全 文 ：书收稿日期:2011-12-30 修回日期:2012-03-21
基金项目:江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)．
作者简介:费燕(1987— ) ，女，浙江湖州人，硕士研究生，研究方向:中药和天然药物资源开发与应用．
通讯作者:刘吉华(1969— ) ，男，江苏句容人，博士，教授，硕士生导师． Email:jihualiu88@ 163． com
2012 年 5 月
第 3 期
南 京 晓 庄 学 院 学 报
JOURNAL OF NANJING XIAOZHUANG UNIVERSITY
May，2012
No． 3
关白附内生菌的分离鉴定
及其抗菌和细胞毒活性研究
费 燕1，刘吉华1* ，余伯阳2
(1．中国药科大学 中药复方研究室，江苏 南京 211198;2．中国药科大学 现代中药重点实验室，江苏 南京 210009)
摘 要:从关白附(Aconitum Coreanum (Levl．)Rapaics)中分离出内生菌共 29 株，通过 TLC检测
筛选出 2 株可能产生生物碱类成分的内生菌．对筛选出的 2 株内生菌株的发酵培养物分别以纸片
法和 MTT法进行抑菌和细胞毒活性测定．实验结果显示，2 个内生菌株发酵产物对金黄色葡萄球
菌、大肠杆菌具有良好的抑菌作用，对肝癌细胞 SMMC-7721、胃癌细胞 SGC-7901 具有良好的细胞
毒活性．通过 16S rDNA基因序列分析，2 株内生菌分别被鉴定为类芽孢杆菌属和芽孢杆菌属细菌．
关键词:关白附;内生菌;细胞毒;抗菌;16S rDNA
中图分类号:Q939． 11 文献标识码:A 文章编号:1009-7902(2012)03-0001-05
植物内生菌(Endophyte)是指生活史的一定阶
段或全部阶段存在于健康植物的各种组织和器官内
部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的
症状，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物
组织中分离［1］． 1993 年 Stierle 报道从短叶红豆杉
(Taxus brevifolia Nutt．)中分离到能产生紫杉醇的内
生真菌以来［2］，吸引着众多学者从传统药用植物中
分离内生菌，以发掘新的具有药用价值的活性成分
和药物先导化合物［3-5］．
关白附(Aconitum Coreanum (Levl．)Rapaics)
系毛茛科乌头属植物黄花乌头块根［6］，分布于我国
东北、内蒙、河北、河南、山东等地，主要含有关附甲
素、乙素、丙素、乌头碱等活性成分．现代药理研究证
实，关白附具有抗心律失常［7］、抗炎［8］、抑菌［9］等多
种药理活性［10-11］．本研究以吉林产关白附为实验材
料，分离纯化关白附内生菌株，筛选获得两株可能
产生生物碱类代谢产物的内生菌，对这两个菌株
的摇瓶发酵产物进行细胞毒活性以及抗菌活性检
测，并对这 2 个菌株进行 16S rDNA 基因序列分析
鉴定．
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 材料来源
关白附于 2010 年 9 月采自吉林左家，经刘静涵
教授鉴定为 Aconitum Coreanum (Levl．)Rapaics 的
块根．
1． 1． 2 培养基
分离纯化培养采用 PDA培养基，内生菌液体发
酵采用 PDA液体培养基，细菌采用牛肉膏蛋白胨培
养基．
1． 1． 3 测试细胞株
肝癌细胞 SMMC-7721、胃癌细胞 SGC-7901 购
于上海细胞所，用 10 % DMEM培养基于 5 % CO2、
37 ℃、饱和湿度条件下培养．
1． 1． 4 抑菌试验测试菌
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠
杆菌(Escherichia coli)．
1． 2 方法
1． 2． 1 内生菌的分离、纯化及保藏
将黄花乌头块根用清水冲干净，按无菌操作方
—1—
法进行以下工作:先用无菌水冲洗 3 次，75 %乙醇
漂洗 1． 5 min，无菌水冲洗 3 次，再用 5 %的次氯酸
钠溶液中消毒 30 s后，无菌水冲洗 3 次，用无菌滤
