全 文 ：2011 年 12 月 Vol． 29 No ． 12
December 2011 Chinese Journal of Chromatography 1244 ～ 1248
技术与应用 DOI:10． 3724 /SP． J． 1123． 2011． 01244
* 通讯联系人:王 晓，博士，研究员，研究方向为天然产物的分离． Tel: (0531)82605319，E-mail:w angx@ keylab． net．
基金项目:山东省科技攻关项目(2010GSF10287)和济南市高等院所自主创新计划项目(201004010)．
收稿日期:2011-09-03
硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化荷花中黄酮类化合物
徐双双1， 孙 瑜2， 井 凤1， 段文娟3， 杜金华1， 王 晓3*
(1． 山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018;2． 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;
3． 山东省科学院分析测试中心，山东 济南 250014)
摘要:采用硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化了荷花中 3 种黄酮类化合物。荷花粗提物先经过硅胶柱色谱
初步分离，得到黄酮含量高的组分，再经过高速逆流色谱分离，以乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(4∶ 1∶ 5∶ 0. 025，v /v /v /v)
为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，在主机转速 800 r /min、流速 2. 0 mL /min、检测波长 254 nm 条件
下，从 150 mg 样品中一次性分离制备得到 6. 1 mg 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(I) ，14. 8 mg 杨梅素-3-O-β-D-葡
萄糖苷(II)和 20. 2 mg 紫云英苷(III) ，经高效液相色谱检测其纯度分别为 97. 0%、95. 4%、96. 3%，并通过质谱和核
磁共振氢谱、碳谱鉴定各化合物的结构。该方法简便、快速、节省溶剂，可以对荷花中的黄酮类化合物进行快速有
效的分离纯化，具有较好的实用价值，为荷花资源的进一步开发应用提供了参考依据。
关键词:硅胶柱色谱;高速逆流色谱;槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷;紫云英苷;荷花
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2011)12-1244-05
Separation and purification of flavones from Nelumbo nucifera
Gaertn． by silica gel chromatography and high-speed
counter-current chromatography
XU Shuangshuang1，SUN Yu2，JING Feng1，DUAN Wenjuan3，DU Jinhua1，WANG Xiao 3*
(1． College of Food Science and Engineer ing，Shandong Agr icu ltu ral Univer s i ty，Taian 271018，China;
2． College of Pharm acy，Shandong Univer s i ty of Tradi tional Chines e Medicine，Jinan 250355，China;
3． Analys i s and Tes t Cen ter，Shandong Academ y of Sciences，Jinan 250014，China)
Abstract:Three flavones w ere iso lated and purified from Nelum bo nuci fera Gaertn． by the
combination of silica gel chromatography and high-speed counter-current chromatography
(HSCCC)． The crude extract o f N． nuci fera w as separated by silica gel chromatography and
the fraction containing flavones w as obtained． Then，the fraction w as separated by HSCCC w ith
tw o phase solvent systems composed of ethyl acetate-ethanol-w ater-acetic acid (4∶ 1∶ 5∶ 0. 025，
v /v /v /v)． The upper phase w as as the stationary phase and the low er phase as the mobile
phase． Under the conditions of a flow rate of 2. 0 mL /min，while the apparatus ro tated at 800
