全 文 ：多棘海盘车酶解多肽体外抗氧化活性研究
李敏晶，王旭莹，张 宇，刘 远 (大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连 116023)
摘要 ［目的］探讨多棘海盘车多肽的抗氧化活性。［方法］对多棘海盘车中水溶性蛋白进行提取，再采用酶解法，以胰蛋白酶和木瓜蛋
白酶分别酶解水溶性蛋白，经离心、透析、冻干后分别得到多肽样品 T-P、P-P。通过分析 T-P、P-P对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自
由基(O －2 ·)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)的清除能力及在脂质体系中的抗氧化能力来表征其体外抗氧化活性。［结果］
T-P、P-P对 3种自由基均具有一定的清除作用，对脂质体系的氧化也有一定的抑制作用;P-P的抗氧化活性优于 T-P;T-P、P-P的抗氧化
活性均弱于水溶性蛋白。［结论］研究可为多棘海盘车多肽的深入研究及开发利用提供理论依据。
关键词 多棘海盘车;多肽;抗氧化活性
中图分类号 S912 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)05 －113 －03
Antioxidant Activity in vitro of the Enzymolysis Peptide from Asterias amurensis
LI Min-jing，WANG Xu-ying，ZHANG Yu et al (College of Marine Science and Technology and Environment，Dalian Ocean Universi-
ty，Dalian，Liaoning 116023)
Abstract ［Objective］To discuss the antioxidant activity in vitro of the enzymolysis peptide from Asterias amurensis． ［Method］Water-soluble
protein was extracted from A． amurensis，and then was enzymolyzed by trypsin and papain using enzyme hydrolysis method． After centrifuga-
tion，dialysis and freeze drying，peptide samples T-P and P-P were obtained． Antioxidant activity in vitro was characterized based on analyzing
the scavenging activities of T-P and P-P to hydroxyl radical (·OH)，superoxide anion free radical (O －2 ·)，and 1，1 diphenyl -2 -trinitro-
benzene hydrazine free radicals (DPPH·)． ［Ｒesult］T-P and P-P had certain scavenging action to the three free radicals，and had certain
inhibitory effects on the oxidation of lipid system． ［Conclusion］Antioxidant activity of P-P is superior to that of T-P;antioxidant activities of
T-P and P-P were poorer to that of water-soluble protein．
Key words Asterias amurensis;Polypeptide;Antioxidant activity
基金项目 辽宁省教育厅科学技术研究项目(L2014278)。
作者简介 李敏晶(1976 － ) ，女，辽宁阜新人，副教授，博士，从事天然
产物化学相关的研究。
收稿日期 2016-01-20
多棘海盘车是我国黄海沿岸一种十分常见的海星，它属
于海洋无脊椎动物，棘皮动物门、海星纲、钳棘目、海盘车科。
多棘海盘车体呈五星型，口面平坦为浅黄色，反口面较隆起，
表面附有较多棘刺，为紫红色，是我国北方海域海星的主要
品种［1］。近几十年来，国外的科研人员在各种不同种类的海
星中获取了多种活性成分，如:皂苷、甾醇、多糖、蛋白质及氨
基酸等，因其具有多种生理及药理活性使得国内也有越来越
多的科研人员关注到这一领域［2 －4］。已有研究证明，很多从
天然产物中获得的多肽具有抗氧化活性［5 －7］，但是多棘海盘
车酶解多肽抗氧化活性的研究少见报道。笔者探讨了多棘
海盘车酶解多肽的抗氧化活性，以期为多棘海盘车多肽的进
一步研究及应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 原料及主要试剂。多棘海盘车，采自辽宁省大连市黄
海海域;木瓜蛋白酶(BＲ，200 000 U /g) ;胰蛋白酶(BＲ，
