全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceut ical Biotechno logy 　2005 ,12(3):175 ～ 178
灰树花菌丝体多糖的分离纯化和理化性质研究*
刘晓雯 ,陈向东 ,吴梧桐*
(中国药科大学生命科学与技术学院 , 江苏 南京 210009)
摘　要　对灰树花菌丝体粗多糖进行分离纯化和结构鉴定 , 并检测其活性。采用大孔树脂进行脱色 , 紫外
扫描 、红外 、薄层层析 、以及高效液相和气相色谱等进行纯度和结构鉴定 , 荷瘤小鼠检测抗肿瘤活性。结果表明
弱极性和非极性的大孔树脂对色素的吸附量大 , 解吸容易 ,适用于灰树花菌丝体粗多糖的脱色 , 同时利于色素的
收集及进一步研究。分离所得的多糖为白色粉末状 ,为 a-葡聚糖 ,对 S180 肿瘤有明显抑制作用。
关键词　灰树花多糖;分离纯化;理化性质;抗肿瘤
中图分类号:Q539　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2005)03-0175-04
　　灰树花(Gri f ola f rondosa)是一种药 、食兼用
的珍稀食用菌。灰树花多糖是其中最重要的一类
活性成分 ,它具有广泛的约理活性 ,如抗肿瘤[ 1 , 2] ,
抗糖尿病[ 3 , 4] , 抗脂肪肝 , 抗氧化[ 5 , 6] , 以及抗辐
射[ 7] ,调节免疫功能 ,抗菌[ 8] 等 。灰树花粗多糖呈
黄褐色 ,色素较多 ,并影响多糖的分离纯化与测定 ,
因此脱色对于多糖的分离纯化是一个关键技术 。
本研究选择适宜的大孔树脂 ,对灰树花粗多糖进行
脱色 ,分离得到无色多糖 ,并对纯化方法 、理化性质
及抗肿瘤活性进行了探讨 。
1　材　料
1. 1　试剂
灰树花菌丝体粗多糖 ,由山东京博生物科技公
司提供;大孔树脂 , 购自天津南开大学化工厂;
Sephadex G-200 , Sigma 出品;单糖标准品 , Sigma
出品;其余试剂均为国产分析纯。
1. 2　仪器
BS-100A 自动部分收集器;HP-6890 气相色
谱仪;UV-9100 紫外可见分光光度计;Shimadzu
Ft ir-8400S 红外仪;Perkin-Elmer Lambda-2 紫外
可见分光光度计;R-202旋转蒸发器 。
1. 3　实验动物
昆明种小白鼠 , 18 ～ 22 g ,雌雄兼用 ,中国药科
大学实验动物中心提供。
2　方　法
2. 1　多糖的分离纯化
将灰树花菌丝体粗多糖以 10倍热水浸提 ,离
心 ,去残渣。对上清液进行紫外扫描 、显色反应 、沉
淀反应等定性分析[ 9] ,以确定色素性质及脱色检测
指标 。再经静态吸附与洗脱实验 ,以及吸附动力学
实验 ,选择合适的树脂对浸提液进行脱色。树脂以
水洗脱 ,洗脱液浓缩 ,加 5倍量 95%乙醇 ,离心 ,沉
淀用无水乙醇及丙酮洗涤 ,减压干燥 ,得水提多糖 ,
以硫酸-苯酚法测定糖含量 。
上述水提所得多糖溶于水 ,经 Sephadex G-200
柱层析(1 cm×70 cm),0. 05 mol /L NaCl洗脱 ,硫酸-
苯酚法检测 ,收集含糖管 ,透析 ,浓缩 ,醇沉 ,沉淀以
无水乙醇 、丙酮洗涤 ,减压干燥 ,得多糖纯品。
2. 1. 1　静态吸附与洗脱实验　量取一定体积已处
理的树脂 ,精确加入稀释的浸提液 ,水浴摇床于
25℃振摇 24 h后 ,滤出水液 ,树脂再加入一定体积
的 95%乙醇 ,于 25℃振摇解吸。色素吸附率及解
吸率以浸提液 A280计算:
Q =(A o - A s) /A o ×100%　R =A j /A o ×100%
Q:吸附率;A o :树脂吸附前浸提液 280 nm 初
始吸收值;A s :树脂吸附后浸提液 280 nm 吸收值;
R:解吸率;A j :树脂解吸后浸提液 280 nm吸收值 。
2. 1. 2　吸附动力学实验　根据树脂的静态吸附量
175
* 收稿日期:2004-12-28　修回日期:2005-01-02
作者简介:刘晓雯 ,女 , 1978年生 ,云南昭通人,中国药科大学生命科学与技术学院 2002级硕士,研究方向为多糖类药物的研究。
　 *　通讯作者:吴梧桐 ,中国药科大学生命科学与技术学院 ,教授 ,博导 , Tel:025-83220372
对时间作图 ,得到吸附动力学曲线 ,分析树脂的吸
附特性及吸附速率。