r /min and the detection w avelength w as at 254 nm，6. 1 mg of quercetin-3-O-β-D-glucuronide，
14. 8 mg of myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside and 20. 2 mg of astragalin w ere obtained from
150 mg of the crude sample in one step． The purities determined by high performance liquid
chromatography (HPLC)w ere 97. 0%，95. 4% and 96. 3%，respectively． The structures of the
target compounds w ere identified by electrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS) ，1H-
nuclear magnetic resonance(1H-NMR)and 13C-nuclear magnetic resonance(13C-NMR)． This
method that has practical value not only saves solvent but also is convenient． It is effective in
the separation of flavones from N． nuci fera，and provides theoretical foundation for the further
development and use of N． nuci fera resources．
Key words:silica gel chromatography;high-speed counter-current chromatography (HSCCC) ;
第 12 期 徐双双，等:硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化荷花中黄酮类化合物
quercetin-3-O-β-D-glucuronide;myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside;astragalin;Nelum bo nuci f-
era Gaertn．
荷花(Nelum bo nuci fera Gaertn．)又名莲花、
中国莲、六月花神等，为睡莲科(Nymphaeaceae)莲
属多年生水生草本植物莲的花，资源丰富，系药食两
用之水生植物，性温味苦，能治疗跌打损伤、出血等
症，可内服、外用［1］。目前对荷花的研究报道主要
集中在荷花的品种分类及栽培技术方面。随着荷花
在生活中的应用日趋广泛，对其活性成分的研究也
逐渐增多。林宣贤［2］的研究表明荷花中含有丰富
的氨基酸和矿物质成分。Yang 等［3］应用高效液相
色谱-二极管阵列检测器 /质谱(HPLC-DAD /MS)对
荷花的化学成分进行了分析，推断出了 15 种花色苷
和黄酮类化合物。郭兴峰等［4，5］的研究表明荷花花
瓣具有显著的抗氧化性，并分离鉴定了 4 种化合物。
分离纯化荷花中的功能成分是进一步进行活性研究
及其产品开发的必要步骤，因此建立相关成分的快
速有效的分离纯化方法具有重要的意义。
高速逆流色谱法(high-speed counter-current
chromatography，HSCCC)是一种不需要固态载体
的液-液分配色谱技术，具有操作简便、可避免因不
可逆吸附而引起的样品损失等优点，已被广泛应用
于天然产物的分离纯化中［6，7］。但是荷花中活性成
分多而且含量较低，直接采用 HSCCC 分离纯化所
得化合物的产量低，而传统的色谱法存在着耗时长、
溶剂消耗量大、分离效率低等缺点。本实验首先采
用硅胶柱色谱法对荷花中的黄酮类化合物进行富
集，然后采用 HSCCC 对已富集的黄酮类化合物进
行分离纯化，结合两种色谱方法的优点，实现了对荷
花中黄酮类化合物快速、有效的分离纯化，得到了 3
个高纯度的黄酮类化合物槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛
酸苷(I)、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷(II)和紫云英苷
(III) (结构见图 1) ，为荷花资源的进一步开发应用
提供了一定的参考依据。
图 1 3 种黄酮类化合物的结构式
Fig． 1 Chemical structures of the 3 flavone compounds
1 实验部分
1． 1 仪器与材料
GS10A型高速逆流色谱仪(北京艾美林科技有
限公司)、多层聚四氟乙烯螺旋管(直径 2. 3 mm，分
离体积 230 mL，β值为 0. 5 ～ 0. 8)、TBP 泵(上海同
田生物技术有限公司)、8823B-紫外检测器(北京宾
达英创科技有限公司)、3057-11 记录仪(重庆川仪
总厂有限公司) ;Waters 600-996 高效液相色谱系
统(配有光电二极管阵列检测器(PDA) ，美国 Wa-
ters 公司) ;Varian INOVA-600 核磁共振波谱仪(美
