全 文 ：木芙蓉叶提取物抗病毒作用实验研究
张　丽 ,周长征＊
(山东中医药大学药学院 ,山东 济南 250355)
　　摘要　目的:观察木芙蓉叶提取物体内 、体外抗病毒的药理作用。方法:通过使用呼吸道合胞病毒(RSV)、
甲型流感病毒(Flu A)和副流感病毒(HPIVs)致细胞病变的体外感染模型 ,以治疗指数(TI)为指标 ,观察木芙蓉
叶提取物体外抗病毒作用;通过使用呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠模型 ,以对小鼠病毒感染肺指数的抑制率
为体内抗病毒活性指标 ,观察木芙蓉叶提取物体内抗病毒作用。结果:体外试验表明 ,木芙蓉叶提取物对呼吸
道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(Flu A)和副流感病毒(HPIVs)这 3种病毒均有不同程度的抑制作用;体内试
验表明 ,木芙蓉叶提取物表现出一定的体内抗病毒活性 ,在一定浓度范围内 ,抗病毒活性随剂量的增大而增强 。
结论:木芙蓉叶提取物具有显著的抗病毒药理活性 。
　　关键词　木芙蓉叶提取物;抗病毒;病变效应;治疗指数;肺指数;小鼠
　　中图分类号　R285.5　　　　　　文献标志码　A 文章编号　1007-4813(2013)01-0028-03
Antiviral Actions of the Extracts of Hibiscus Mutabilis L.
ZHANG Li ,ZHOU Chang-zheng＊
(College of Pharmacy ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine , Jinan 250355 Shangdong Province ,China)
ABSTRACT　Objective:To investigate the inhibitory effect on extracts of the leaf of hibiscus mutabilis L.in vitro and vi-
vo.Method:The inhibitory cytopathic effects(CPE)of extracts of the leaf of hibiscus mutabilis L.observed by HEK-293
cell culture infected by RSV ,Flu A and HPIVs , and use therapeutic index(TI)as an index;to observe inhibitory effect on ex-
tracts of the leaf of hibiscus mutabilis L.in vivo , the experiment were done by calculated the lung index and observed the
pathological change of the mice which were given extracts of the leaf of hibiscus mutabilis L.infected with RSV.Result:The
extracts of the leaf of hibiscus mutabilis L.has an inhibiting ability to RSV ,Flu A and HPIVs in different degrees in vitro;
in vivo , the extracts has the inhibitory effect , and showed a concentration-dependent response in inhibiting RSV.Conclu-
sion:The extracts of the leaf of hibiscus mutabilis L.has the marked inhibitory pharmacological activity in vitro and vivo.
KEYWORDS　Extracts of the leaf of hibiscus mutabilis L.;Antiviralactions;Cytopathic effect(CPE);Therapeutic index
(TI);The lung index;Mouse
　作者简介:张　丽(1986-),女 , 硕士研究生。研究方向:药物新剂型与新制剂研究。
＊通信作者:周长征 ,男 , 教授 ,硕士研究生导师 , Tel:13156103400 , E-mail:zlstar8866@sina.com。
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第29卷第1期
2013 年 2月
