分析
Fig.1 Flavor analysis of enzymatichydrolysate
复合蛋白酶
风味蛋白酶
菠萝蛋白酶
中性蛋白酶
原液
R（6）
R（5）
R（4）
R（3）
R（2）
R（1）
R（10）
R（9）
R（8）
R（7）
0
0.5
1
1.5
2
2.5
曹荣，等：响应面法优化多棘海盘车消化腺、生殖腺酶解工艺工艺技术
77
中性蛋白酶和菠萝蛋白酶对应的酶解液气味组成
与原液基本一致，10个传感器中，R（1）、R（3）、R（7）、R（9）
的响应值略有增大。而风味蛋白酶和复合蛋白酶对应
的酶解液气味组成与原液相差较大，其中 R（6）和 R（8）
传感器的响应值明显增大（P>0.05）。4种蛋白酶对应的
酶解液气味在感官上均可接受，都具有海星特有气味
且无明显腥、臭等不良气味。由于中性蛋白酶对应的水
解度相对更高且价格便宜，因此作为后续试验用酶。
2.2 酶解条件单因素分析
以中性蛋白酶作为水解用酶，考察了底物质量分
数（5 %~20 %）、酶用量（500 U/g~8 000 U/g）、pH（6.0~
8.0）、温度（35℃~55℃）、时间（30 min~180 min）等条件
对水解度的影响，结果见图 2。单因素试验结果表明：
采用中性蛋白酶对海星黄进行酶解，适宜的底物质量
浓度为 10 %左右、酶用量为 2 000 U/g 原料左右、
pH6.5~7.5、温度 45℃、水解时间 90 min左右。
2.3 酶解工艺的响应面优化
2.3.1 响应面试验结果与方差分析
在单因素试验基础上，根据中心组合设计原理，
以水解度为响应值，选取底物质量分数、酶用量和水
解时间进行响应面试验，试验设计和结果见表 2。
表 2 响应面试验设计与结果
Table 2 Results of response surface experiment
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
水
解
度
/%
5 10 20
底物质量分数/%
15
（a）
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
水
解
度
/%
200 500 8 000
酶量/（U/g）
1 000
（b）
2 000 4 000
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
水
解
度
/%
6.0 6.5 8.0
pH
7.0
（c）
7.5
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
水
解
度
/%
35 55
温度/℃
45
（d）
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
水
解
度
/%
30 240
时间/min
60
（e）
90 120 180
图 2 底物质量分数（a）、酶用量（b）、pH（c）、温度（d）和水解时间
（e）对水解度的影响
Fig.2 Effect of substrate concentration（a），dosage of enzyme（b），
pH（c），temperature（d）and time（e）on the degree of hydrolysis
试验号
A底物质量
浓度/%
B酶用量（以原
料计）/（U/g）
C作用
时间/min
水解度/%
1 9.03 800 101.6 33.71
2 15.00 2 000 30.0 25.57
3 15.00 800 30.0 16.87
4 5.00 1 229 150.0 34.38
5 15.00 2 000 30.0 25.97
6 5.00 800 30.0 16.58
7 5.00 1 257 72.8 30.97
8 11.49 1 250 150.0 42.66
9 9.04 1 515 30.0 30.16
10 5.00 2 000 72.3 31.99
11 9.03 800 101.6 34.05
12 15.00 800 150.0 31.65
13 15.00 800 150.0 31.58
14 11.47 2 000 150.0 44.76
15 15.00 800 30.0 16.85
16 11.62 1 104 60.0 33.41
17 5.00 2 000 150.0 36.51
18 8.90 1 528 105.0 43.00
19 15.00 1 515 101.5 39.01
20 5.00 800 30.0 16.22
工艺技术曹荣，等：响应面法优化多棘海盘车消化腺、生殖腺酶解工艺
78
采用 Design-Expert 7软件对表 2数据进行分析，
通过二次多元回归拟合，得到水解度对底物质量分数
（A）、酶用量（B）和水解时间（C）的回归方程为：DH %=
0.41+0.014A+0.043B+0.069C+4.186E-003AB+7.425E-
003AC+2.709E-003BC-0.056A2-0.037B2-0.043C2
对模型进行方差分析，结果见表 3。
可以看出，模型的 P值小于 0.01，表明模型高度
显著，而失拟项不显著（P＞0.05），说明方程对试验拟合
较好。在所选取的因素水平范围内，各因素对水解度
的影响均极显著，且影响大小依次为：C水解时间＞B
酶用量＞A底物质量浓度。
2.3.2 响应曲面图分析
模型中 AB、AC、BC交互项的响应曲面图见图3，
三维曲面图越凸的位点表示响应值越大 [9]，可以看出
AB、AC、BC交互作用均显著（P＜0.01），这和表 3的结
果一致。
2.3.3 验证实验
通过 DesignExpert对回归方程求解，得到海星黄最
佳水解条件为：底物质量浓度 11.0 %、酶用量（以原料
计）1 768 U/g、水解时间 140min，水解度的理论值可达
45.67%。在此条件下进行验证实验，3次试验的均值为
44.82 %，与理论预测值的相对误差仅为 1.9 %，说明该