国 Varian 公司) ;Agilent 1100 Series 6320 ion-trap
质谱仪(美国 Agilent 公司)。
硅胶柱色谱和逆流色谱用甲醇、氯仿、石油醚和
乙酸乙酯均为分析纯(天津市广成化学试剂有限公
司) ，所用水为过滤蒸馏水;液相色谱用甲醇为色谱
纯(美国天地公司) ，所用水为乐百氏纯净水;硅胶
(200 ～ 300 目) (青岛海洋化工厂)。新鲜荷花采集
于济南市遥墙镇，经山东中医药大学李佳教授鉴定
为睡莲科莲属植物莲的花。
1． 2 荷花粗提物制备
新鲜荷花于室温下阴干。取干燥的荷花瓣 5 kg，
粉碎并过 40目筛，加入 95%乙醇 8 L，加热回流提取
2 h，过滤;重复提取 3 次，合并滤液，减压浓缩。将浓
缩液用水稀释至 600 mL，依次用等体积的石油醚、乙
酸乙酯分别萃取 3次，乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙
酸乙酯相粗提物 90. 5 g，4 ℃冰箱中保存备用。
1． 3 硅胶柱色谱初步分离
取乙酸乙酯粗提物 40 g 经硅胶柱色谱初步分
离，以氯仿-甲醇(100∶ 1，60∶ 1，40∶ 1，20∶ 1，10∶ 1，5∶
·5421·
色 谱 第 29 卷
1，3∶ 1，1∶ 1)进行梯度洗脱，经 HPLC 检测合并相同
馏分，得 F1 ～ F8 共 8 个组分，经薄层色谱(TLC)显
色反应和 HPLC 检测，黄酮类化合物主要集中在组
分 F7 中，将其冷冻干燥，备用。
1． 4 HSCCC分离
1． 4． 1 两相溶剂体系及样品溶液的制备
本实验选择溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸
(4∶ 1 ∶ 5 ∶ 0. 025，v /v /v /v) ，配制约 1 000 mL，置于
分液漏斗中，剧烈振荡使其充分混合后静置分层，平
衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动
相，分别超声脱气 30 min，备用。
称取 1. 3 节中得到的组分 F7 150 mg，加入上下
相各 5 mL，振荡使其完全溶解，备用。
1． 4． 2 分配系数(K D)的测定
根据文献报道的 K D 值测定方法
［8］，取 2 mg F7
样品置于 10 mL 试管中，加入上下相各 2 mL，剧烈
振荡 1 min，使样品充分溶解，静置分层，取上下相
各 5 μL，用 HPLC 分别进行检测，上相峰面积为 A 1，
下相峰面积为 A 2，K D = A 1 /A 2。
1． 4． 3 HSCCC 分离制备过程
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定
相)以 20 mL /min 的流速泵入 HSCCC 分离管中，待
上相充满整个分离管后，调节主机转速达 800
r /min，顺时针旋转，待转速稳定后，以 2 mL /min 流
速泵入下相(流动相) ，检测波长为 254 nm。当流
动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学
平衡，此时将已准备好的 10 mL 组分 F7 样品注入
HSCCC 仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目
标成分。
1． 5 HPLC条件
色谱柱:Inertsil ODS-SP 柱(250 mm × 4. 6
mm，5 μm)。柱温:25 ℃。流动相 A:甲醇;流动相
B:0. 1%(v /v)乙酸水溶液;线性梯度洗脱程序:0
～ 25 min，30%A ～90%A;流速:1. 0 mL /min;进样
量:10 μL;检测波长:254 nm。
1． 6 化合物的结构鉴定
HSCCC 分离得到的各化合物结构经过电喷雾
离子质谱(ESI-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和核
磁共振碳谱(13 C-NMR)鉴定。质谱分析条件:正离
子模式，样品通过流动注射泵进样，体积流量 0. 2
mL /min，干燥气温度 350 ℃;干燥器流量 9. 0
L /min;雾化气压强 24. 1 Pa;毛细管电压 4 kV;质量
扫描范围 m /z 50 ～ 1 200，实验前质量数经过校正。
核磁共振过程中溶剂为二甲基亚砜(DMSO) ，四甲
基硅烷(TMS)作为内标物质。
2 结果与讨论
2． 1 硅胶柱色谱条件的优化
分别考察了石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇洗脱
系统，经过 TLC 分析，结果(如图 2 所示)显示选用
石油醚-乙酸乙酯系统时的成点性和分离效果均不
如氯仿-甲醇系统，并且极性偏大的物质存在拖尾现
象，因此最终选择氯仿-甲醇系统进行硅胶柱色谱
洗脱。
图 2 荷花粗提物的硅胶薄层色谱图
Fig． 2 TLC chromatograms of the crude
extract of N． nucifera
Developing so lvents: a． chloro form-methanol; b．
petro leum ether-ethyl acetate．
2． 2 HSCCC分离条件的优化
溶剂系统的选择是影响 HSCCC 分离的关键因
素，采用分配系数 K D 值来衡量溶剂系统的选择是
否适合目标化合物的分离。一般而言，对 HSCCC
最合适的 K D 值范围是 0. 5 ～ 2. 0