长 春 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine
Vo1.29
2 , 2013
DOI :10.13463/j.cnki.cczyy.2013.01.076
　　木芙蓉叶为锦葵科植物木芙蓉 Hibiscus mutabilis
L.的干燥叶 ,其味微辛 ,性凉 ,归肺 、肝经 ,具有清肺
凉血 、散热解毒 、消肿排脓等功效 ,临床主要用于肺热
咳嗽 、瘰疬等的治疗[ 1] 。本实验通过体外建立细胞感
染模型试验和体内感染小鼠试验来验证木芙蓉叶提
取物具有抗病毒的药理活性 ,以期为木芙蓉叶能开发
成一种防治病毒的新药提供药效学依据 。
1　实验材料
1.1　药物　木芙蓉 Hibiscus mutabilis L.叶购于安徽
濠州药材市场 ,由周凤琴教授鉴定 。阳性对照药利巴
韦林针剂(100mg/mL ,山东鲁抗医药集团有限公司)。
1.2　病毒　呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒
(Flu A)和副流感病毒(HPIVs)均引自中国疾病预防
控制中心病毒病预防控制所。
1.3　细胞　HEK-293细胞(人胚胎肾细胞系)购自美
国Clontech公司。
1.4　试剂　MEN 培养基(美国 Gibco 公司);新生小
牛血清(杭州四季青公司);胰酶(美国 Gibco 公司);
细胞维持液(含 2%新生牛血清的MEN);细胞培养液
(含 10%新生小牛血清的 MEN);其他试剂均为分析
纯。
1.5　仪器 　CO2 恒温培养箱(美国 Forma 公司);
-80 ℃冰箱(美国 Forma 公司);-20 ℃冰箱(中国青
岛得贝公司产品);酶标仪(芬兰 Labsystems公司);倒
置显微镜(日本 Olympus 公司);高速离心机(德国
Heraeus公司);旋转蒸发仪(中国上海鑫培仪器设备
有限公司)。
1.6　动物　昆明种鼠 ,雄性 ,体质量 13 ～ 14 g ,洁净
级 ,引自山东大学动物中心。
2　实验方法
2.1　提取物的制备　木芙蓉叶煎煮 3 h ,水提液减压
浓缩至稠浸膏 ,加入乙醇进行醇沉 ,过滤得到沉淀 ,沉
淀用蒸馏水溶解 。用 D101型大孔吸附树脂进行洗脱
得到 25%乙醇洗脱液 ,浓缩洗脱液 ,使其生药含量为
0.5 g/mL ,药液过 0.2μm孔径滤膜除菌 ,备用 。
2.2　体外抗病毒试验
2.2.1　药物细胞毒性测定　将HEK-293细胞悬液接
种于 96孔板中 ,使其长成单层细胞。用细胞维持液
以2倍比稀释阳性对照药品利巴韦林和木芙蓉叶提
取物 ,每孔 100μL ,每个稀释度纵向设立 3个复孔 ,平
行方向设 2行正常细胞对照 。将 96孔板置 37 ℃,
5%CO2 培养箱中培养 ,每日用显微镜观察细胞生长
状态和形态的变化 ,连续观察 5 d ,染色 ,使用酶标仪
在540 nm处测定各孔光吸收值 ,利用 Reed-Mucnch法
计算药物半数中毒浓度(TC50)[ 2] 。
2.2.2　药物的抑毒作用　将细胞悬液接种于 96 孔
板中 ,使其长成单层细胞 ,倒掉培养液 ,将待测药液按
2倍比稀释顺序横向接种在各孔中 ,每孔 100 μL 药
液 ,然后接种 100TCID50的不同病毒液 50 μL ,每种病
毒横向接种 1行 ,纵向设置 3个复孔 ,每块 96孔板均
设置利巴韦林阳性药品对照 ,病毒对照 ,正常细胞对
照以及空白对照(无细胞生长)。置 37 ℃, 5%CO2 培
养箱中培养 5 d ,每日观察细胞生长状态和形态 ,以细
胞病变效应(CPE)为指标 ,以病毒对照出现 4级 CPE
为终点 ,染色 ,使用酶标仪在 540 nm 处测定各孔光吸
收值 ,计算细胞存活率 ,利用 Reed-Mucnch 法计算半
数有效浓度(EC50),得到治疗指数 TI=(TC50/EC50),
治疗指数越大表示药物作用越强。细胞病变效应
(CPE)划分级别[ 3] :0级细胞无病变出现 ,正常生长;1
级细胞出现 25%以下的病变;2级细胞出现 25%～
50%的病变;3级细胞出现50%～ 75%的病变;4级细
胞出现 75%以上的病变。
2.3　体内抗病毒试验
2.3.1　接种病毒剂量的测定　昆明种小鼠 40只 ,将
动物按体质量随机分为 4组 ,每组 10只 ,分别为:病
毒大剂量组 、病毒中剂量组 、病毒小剂量组和正常对
照组。各组动物乙醚麻醉[ 4] 下分别鼻腔接种上述
RSV毒液(效价 320∶1)50 、25 、12.5 μL 和细胞培养液
50μL ,常规喂养 ,每日观察动物存活情况 ,记录死亡
动物及时解剖 ,做病理学检测 。在第 7 天末次给药
40 min后 ,将动物眼动脉丛放血 ,牵颈臼处死 ,无菌取
肺组织 ,做病理学检测[ 5] 。
2.3.2　药物体内抗病毒活性测定　将动物随机分为
正常对照组 、病毒模型对照组 、利巴韦林对照组和木