纸将黄花乌头块根表面的水分吸干． 经过上述表
面消毒的黄花乌头块根在无菌的盛有石英砂的研
钵中充分研磨，并用无菌水制成溶液均匀涂布于
PDA平板培养基上，置于 28 ℃的恒温培养箱中培
养．为了检查表面消毒是否彻底，取最后一次无菌
水冲洗液涂布平板培养基作为对照，在相同条件
下培养，若对照平板上无任何菌生长，证明表面消
毒彻底，从而保证所分离出的菌株是植物的内
生菌．
当平板培养基上长出明显菌体的时候，丝状真
菌采用顶端切割法转入到新的 PDA平板培养基中，
经反复几次纯化，细菌挑取菌体后平板划线多次纯
化培养，得到纯化菌株并编号．将纯化的菌株转接入
斜面培养基培养后 4 ℃保存．
1． 2． 2 内生菌的摇瓶培养
将保存的内生菌菌株经过斜面活化培养后接入
液体培养基，于 28 ℃，180 r·min －1振荡培养 4 d．
1． 2． 3 TLC薄层检测
将内生菌发酵培养物抽滤滤去菌体，以等体积乙
酸乙酯萃取 3次，减压浓缩得发酵提取物．样品点于
硅胶 GF254薄层板上进行 TLC检测，以氯仿-甲醇-氨
水(10∶ 1∶ 0． 1)为展开剂，改良碘化铋钾显色．
1． 2． 4 细胞毒活性实验样品制备
将 TLC筛选获得的可能产生生物碱类成分的 2
个菌株，摇瓶发酵培养，取发酵培养物 5 mL 以等体
积乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取液减压浓缩至干称
重后，配成 250． 00、125． 00、62． 50、31． 25 μg /mL 的
DMEM溶液为细胞毒活性实验样品． 5-氟尿嘧啶(5-
Fu)为细胞毒活性实验的阳性对照样品．
1． 2． 5 抗菌活性实验样品制备
将 TLC筛选获得的可能产生生物碱类成分的 2
个菌株，摇瓶发酵培养，取发酵培养物 5 mL 以等体
积乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取液减压浓缩至干称
重后配成 100 mg /mL 的水溶液，阿奇霉素、盐酸左
氧氟沙星、头孢羟氨苄为抗菌活性实验的阳性对照
样品．
1． 2． 6 细胞毒活性测定
将传代后处于对数增殖期的肿瘤细胞，经 0. 25
%胰蛋白酶消化后，用含 10 %小牛血清的 DMEM
培养液制成单细胞悬液，细胞以 1 × 105 个 /孔的密
度接种于 96 孔板，每孔加入细胞悬液 100 μL，在 5
%CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养 24 h 后，每孔加
入 100 μL浓度分别为 31. 25、62. 50、125. 00、250. 00
μg /mL的测试样品，5-Fu 作为阳性对照，以 DMEM
培养液为空白对照，加药后细胞培养 48 h，培养液弃
去，然后每孔加入 MTT溶液(MTT∶空白 DMEM = 1∶
9)共 100 μL，继续培养 4 h 后，弃去液体，加入 150
μL DMSO，震荡 10 min． 在 570 nm 测定波长(参比
波长 650 nm)酶标仪测定吸光度值(OD 值) ，计算
相对抑制率，每组设 5 个复孔，实验重复 3 次．
抑制率(%)=(1 －实验组 OD 值 /空白组 OD
值)× 100 %
1． 2． 7 抗菌活性测定
抑菌活性测定采用纸片扩散法［12］:先将金黄色
葡萄球菌和大肠杆菌涂布牛肉膏蛋白胨平板培养
基，37 ℃恒温培养 24 h．取 20 μL 2 株内生菌发酵产
物萃取物的水溶液和阳性对照溶于滤纸片(Φ = 0． 8
cm)上，使其充分吸收，略微风干后，平放于含有测
试菌的培养皿中，2 株内生菌对 2 种测试菌的抑菌
活性实验分别重复 3 次，无菌水作为空白对照．将制
好后的培养皿 37 ℃恒温培养 24 h 后观察，测其抑
菌圈的大小．
1． 2． 8 16S rDNA基因序列分析方法
菌体 DNA的提取与 16S rDNA片段的扩增与测
序按照文献［13］，对于每一序列，用 DNAs-sist2． 0 软
件对正向(5-3)和反向(3-5)序列进行核对并生
成 5-3的完整序列． 通过 BLAST 软件从 GenBank
中寻找具有同源序列的菌株．用 Clustal X1． 83 软件
进行分析，采用邻近-连接法(Neighbor-Joining meth-