［9］。按照 1. 4 节中
所述的方法首先选用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水、乙
酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-乙醇-水 3 个溶剂体系，
分别测定目标化合物的 K D 值。通过比较发现，目
标化合物在乙酸乙酯-乙醇-水(4∶ 1∶ 5，v /v /v)溶剂
体系中的 K D 值更接近逆流色谱合适的 K D 值范围。
根据目标化合物的性质及其在上面 3 个溶剂体系中
的 K D 值，将溶剂体系优化为乙酸乙酯-乙醇-水-乙
酸(4∶ 1∶ 5∶ 0. 01，v /v /v /v) ，测定结果显示 K D 值均
有所减小，但仍然高于合适的 K D 值范围，所以将溶
剂体系进一步优化为乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(4∶ 1 ∶
5∶ 0. 025，v /v /v /v) ，结果显示目标化合物的 K D 值
基本在适合的范围内(见表 1)。
本实验还对流动相的流速进行了优化。流速太
快分离效果不好，尤其是化合物 I 和化合物 II 不能
很好地分离;流速太慢会导致分离时间过长。最终
选择流速为 2. 0 mL /min，使化合物得到很好的分
离，同时缩短了分离时间。
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第 12 期 徐双双，等:硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化荷花中黄酮类化合物
表 1 3 种黄酮类化合物在不同溶剂体系中的分配系数
Table 1 Partition coefficients (KD)of the 3 flavone compounds in several solvent systems
Solvent system I II III
Petro leum ether-ethyl acetate-methanol-w ater (1∶ 1∶ 1∶ 1，v /v /v /v) 8． 3 8． 7 11． 2
Ethyl acetate-methanol-w ater (4∶ 1∶ 5，v /v /v) 5． 6 7． 1 7． 4
Ethyl acetate-ethanol-w ater (4∶ 1∶ 5，v /v /v) 3． 9 5． 1 6． 7
Ethyl acetate-ethanol-w ater-acetic acid (4∶ 1∶ 5∶ 0． 01，v /v /v) 1． 1 3． 0 5． 4
Ethyl acetate-ethanol-w ater-acetic acid (4∶ 1∶ 5∶ 0． 025，v /v /v /v) 0． 8 1． 9 2． 9
For compounds I － III，see Fig． 1．
图 4 (a)组分 F7 及(b)槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(I)、
(c)杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷(II)和(d)紫云英苷
(III)的 HPLC谱图
Fig． 4 HPLC chromatograms of (a)the component F7，
(b) quercetin-3-O-β-D-glucuronide (I)，(c)
myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside (II)and (d)
astragalin (III)
2． 3 HSCCC分离纯化结果
选用溶剂系统乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(4∶ 1∶ 5∶
0. 025，v /v) ，按照 1. 4 节所述实验方法对 1. 3 节制
备的样品进行 HSCCC 分离，根据 HSCCC 谱图手动
分段收集，分离结果如图 3 所示。通过 HPLC 检测，
阴影部分为纯度较高的馏分，分别将其合并为组分
I ～ III，减压浓缩干燥后称其质量分别为 6. 1、14. 8、
20. 2 mg，测定其纯度分别为 97. 0%、95. 4%、96. 3%。
图 3 荷花中黄酮类化合物的高速逆流色谱图
Fig． 3 HSCCC chromatogram of flavone compounds
from Nelumbo nucifera Gaertn．
I． quercetin-3-O-β-D-glucuronide;II． myricetin-3-O-β-D-glu-
copyranoside;III． astragalin．
2． 4 HPLC条件的优化
分别考察了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0. 1%乙酸
水溶液作为流动相时各组分的分离情况。结果表
明，当流动相 A为甲醇，流动相 B 为 0. 1%乙酸水溶
液，线性梯度洗脱，0 ～ 25 min 内 A液从 30%上升至
90%，流速为 1. 0 mL /min 时，目标成分可以得到良
好的分离，组分 F7 及化合物槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖
醛酸苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷的
HPLC 谱图见图 4。
2． 5 化合物的结构鉴定
化合物 I:黄色粉末(甲醇) ;ESI-MS(m /z) :
479［M + H］+;1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:
7. 60 (1H，s，H-2) ，7. 59(1H，d，J = 7. 2 Hz，H-
6) ，6. 84(1H，d，J = 7. 2 Hz，H-5) ，6. 42(1H，
s，H-8) ，6. 22(1H，s，H-6) ，5. 49(1H，d，J = 5. 4
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色 谱 第 29 卷
Hz，H-1″) ;13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:
156. 3(C-2) ，133. 2(C-3) ，177. 2(C-4) ，161. 2(C-
5) ，98. 8(C-6) ，164. 3(C-7) ，93. 6(C-8) ，156. 4
(C-9) ，103. 9(C-10) ，120. 8(C-1) ，115. 3(C-
2) ，144. 9(C-3) ，148. 6(C-4) ，116. 2(C-5) ，
121. 6(C-6) ，101. 2(C-1″) ，75. 8(C-2″) ，75. 9(C-
3″) ，71. 4(C-4″) ，73. 8(C-5″) ，170. 0(C-6″)。以
上波谱数据与文献［10］基本一致，因此鉴定其为槲皮
素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，结构见图 1。
化合物 II:黄色粉末(甲醇) ;ESI-MS(m /z) :
481［M + H］+;1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:
6. 19 (1H，d，J = 1. 2 Hz，H-6) ，6. 37(1H，d，J =
1. 2 Hz，H-8) ，7. 19(2H，s，H-2，H-6) ，5. 46
(1H，d，J = 7. 8 Hz，H-1″) ;13 C-NMR (DMSO-d6，
150 MHz)δ:156. 7(C-2) ，133. 8(C-3) ，177. 8(C-
4) ，161. 7(C-5) ，99. 0(C-6) ，164. 5(C-7) ，93. 7
(C-8) ，156. 6(C-9) ，104. 3(C-10) ，120. 4(C-1) ，
108. 9(C-2) ，145. 8(C-3) ，137. 0(C-4) ，145. 8
(C-5) ，108. 9(C-6) ，101. 2(C-1″) ，71. 3(C-2″) ，
76. 9(C-3″) ，70. 3(C-4″) ，78. 0(C-5″) ，60. 9(C-
6″)。以上波谱数据与文献［11］对照基本一致，因此
鉴定其为杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷，结构见图 1。
化合物 III:黄色粉末(甲醇) ;ESI-MS(m /z) :
449［M + H］+;1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:
6. 44 (1H，d，J = 1. 2 Hz，H-8) ，6. 22(1H，d，J =
1. 2 Hz，H-6) ，8. 04(2H，d，J = 9. 0 Hz，H-2，H-
6) ，6. 89(2H，d，J = 9. 0 Hz，H-3，H-5) ，12. 62
(1H，s，5-OH) ，10. 88(brs，7-OH) ，10. 20(brs，
4-OH) ，5. 48(1H，d，J = 7. 8 Hz，H-1″) ，3. 08 ～
3. 58(6H，m，H-2″ ～ 6″) ;13C-NMR (DMSO-d6，
150 MHz)δ:156. 7(C-2) ，133. 6(C-3) ，177. 9(C-
4) ，161. 6(C-5) ，99. 1(C-6) ，164. 5(C-7) ，94. 0
(C-8) ，156. 7(C-9) ，104. 4(C-10) ，121. 3(C-1) ，
131. 3(C-2，C-6) ，115. 5(C-3，C-5) ，160. 3(C-
4) ，101. 2(C-1″) ，74. 6(C-2″) ，77. 9(C-3″) ，70. 3
(C-4″) ，76. 8(C-5″) ，61. 2(C-6″)。以上波谱数据
与文献［5］对照基本一致，因此鉴定其为紫云英苷，
结构见图 1。
3 结论
荷花中的黄酮类化合物在结构和性质方面非常
相似，采用传统的硅胶柱色谱分离纯化十分困难。
本实验首先应用硅胶柱色谱法对荷花中的黄酮类化
合物进行富集，然后采用 HSCCC 对已富集的黄酮
类化合物进行分离纯化，得到 3 个高纯度的黄酮类
化合物槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、杨梅素-3-O-
β-D-葡萄糖苷和紫云英苷。该方法简便、快速、节省
溶剂，具有较好的实用价值，为进一步开发利用荷花
资源提供了一定的参考依据。
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