800 ～2 500 U /mg) ;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、VC、
邻苯三酚、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、双氧
水、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚油酸、硫氰酸铵、
无水乙醇、超纯水等试剂均为分析纯。
1． 1． 2 主要仪器。紫外 － 可见分光光度计(OPTIZEN
2620UV型) ;恒温水浴锅(SY2-4 型) ;离心机(LDZ4 型) ;真
空冷冻干燥机(SIM FD-5 型) ;恒温培养箱(SPX-250-GB
型) ;电热鼓风干燥箱(101G-1B 型) ;磁力搅拌器(FW100
型) ;pH计(PB-10型) ;旋转蒸发仪(ＲE-52CS型) ;电子天平
(AL204 型) ;万能粉碎机(FW100 型) ;纯水制备系统
(Milli-Q型)。
1． 2 方法
1． 2． 1 酶解多肽的制备。将多棘海盘车样品于烘箱中 60
℃恒温烘干，在粉碎后过 40目筛，备用。
1． 2． 1． 1 水溶性蛋白的制备。采用 1∶ 10 g /mL的固液比用
蒸馏水作为溶剂提取多棘海盘车样品，提取液经浓缩、透析、
离心、冷冻干燥，得到水溶性蛋白样品，0 ～4 ℃冷藏备用。
1． 2． 1． 2 T-P的制备。采用 1∶ 15 g /mL的固液比用蒸馏水
作为溶剂溶解水溶性蛋白样品，加入 9%的胰蛋白酶，调节溶
液 pH 6． 0，50 ℃酶解 6 h后 100 ℃灭活，冷却、离心、冷冻干
燥，得到多肽样品 T-P，0 ～4 ℃冷藏备用。
1． 2． 1． 3 P-P的制备。采用 1∶ 15 g /mL的固液比用蒸馏水
作为溶剂溶解水溶性蛋白样品，加入 9%的木瓜蛋白酶，调节
溶液 pH 5． 5，70 ℃酶解 4 h后 100 ℃灭活，冷却、离心、冷冻
干燥，得到多肽样品 P-P，0 ～4 ℃冷藏备用。
1． 2． 2 对自由基的清除作用的测定。对 1，1-苯基-2-三硝基
苯肼自由基(DPPH·)、超氧阴离子自由基(O －2 ·)、羟基自
由基(·OH)清除能力的测定参照文献［8］的方法进行。
1． 2． 3 脂质抗氧化活性的测定。对多肽的脂质抗氧化活性
测定采用 FTC［ 9 －10］法。
2 结果与分析
2． 1 对 DPPH·的清除作用 由图 1 可知，T-P、P-P对 DP-
PH·都有较好的清除作用，随着这 2 种多肽质量浓度的增
加，其清除作用也逐渐增强。在浓度较低时，2种多肽的抗氧
化活性较为接近，当浓度大于 1． 0 mg /mL 后，P-P对 DPPH·
的清除率在相同浓度下显著高于 T-P。通过清除率曲线可以
看出，T-P的浓度和清除率之间的关系呈明显的线性关系。2
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(5):113 － 115 责任编辑 李菲菲 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.05.042
种多肽对比可知，由木瓜蛋白酶酶解所得的多肽抗氧化活性
可能优于胰蛋白酶酶解所得多肽。
图 1 T-P、P-P 对 DPPH·的清除率
Fig． 1 Clearance rate of T-P and P-P to DPPH·
2． 2 对 O－2 ·的清除作用 T-P、P-P对 O
－
2 ·的清除作用如
图 2所示，2种多肽对 O －2 ·的清除活性并不显著，整体趋势
仍有随多肽质量浓度的增大而增大的情况，但是在相同浓度
下 P-P对 O －2 ·的清除率略高于 T-P。该结果进一步证明了
不同酶水解所得的多棘海盘车多肽其抗氧化活性也存在差
异，P-P的抗氧化活性优于 T-P。
图 2 T-P、P-P对 O －2 ·的清除率
Fig． 2 Clearance rate of T-P and P-P to O －2 ·
2． 3 对·OH 的清除作用 由图 3 可知，在试验浓度条件
下，T-P、P-P对·OH 的清除作用效果并不显著。清除率随
样品浓度的增大而增大，在相同浓度下 P-P对·OH的清除
率略高于 T-P，该结果与 TP、P-P对 DPPH·和 O －2 ·的清除
作用结论相同。
图 3 T-P、P-P对·OH的清除率
Fig． 3 Clearance rate of T-P and P-P to ·OH
2． 4 脂质抗氧化作用 如图 4所示，T-P、P-P对亚油酸乳化
体系的抗氧化效果比较显著，且随着样品浓度的增加，抑制
能力也在增加;当浓度达到 0． 8 mg /mL时，P-P的脂质体系
抗氧化能力有显著的提升，当浓度大于 0． 8 mg /mL时，其抗
氧化能力增长缓慢，趋于平衡，整体抑制能力较强并显著高
于 T-P。T-P的脂质抗氧化活性随浓度的增加而逐渐增大，
基本呈线性增长关系。
图 4 T-P、P-P的脂质氧化抑制率
Fig． 4 Inhibitory rate of lipid peroxidation activities of T-P and
P-P
2． 5 多肽与蛋白抗氧化活性比较 在同一浓度(0． 4