od)聚类，生成系统聚类树，并用 Bootstrap 软件对系
统树进行检验来确定菌株的分类地位．
2 结果与分析
2． 1 内生菌的分离结果
从关白附内总共分离得到 29 株菌株，通过初步
的形态观察可以看出，分离得到的丝状真菌有 6 株，
细菌 23 株．最后一次无菌水冲洗液涂布平板无菌体
生长，说明所分离出的菌株是植物的内生菌而不是
块根表面附生的微生物．分离得到的丝状真菌较少，
这可能是黄花乌头块根所含生物碱成分对丝状真菌
具有较强的抑制作用有关．
2． 2 TLC薄层检测结果
对所分离的 29 个内生菌株发酵产物进行 TLC
检测筛选，发现菌株 g14 和 g16 的发酵产物层析后
经生物碱显示指示剂改良碘化铋钾显色，在薄层板
上显示明显的橙红色斑点，表明 g14 和 g16 可能产
生生物碱类代谢产物，见图 1．
—2—
图 1 内生菌株 g14 和 g16 发酵产物的 TLC检测
2． 3 内生菌发酵产物的细胞毒活性
由表 1 可以看出，通过与阳性对照的比较，2 个
内生菌株 g14 和 g16 的发酵产物对 SMMC-7721 和
SGC-7901 肿瘤细胞的增殖均有良好的抑制作用，其
中菌株 g14 发酵产物对肿瘤细胞增殖的抑制作用强
于菌株 g16．
表 1 2 株内生菌对 SMMC-7721 和 SGC-7901
肿瘤细胞增殖的抑制作用
测试样品
IC50值 /μg·mL
－1
SMMC-7721 SGC-7901
5-Fu 119． 02 95． 95
g14 52． 00 57． 19
g16 53． 71 60． 55
2． 4 内生菌发酵产物的抑菌活性
内生菌 g14 和 g16 对两种测试菌抑菌活性结果
见表 2．实验结果显示，内生菌株 g14 和 g16 的发酵
产物与阳性对照有相当的抑菌活性，且都对大肠杆
菌的抑制作用强于金黄色葡萄球菌．
表 2 2 株内生菌发酵产物对金黄色葡萄球菌
和大肠杆菌的抑制作用
测试样品
测试菌
金黄色葡萄球菌 大肠杆菌
阿奇霉素 ++ ++
盐酸左氧氟沙星 +++ +++
头孢羟氨苄 +++ +++
g14 ++ +++
g16 ++ +++
空白 － －
注:“－”0 ＜Φ(平均抑菌圈直径)＜ 7 mm;“+”7 ＜ Φ ＜
11mm;“++”11mm ＜Φ ＜ 17mm;“+++”17 mm ＜Φ ＜ 27mm
Note:“ －”0 ＜ Φ(average diameter of the antibiotic cir-
cles)＜ 7mm;“ +”7 ＜ Φ ＜ 11mm;“ + +”11mm ＜ Φ ＜ 17
mm;“+++”17mm ＜Φ ＜ 27mm
2． 5 16S rDNA基因序列的分析
内生菌株 g14 和 g16 的 16S rDNA 序列分析结
果如图 2，菌株 g14 的 16S rDNA序列与 GenBank 中
类芽孢杆菌属的相似度超过 95 %，因此将 g14 归属
于类芽孢杆菌属，菌株 g16 的 16S rDNA序列与芽孢
杆菌属的相似度接近 100 %，因此将 g16 归属于芽
孢杆菌属．
图 2 关白附内生菌株 g14 和 g16 的 16S rDNA 聚类分析
—3—
3 讨论
现有研究表明，药用植物内生菌中的某些菌株
常能产生与宿主植物相同或相近的活性成分，是新
药物先导化合物和药用活性成分的重要来源之
一［14-16］，本研究分离纯化获得 29 个关白附内生菌
株，通过液体发酵培养和 TLC 筛选，获得 2 个可能
产生生物碱类成分的内生菌 g14 和 g16． 并对筛选
出的菌株发酵产物进行了抑菌及抗肿瘤活性筛选．
实验结果显示筛选出的菌株发酵产物对肿瘤细胞
SMMC-7721 和 SGC-7901 增殖具有良好的抑制作
用，对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄
色葡萄球菌均有较好的抑菌活性．
鉴于内生菌株长期与宿主植物共生而难以进行
形态学方法鉴定的特点，采用 16S rDNA 基因序列
同源性分析的方法，对筛选出的 2 个菌株进行鉴定，
以 Boots-trap软件构建了系统发育树，现在一般认为
16S rDNA序列同源性小于 98 %，可以认为归属为
不同的种，同源性小于 93 %—95 %，可以认为归为
不同属［17］．系统发育树结果显示内生菌株 g14 与菌