模型适宜对海星黄酶解工艺进行分析和预测。
3 讨论与结论
海星黄是优质的蛋白来源，通过酶解将大分子蛋
白质水解为小分子肽和氨基酸，一方面有助于作为食
品利用时的消化吸收[10]，另一方面获得的多肽可能具
有潜在的生物活性[11]。利用酶工程技术水解海洋动物
蛋白一直是研究的热点，研究领域主要集中在鱼 [12]、
虾[13]、贝类[14]，有关海星黄酶解的研究鲜有报道。
水解度是指蛋白质的肽键被裂解的程度或百分
比[15]，可以表征大分子蛋白质被降解为小分子肽或氨
基酸的程度。水解度的测定可以通过滴定释放出的质
子（如 pH-state法[16]）、检测可溶性蛋白或游离氨基酸
含量的变化实现[17]。蛋白酶解过程中，可溶性蛋白和游
离氨基酸含量可能同时增加，在酶解的不同时期两者
产生的速率也有差别。本文为提高数据准确性，同时
检测酸可溶性蛋白和游离氨基酸含量变化，将两者含
变异来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性
模型 0.1500000 9 0.0160000 4850.00 <0.000 1 **
A 0.0017600 1 0.0017600 519.00 <0.000 1 **
B 0.0180000 1 0.0180000 5330.00 <0.000 1 **
C 0.0430000 1 0.0430000 12700.00 <0.000 1 **
AB 0.0001270 1 0.0001270 37.30 0.000 1 **
AC 0.0004230 1 0.0004230 125.00 <0.000 1 **
BC 0.0000527 1 0.0000527 15.50 0.002 8 **
A2 0.0095500 1 0.0095500 2820.00 <0.000 1 **
B2 0.0043600 1 0.0043600 1280.00 <0.000 1 **
C2 0.0054400 1 0.0054400 1600.00 <0.000 1 **
残差 0.0000339 10 0.0000034
失拟项 0.0000137 5 0.0000027 0.67 0.662 3
纯误差 0.0000203 5 0.0000041
总变异 0.1500000 19
表 3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of the regression model
注：**为影响极显著，P＜0.01；*为影响显著，P＜0.05。
15.00
12.50
10.00
7.50
5.00800.00
1100.00
1400.00
1700.00
2000.00
0.28
0.325
0.37
0.415
0.46
水
解
度
/%
A：底物质量分数B：酶量
15.00
12.50
10.00
7.50
5.0030.00
60.00
90.00
120.00
150.00
0.24
0.295
0.35
0.405
0.46
水
解
度
/%
A：底物质量分数C：时间
2000.00
1700.00
1400.00
1100.00
800.0030.00
60.00
90.00
120.00
150.00
0.22
0.28
0.34
0.4
0.46
水
解
度
/%
B：酶量C：时间
图 3 因素 A（底物质量分数）、B（酶用量）、C（时间）交互项的响应
曲面图
Fig.3 Interaction diagram of factor A（substrate concentration），
B（enzymedosage）and C（time）
曹荣，等：响应面法优化多棘海盘车消化腺、生殖腺酶解工艺工艺技术
79
耗，保证了速冻玉米良好的外观和应有的口感。因此，速
冻玉米在冻结后必须进行包装才能长时间冻藏。包冰衣
处理与真空包装相比，冻藏 4个月内两者对抑制失水的
作用相差不大，但随着贮藏时间的延长，真空包装的玉米
失重率明显低于包冰衣处理的玉米。由此可知，对冻藏时
间为 3个月左右的速冻玉米采用包冰衣处理既能保持产
品品质，又不会增加生产成本，但对需要长期进行冻藏的
玉米来说，则采用真空包装效果更佳。
3 结论
鲜食玉米冻结时过冷点为-1.2℃，冰点为-0.7℃，
最大冰晶生成区范围在-5 ℃~-1.2 ℃之间。速冻过程
中玉米温度在 9 min内从-1.2℃降至-5℃以下才能达
到良好的速冻效果。采用 1 %的食盐溶液浸泡鲜玉米
穗 20 min，可达到驱虫和护色的效果；相比较水煮、红
外干烫漂而言，汽蒸是一种比较理想的烫漂方法，烫
漂时间为 22 min~30 min可使多酚氧化酶发生变性；冻
藏过程中玉米中的可溶性总糖、蛋白质、水分的含量
均有下降趋势，保藏 8个月仍能保持的感官品质，速冻
玉米在-18℃采用包冰衣的方法可满足 0~3个月的短
期保藏，采用真空包装可保藏 6~8个月。
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收稿日期：2013-10-02
量与不溶性蛋白的比作为水解度值。
响应面分析法在试验设计和结果表述方面具有
独特优势[18]。本实验采用响应面法得到的海星黄水解
工艺为：底物质量分数 11.0 %、酶用量（以原料计）
1 768 U/g、水解时间 140 min，此条件下水解度可达
44 %以上，所建立的二次回归模型可较好的模拟海星
黄的水解规律，对于相关产品的开发和生产具有一定
的参考价值。
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收稿日期：2013-08-19
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工艺技术曹荣，等：响应面法优化多棘海盘车消化腺、生殖腺酶解工艺
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