mg /mL)时，水溶性蛋白、T-P、P-P的抗氧化活性试验结果如
图 5所示。从图 5可以看出，水溶性蛋白对于 3种自由基的
清除作用显著高于酶解多肽，特别是对于·OH的清除效果
十分显著，已超过 90%。该结果说明，对于水溶液中的自由
基清除活性，水溶性蛋白要比酶解多肽更加显著。但是，在
脂质体系中，水溶性蛋白的抗氧化能力表现稍差。分析其原
因:水溶性蛋白是水提成分且分子量较大，不溶于脂质体系，
因此在脂质体系中不能更好地分散在溶液中从而不能有效表
达其抗氧化活性所致，而多肽由于分子量较小，相对溶解度要
高于水溶性蛋白，因此脂质抗氧化活性优于蛋白本身。
图 5 水溶性蛋白、T-P、P-P抗氧化活性比较
Fig． 5 Comparison of antioxidant activities of water soluble pro-
tein，T-P and P-P
3 结论与讨论
该研究表明，采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制备的多
棘海盘车多肽，对 DPPH·、O －2 ·和·OH均具有一定的清除
作用，对脂质体系的氧化也有一定的抑制作用。根据清除率
计算结果可知，T-P、P-P 对 DPPH·清除作用和脂质氧化的
抑制作用较为显著，而对 O －2 ·和·OH 的清除作用并不显
411 安徽农业科学 2016 年
著。多肽样品的浓度越高，其对自由基清除的效果和对脂质
氧化的抑制作用越好，其中由木瓜蛋白酶酶解得到的多肽抗
氧化活性要优于胰蛋白酶酶解所得多肽;相同浓度下，多棘
海盘车水溶性蛋白的清除自由基的能力显著高于酶解多肽，
最高可相差 9倍。与前人研究结果相比，由胰蛋白酶和木瓜
蛋白酶酶解多棘海盘车所得多肽对 3 种自由基的清除率及
其脂质体系的抗氧化活性均低于海参、海藻等海洋生物酶解
多肽［11 －12］。但是对多棘海盘车酶解多肽的抗氧化活性的研
究目前鲜见报道，且海星一般属于废弃资源，通过该研究能
够获得具有活性的组分，可为海星资源的进一步开发利用提
供参考。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
6 －10．
(上接第 108 页)
表 5 全定量和半定量的结果对比
Table 5 Comparison between full quantitative and semi-quantitative methods
试样
Sample
元素
Element
全定量测定值
Full quantitative measured result ∥μg /L
半定量测定值
Semi-quantitative measured result ∥μg /L
偏差 SD
Deviation∥%
虾仁 Shrimp meat Pb 108． 29 90． 33 18． 08
Cd 143． 45 132． 23 8． 14
Cr 391． 15 384． 55 1． 70
Hg 76． 09 65． 12 15． 54
As 2 070． 95 2 016． 19 2． 68
Ba 954． 86 915． 88 4． 17
Sb 55． 18 47． 64 14． 67
Cu 1 284． 36 1 227． 55 4． 52
杨梅 waxberry Pb 651． 39 632． 71 2． 91
Cd 2． 60 2． 02 25． 11
Cr 483． 58 469． 41 2． 97
Hg 7． 74 7． 09 8． 77
As 85． 79 70． 65 19． 36
Ba 428． 18 411． 80 3． 90
Sb 10． 32 9． 17 11． 80
Cu 525． 61 500． 16 4． 96
生姜片 Ginger slice Pb 299． 10 278． 83 7． 01
Cd 45． 68 41． 39 2． 50
Cr 269． 56 260． 21 9． 85
Hg 9． 28 7． 88 16． 32
As 24． 64 21． 39 14． 12
Ba 3 641． 37 3 600． 54 1． 13
Sb 25． 79 25． 19 2． 35
Cu 787． 25 762． 32 3． 22
食品添加剂 Food additives Pb 38． 78 35． 02 10． 19
Cd 11． 60 10． 12 13． 63
Cr 187． 00 180． 96 3． 28
Hg 1． 22 1． 36 10． 85
As 7． 58 6． 62 13． 52
Ba 892． 38 879． 09 1． 50
Sb 5． 43 4． 16 26． 49
Cu 943． 13 930． 38 1． 36
3 结论
该试验通过电感耦合等离子体质谱半定量法对样品进
行测试，样品的加标回收率为 82． 80% ～ 118． 00%，全定量
和半定量测定结果偏差为 1． 13% ～ 26． 49%。研究表明，该
方法结果准确可靠，快速方便。在无标准溶液条件下采用
该方法进行测定，能够为常规全定量分析提供可靠的数据
依据，进一步证实了数据的真实性，同时也可应用于未知元
素的定性分析，对食品中有毒有害元素的排查也具有实际
意义。
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