株 EU982495． 1(Paenibacillus polymyxa strain 1167-
2)、菌株 JF343190． 1(Paenibacillus sp． IARI-L-37)
和菌株 EU741059． 1 (Paenibacillus polymyxa strain
13630B)等菌株的相似度超过 95 %，将其归属于芽
孢杆菌属细菌;内生菌株 g16 与菌株 JF899265． 1
(Bacillus amyloliquefaciens subsp． plantarum strain
Hs3-12)、菌株 JF899259． 1(Bacillus methylotrophicus
strain Hk8-14)和菌株 JF899261． 1(Bacillus methyl-
otrophicus strain Hk9-21)的相似度超过 99 %，将其
归属于芽孢杆菌属细菌．现有研究也显示，植物内生
芽孢杆菌和类芽孢杆菌代谢产物具有良好的抑菌活
性、抗肿瘤等多种生物活性［18-21］，上述研究也表明
内生的类芽孢杆菌、芽孢杆菌是药用植物内生菌中
具有较高研究价值的类群．
植物内生菌发酵产物体外抑菌机制主要包括
分泌抗真菌或者细菌的活性物质、分泌生长素等
提高自身抗逆性与营养竞争等，抑制肿瘤细胞增
殖作用机制主要有诱导细胞周期阻滞在 S 期、诱
导肿瘤细胞凋亡和抑制基因转录等． 不同的内生
菌的抑菌和体外抗肿瘤活性的机制可能不同，本
实验将筛选得到的 2 株可能产生生物碱类代谢产
物的内生菌作为活性试验对象，可能是这 2 株内
生菌分泌的生物碱类物质抑制细菌及肿瘤细胞的
增殖，其抑菌和细胞毒活性的物质基础正在进行
进一步的研究．
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(责任编辑:陈昌云)
Isolation and Identification of Antibacterial and Cytotoxic Endophytic Fungi
from Aconitum Coreanum (Levl．)Rapaics
FEI Yan1，LIU Ji-hua1* ，YU Bo-yang2
(1． Dept． of Complex Prescription of TCM，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，Jiangsu;
2． The Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，Jiangsu)
Abstract:Among 29 strains of endophytic fungi isolated from Aconitum Coreanum (Levl．)Rapaics，2 strains dis-
played Alkaloid-producing by TLC． The antimicrobial and cytotoxic activities of their extract were tested by the disk
diffusion method and MTT assay respectively． The results indicate that both of them have a good antibacterial activi-
ty to Staphylococcus aureus，Escherichia coli and can inhibit the growth of SMMC-7721 and SGC-7901 cells signifi-
cantly． By phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences，these 2 strains of endophytic fungi were identified as
Paenibacillus and Bacillus．
Key words:Aconitum Coreanum (Levl．)Rapaics;endophytic fungi;cytotoxic activity;antibacterial activity;16S
rDNA
—5—