2. 2　多糖的纯度鉴定
2. 2. 1　紫外扫描　多糖纯品配制成 1 mg /ml溶
液 ,400 ～ 200 nm进行扫描。
2. 2. 2　HPLC　多糖纯品溶于水 ,进行 HPLC 层
析(柱为 shodex KS-804), 0. 1 mol /L NaNO3 洗
脱 ,示差检测。
2. 3　单糖组成分析[ 10]
多糖纯品 5 mg 以 2 mo l /L 三氟乙酸于封管水
解 3 h ,减压抽干三氟乙酸 ,得水解物 ,溶于水进行
硅胶薄层层析 ,展开系统乙酸乙酯 —醋酸—甲醇—
水( 12∶3∶3∶2),苯胺-邻苯二甲酸显色。多糖水
解物制备糖醇乙酸酯衍生物 ,进行 GC 分析 ,色谱
柱为 HP-5%苯甲基硅烷毛细管柱( 30m×0. 5mm
×0. 25μm )N 2 流速为恒流模式 1. 3 m l /min ,程序
升温:150 ～ 190℃, 1℃/min;190 ～ 230℃,
10℃/min;检测器为 FID。
2. 4　多糖的红外光谱
多糖纯品以溴化钾压片 ,于 4 000 ～ 400 cm - 1
进行扫描 。
2. 5　多糖的抗肿瘤活性研究
2. 5. 1　抗肿瘤实验瘤细胞悬浮液的制备与接种　
抽取腹腔接种瘤细胞 9 ～ 10 d的小鼠腹水 ,用无菌
生理盐水稀释成 1 ×107 个 /毫升浓度的瘤细胞悬
浮液 ,取艾氏腹水瘤细胞用无菌生理盐水稀释成
1×107 个 /ml浓度的瘤细胞悬浮液 ,每只小白鼠
腹腔接种 0. 2m l稀释悬浮液 ,雌雄兼用 ,接种后随
机分组 ,每组 10只。
2. 5. 2　给药　接种 24 h 后给药 ,纯品多糖静脉注
射给药 ,隔日一次 ,每次 0. 4 ml ,共5次 。以环磷酰
胺为阳性对照 , 腹腔注射给药 , 隔日一次 , 每次
0. 2 ml ,共 5次 。颈椎脱臼处死小鼠 ,剥取瘤块称
重。按下式计算肿瘤生长抑制率:肿瘤抑制率
(%) =(C - T) /C ×100%, 其中 C为对照组平均
瘤重(g), T 为实验组平均瘤重(g)。
3　结果
3. 1　多糖的分离纯化
浸提液经紫外扫描 ,在 280 nm 处有特征吸
收峰 ,因为灰树花粗多糖用考马斯亮兰法未检出
蛋白质 ,而粗多糖与 Folin-酚试剂显色 ,所以这一
特征吸收峰不是由蛋白质所产生 ,而是由其它还
原性物质产生的。浸提液经显色反应 ,与三氯化
铁乙醇溶液显墨绿色;加溴水产生白色沉淀 ,经
以上定性鉴别 ,认为灰树花粗多糖色素属于酚类
物质。根据酚类物质中含有苯环及阴离子基团
的结构特征 ,选择吸附型和离子交换型共 7种树
脂进行脱色比较 ,并选择其特征吸收峰作为脱色
检测指标 。
根据吸附动力学曲线 , 7 种树脂吸附30m in
后 ,吸附量均可达平衡吸附量的 90%以上 。从表 1
所示的吸附率及解吸率看 , 5种离子交换型树脂
(D392 ,D380 , D296R ,D290 , D201)虽然吸附量大 ,
但解吸困难 ,而吸附型树脂 AB-8对于粗多糖液色
素吸附量大 ,解吸容易 ,适合浸提液的脱色。浸提
液以 AB-8脱色后所得多糖 ,硫酸-苯酚法测定糖含
量为 80%,收率为菌丝体粗多糖的 3%～ 4%。
上述水提多糖经 Sephadex G-200柱层析 ,洗
脱曲线如图 1。凝胶柱层析所得多糖纯品为白色
粉末 ,易溶于水 ,不溶于高浓度的乙醇 ,丙酮等有机
溶剂中;与苯酚硫酸显色后 , 特征吸收峰在
484 nm;用甲苯胺蓝染色显蓝色;经 HPLC检测糖
含量为 91%。
Tab 1　The adso rption and deso rption of the pigment
Resin D3520 AB-8 D392 D380 D296R D290 D201
Adso rption
r ate(%) 62 66 91 89 86 88 74
Deso rption
r ate(%) 38 50 8. 8 4. 9 4. 2 4. 7 4. 7
Fig 1　Sephadex G-200 elution curves of GF polysaccha ride
3. 2　多糖的纯度鉴定
多糖纯品紫外扫描在 280 nm 、 260 nm 附近无
明显特征吸收峰 ,说明不含蛋白质 、核酸组分 ,也不
含酚类色素 。纯品的 HPLC 图谱为单一对称峰 ,
176 药 物 生 物 技 术 第 12 卷第 3 期　
表明该多糖为均一组分。
3. 3　单糖组成分析