芙蓉叶提取物大 、中 、小剂量治疗组 ,每组 10只 。在
乙醚麻醉下 ,正常组动物鼻腔接种细胞培养液 25μL ,
其余动物均鼻腔接种 RSV毒液 25 μL。药物灌胃 ,每
日 2次 ,连续 7 d 。每日观察动物鼻腔是否有分泌物 、
存活情况 ,在第 7天末次给药 4 h后 ,将动物称重后
眼动脉丛取血 、牵颈臼处死 ,无菌条件下取肺组织 ,称
重计算肺指数 ,得到肺指数抑制率[ 5] 。(肺指数=小
鼠肺重/小鼠体质量×100%;肺指数抑制率=(病毒
对照组平均肺指数-给药组平均肺指数)/病毒对照
组平均肺指数×100%)
3　实验结果
3.1　体外抗病毒试验结果　木芙蓉叶体外抗病毒试
验结果表明木芙蓉叶提取物对 3 种病毒都有不同程
度的抑制作用 , 其提取物对抑制呼吸道合胞病毒
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(RSV)的增殖有较为显著的作用 , 治疗指数达到了
89.08 ,对甲型流感病毒(Flu A)也有较好的抑制作用 ,
但对副流感病毒(HPIVs)致细胞病变的抑制作用相对
较小(见表 1)。
表 1　木芙蓉叶体外抗病毒试验结果
项　目 治疗指数 TI
RSV Flu A HPIVs
木芙蓉叶提取物 89.08 54.53 26.33
利巴韦林阳性对照 62.22 49.27 51.46
3.2　体内抗病毒试验结果
3.2.1　接种病毒剂量测定的结果　与正常对照组比
较 ,接种病毒组动物毛色暗淡 ,缺乏光泽 。正常对照
组动物无死亡;大剂量病毒组动物在造模第 6天死亡
3只;中 、小病毒剂量组动物无死亡 。大剂量组肺组
织外观出现明显充血 、出血斑点或花纹等症状 ,有 2
只动物出现一叶肺萎缩 , 有 3 只动物出现一叶肺实
变;中剂量病毒组动物肺组织也可见到充血或花纹;
小剂量病毒组 3只动物肺组织出现斑点 。病毒重分
离大剂量病毒组有 9只 、中剂量 8只 、小剂量 2只分
离到病毒(见表 2)。考虑到本实验的目的是观察木
芙蓉叶提取物防治上呼吸道感染的效果 ,所以决定采
用25 μL病毒为造模适宜剂量 。
表 2　接种病毒剂量测定结果
项　目 正常对照组病毒大剂量组中剂量组 小剂量组
肺组织病毒阳性率 0/ 10 9/ 10 8/10 2/10
3.2.2　药物体内抗病毒活性测定结果　通过统计学
数据处理 ,病毒对照组与正常组比较肺指数有显著差
异(P<0.01), RSV 可以引起正常鼠肺指数的升高 ,
表示造模成功;经过药物灌胃治疗后 ,3 组木芙蓉叶
提取物给药组 ,利巴韦林阳性对照组均能降低由 RSV
引起的小鼠肺部感染的肺指数 ,与病毒对照组比较均
具有统计学意义(P<0.01 , P<0.05)(见表 3)。试验
结果说明木芙蓉叶提取物可以抑制由 RSV 引起的小
鼠上呼吸道感染 ,并且在一定的剂量范围内 ,其活性
随剂量的增大而增强 。
4　讨论
上呼吸道感染是临床上的常见病 ,常由呼吸道合
胞病毒 、流感病毒和副流感病毒等引起 。目前治疗呼
吸道病毒感染的药物主要有利巴韦林 、金刚烷胺 、聚
肌胞等药物[ 6] ,这些药物的抗病毒谱相对较窄 ,而且
这些药物的不良反应较大 ,所以寻求效果显著 、不良
反应小的药物是目前研发的主要目标 ,所以中药成为
治疗病毒性上呼吸道感染的热门。[ 7-8]
表 3　木芙蓉叶提取物对 RSV感染小鼠肺部炎症(肺指
数)的影响( x±s , n =10)
组　别 药物剂量/(g/ kg) 肺指数
肺指数
抑制率/ %
正常对照组 — 0.92±0.096　　 —
病毒对照组 — 1.61±0.530## —
利巴韦林对照组 0.05 1.14±0.340■■ 29.19
木芙蓉叶提取物(高)组 40 1.21±0.270■■ 24.84
木芙蓉叶提取物(中)组 20 1.36±0.180■　 15.53
木芙蓉叶提取物(低)组 10 1.43±0.470■　 11.18
　　注:与正常组比较 , #P <0.01;与模型组比较 , ■P< 0.01 ,
■■P<0.05。
通过体外抗病毒实验证明 ,木芙蓉叶提取物对
RSV等 3种病毒均具有体外抗病毒作用 ,尤其是对
RSV的抑制作用较强;通过体内试验从肺组织外观可
以观察到肺组织的病变程度有了明显的减轻 ,肺指数
降低较为显著 ,证明木芙蓉叶提取物在所试剂量范围
内对 RSV引起的肺部炎症有明显的抑制作用。所以
综合体内 、体外实验的结果可知木芙蓉叶提取物具有
较好的抗病毒作用 ,为治疗上呼吸道病毒感染疾病提
供了充分的药理药效学基础。
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长 春 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine
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