多糖纯品酸水解物薄层层析结果如表 2所示 ,
可见灰树花多糖主要由葡萄糖构成 。
Tab 2　TLC analy sis of sugar components
Sample(Rf) Fu cose Xylose Glucose Mannose Rhamnose
Standard
monosac-
charide
0. 59 0. 63 0. 51 0. 53 0. 71
GF PSA — — 0. 50 — —
　　酸水解物乙酰化后进行 GC分析 ,也只有葡萄
糖一个峰 ,与薄层层析结果一致。表明灰树花多糖
为葡聚糖 。
3. 4　红外光谱
多糖纯品 IR 谱 (图 2)的特征吸收峰为
3 417 cm
- 1 ,2 930 cm - 1 , 1 642 cm - 1 , 1 413 cm - 1 ,
1 025 cm - 1 ,928 cm -1 ,850 cm - 1 ,其中 850 cm - 1的
吸收峰说明灰树花多糖为α-葡聚糖[ 11] 。它与碘试
剂反应不显蓝色 , 说明该多糖结构不同于直链
淀粉 。
Fig 2　IR of GF poly saccha ride
3. 5　多糖的抗肿瘤活性
从表 3可以看出灰树花精制的多糖对 S180肿
瘤有明显的抑制作用 ,并随剂量增加抑制作用也增
强 ,存在剂量依赖性 。
Tab 3　The antitumo r activ ity of GF poly saccharide on S180
Group
Dose
mg /(kg d)
No. of mice
Initiation Termination
Administration
Weight o f sa rcoma
(g)
Inhibition ra te
(%)
Contro l 10 10 i. g 1. 41 ±0. 29 0
Cy 20 mg /2 d 10 10 i. p 0. 56 ±o. 14 ** 60. 08
GF PSA 3 10 10 i. v 1. 21 ±0. 54 14. 48
9 10 10 i. v 1. 02 ±0. 72 27. 93
27 10 10 i. v 0. 96 +0. 14 ** 31. 71
*P < 0. 05　**P < 0. 0 1 　Vs negative con t rol group　x±s
4　讨　论
在多糖的分离纯化中 ,除色素的常用方法有:
活性炭吸附脱色 , DEAE-纤维素柱层析脱色 ,及双
氧水氧化脱色等。活性炭吸附量大 ,分离效率高 ,
是分离水溶性成分的常用吸附剂 。但对于含有酚
177刘晓雯等:灰树花菌丝体多糖的分离纯化和理化性质研究
型化合物的色素 ,多呈负性离子 ,不能用活性炭吸
附剂脱色 。而且 ,一般情况下尽量避免用活性炭 ,
以减少活性炭吸附多糖而造成的损失[ 12] 。
在灰树花菌丝体多糖的分离纯化中 ,我们应用
多种方法对其进行脱色研究 。离子交换纤维素和
离子交换树脂 D290能取得不错的脱色效果 ,但色
素洗脱困难 ,其原因可能是层析介质被毒化 ,逆转
困难 ,难以重新获得交换能力[ 13] 。而双氧水氧化
脱色耗时长 ,脱色不完全 ,有可能影响多糖的生物
活性 。
考虑到发酵来源的多糖所含的色素大多为酚
类物质 ,选择了以上 7种树脂进行灰树花多糖的脱
色研究。弱极性和非极性的树脂主要是范德华力
吸附 ,阴离子交换树脂除了离子交换外 ,其功能基
中的氮原子也有可能作为氢键受体与酚类物质中
的- OH 形成氢键[ 14] 。根据实验结果 ,选用 AB-8
吸附型大孔树脂对粗多糖液脱色 ,利于进一步的分
离纯化 ,操作条件温和。同时 , AB-8解吸液回收酒
精 ,可得到色素固体 ,而且无酸 ,盐等无机离子干
扰 ,利于对色素的进一步研究 。
本文所采用的方法得到的灰树花多糖为α-葡
聚糖 ,这与大部分文献报道的不同[ 1 , 3 , 5] ,实验表明
本品仍具有良好的抗肿瘤活性 。
有关灰树花多糖各组分的活性 、结构与功能的
关系正在进一步研究中。
参考文献
[ 1] 　Inoue At , Kodama N , Nanba H . Ef fect ofmaitake (g rifola
f rondosa)D-f raction 0 n the cont rol of T lymph node Th 一
1 /Th-2 proportion[ J] . B io Pharm Bu ll , 2002 , 25(4):536.
[ 2] 　孙震 ,陈石良 ,谷文英 ,等. 灰树花多糖体内抗肿瘤作用的实
验研究[ J] .药物生物技术 , 2001 , 8(5):279.
[ 3] 　Kurushima H , Kodama N , Nanba H . Actives of polysaccha-
rides obtained from grifola f rond osa on in sulin-dependent di-
abetes mellitus induced by st reptozotocin in mice[ J] . Myco-
science , 2000 , 41(5):473.
[ 4] 　Kubo K , Aoki H , Nanba H. An ti-diab et ic act ivity present in
the f ruit body of grifola f rondosa (maitake) Ⅰ [ J] . Bio
P harm Bu l l , 1994 , 17(8):1106.
[ 5] 　Lee B Ch , Bae J T , Pyo H B , et a l . Biological activi tes of th e
polysacch arides produced f rom submerged cul tu re of edible
Basidiomy cete Grifola f rondosa[ J] . Enzyme Microbia l Tech-
nolog y , 2003 , 32:574.
[ 6] 　Mau J L , Lin H C h , Song S F. An tioxidant properties of sev-
eral speciany mu shrooms[ J] . Food Research Internat ional ,
2001 , 35:519.
[ 7] 　金国虔 ,叶波平 ,奚涛.灰树花胞内多糖抗辐射作用初步研究
[ J] .药物生物技术 , 2003 , 10(1):40.
[ 8] 　Kodama N , Yam ada M , Nanba H. Addiot ion of Matike D-
f ract ion redu ces the effective dosage of vancamy cin for th e
t rearment of L isteria-infected mice[ J] . Japanese Journa l o f
Pha rmacolog y , 2001 , 87(4):327.
[ 9] 　于宪楷 , 主编. 天然药物化学[ M] . 北京:人民卫生出版社 ,
1990 , 272.
[ 10] 　王顺春 ,何巍 ,方积年.徐长卿中一种新葡聚糖化学结构的
研究[ J] .生物化学与生物物理学报 , 2000 , 32(4):369.
[ 11] 　张惟杰 ,主编.糖复合物的生化研究技术[ M] .杭州:浙江大
学出版社, 1994 , 271.
[ 12] 　盛家荣.多糖的提取 、分离及结构分析[ J] . 广西师院学报
(自然科学版), 1999 , 16(4):49.
[ 13] 　吴梧桐 ,主编.生物制药工艺学[ M] .北京:中国医药科技出
版社 , 1995 , 118.
[ 14] 　黄贱苟 ,徐满才 ,李海涛 , 等. D301 树脂对酚类物质的吸附
热力学研究[ J] .离子交换与吸附 , 2003 , 19(1):37.
Separation , Purification and Characterization of Polysaccharide from
Gri fola f rondosa
LIU Xiao-wen , CHEN Xiang-dong , WU Wu-tong
(School of L i fe Science and Technology , China Pharmaceut ical University , Nanj ing 210009 , China)
Abstract　GF po ly saccharide w as separated by macroporous resin , and examined by UV , IR ,T LC ,HPLC
and GC. Research show ed that non-polar and low-polar macroporous resin adso rb pigment bet ter. TLC a-
nalysis o f the acid hydroly zed product and GC analysis of the acetylized product show ed tha t the poly sac-
charide is composed of D-g luco se. IR spect rum revealed that the sample contained α-gluco sidic bonds.
According to anti tumo r test , the po ly saccharide show ed remarkable activi ty.
Key words　Gri fola f rondosa ,Poly saccharide ,Purif icat ion , Characterization ,A ntitumor
178 药 物 生 物 技 术 第 12 卷第 3 期