全 文 ：收稿日期:2011-05-04
基金项目:国家科技支撑计划课题(2007BAI30B06-2)
作者简介:谭秀芳(1962-) ，女，本科，副教授，研究方向:新疆地产中草药成分研究及分析;E-mail:txf717@ 163. com。
* 通讯作者:李晓瑾，E-mail:xjlxj@ 126. com。
·鉴别·
新疆传统维药黑种草子 HPLC指纹图谱研究
谭秀芳1，李晓瑾2* ，王 强3，石明辉2，杨 杰3，曹 园3
(1. 新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830054;2. 新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002;
3. 中国药科大学中药学院，江苏 南京 210009)
摘要 目的:建立黑种草子高效液相色谱指纹图谱。方法:Shim-pack ODS C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)为色
谱柱，乙腈-0. 1%甲酸水系统为流动相梯度洗脱，检测波长为 280 nm，柱温为30 ℃。结果:测定了产于新疆的 10 批
黑种草子的指纹图谱，标定了 18 个共有指纹峰，方法学考察结果符合指纹图谱技术要求，经计算机模拟相似度软
件计算，相似度大于 0. 95。结论:建立的 HPLC指纹图谱分析方法可作为黑种草子的鉴别方法之一，为黑种草子的
质量控制提供了依据。
关键词 黑种草子;高效液相;指纹图谱
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)12-1857-04
HPLC Fingerprint Spectrum of Xinjiang Uyghur Medicine Nigella glandulifera Seed
TAN Xiu-fang1，LI Xiao-jin2，WANG Qiang3，SHI Ming-hui2，YANG Jie3，CAO Yuan3
(1. College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urmqi 830054，China;2. Chinese Herb and Minority Medicine Institute of Xin-
jiang，Urmqi 830000，China;3. College of Traditional Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)
Abstract Objective:To establish the HPLC fingerprint spectrum of Nigella glandulifera seed identification. Methods:The chro-
matographic system consisted of a Shim-pack ODS C18 column (150 mm × 4. 6 mm，5 μm)and a mobile phase of acetonitrile-0. 1%
formic acid in condition of gradient elution，The detection wavelength was 280 nm. The column temperature was 30 ℃. Results:Detec-
ted the HPLC fingerprint spectrum of 10 batches samples Nigella glandulifera seed from Xinjiang;Calibrated 18 characteristic
peaks. The result was in accordance with the technical requirement of fingerprint spectrum. The similarity calculation software showed
that the similarity was higher than 0. 95. Conclusion:The HPLC fingerprint spectrum of Nigella glandulifera seed can be used as an i-
dentification method. It may provide the basis for quality control of Nigella glandulifera seed.
Key words Nigella glandulifera Seed;HPLC;Fingerprint spectrum
黑种草为毛茛科黑种草属植物，一般药用部位
为种子，目前作为药用的 3 个种，分别为瘤果黑种草
(又名腺毛黑种草)Nigella glandulifera Freyn et Sint，
果黑种草(又名黑香种草)Nigella sativa L. 以及黑
种草 Nigella damascena L. 。瘤果黑种草为新疆维吾
尔族和西双版纳傣族习用药材，维吾尔族名为斯亚
旦，功效为利尿，补脑，补肾，活血，解毒，下乳，通经，
止咳，乌发，抗衰老;常用于胸闷气促，乳房肿痛，耳
鸣，乳汁减少，热淋，石淋，闭经等症。长期使用可使
白发变乌。另外，拌醋食用可驱虫，拌蜜食用可治气
喘〔1〕。傣语名为景郎，功效为芳香开窍，清脑醒神，
除风解痉，调经止血，温通止痛;用于高血压病引起
的头昏头痛，失眠多梦，风湿病关节肌肉肿痛及腰膝
冷痛，癫痫所致头晕目眩、头昏头痛，中暑、晕车、晕
船，月子病(产后病)引起的流血不止、贫血、月经不
调、痛经、闭经，急慢性胃炎引起的胃脘疼痛、不思饮
食、泄泻〔2〕。为中国药典收载的傣成药七味榼藤子
丸的主要组成药材之一。黑种草的种子除了含有挥
发油和脂肪酸外，还含有黄酮类、皂苷类、生物碱类
等化学成分;具有抗菌、抗感染、抗氧化活力等多种
药理活性〔3〕。本文通过对新疆地区 10 批黑种草子
HPLC指纹研究和分析，建立了黑种草子的 HPLC 指
纹图谱，为控制维吾尔药材黑种草子质量提供参考。
1 仪器与材料
Agilent1100 系列 HPLC，包括二元泵、DAD检测
器、自动进样器;HPCHEM 色谱工作站;H66MC 型
超声清洗振荡器;Sartorius BS110S万分之一分析天
平。乙腈为色谱纯，水为市售纯净水;对照品没食子
酸购于中国药品生物制品检定所(批号:11083-
200302)。黑种草子药材(10 批)采集于新疆各地
区，见表 1。经新疆中药民族药研究所研究员李晓
瑾鉴定为瘤果黑种草 Nigella glandulifera Freyn et
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.12.016
Sint的种子。
表 1 黑种草子样品采集地及采集时间
样品号 采集地 采集时间
1 喀什 2009. 8
2 阿克苏 2009. 8
3 墨玉 2009. 8
4 吉木萨尔县 2009. 8
5 乌鲁木齐市鲤鱼山(原种:哈萨克斯坦) 2009. 8
6 农大栽培(原种:和田) 2009. 8
7 和田 2009. 8
8 农大栽培(原种:叶城) 2009. 8
9 洛浦 2009. 8
10 和田县 2009. 8
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 用 Zorbax ODS柱为保护柱，Shim-
pack ODS C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)为色谱柱，
乙腈-0. 1%甲酸水系统为流动相梯度洗脱，梯度洗
脱程序见表 2，检测波长为 280 nm，柱温为30 ℃;色
谱柱的理论塔板数以没食子酸计不少于3 000。
表 2 梯度洗脱程序
时间 /min A(0. 1%甲酸水) B(乙腈)流速 /(mL /min)
0 95 5 1
20 82 18 1
30 75 25 1
45 60 40 1
51 55 45 1
54 36 64 1
62 36 64 1
2. 2 内标物溶液的制备 精密称取没食子酸对照
品 25 mg，加 70%乙醇定容至 50 mL 容量瓶，制成
0. 5 mg /mL的内标物溶液。
2. 3 供试品溶液的制备 将黑种草子药材粉碎
(过 40 目筛) ，精密称定 1 g，加入 20 mL 70%乙醇，
精密称定，超声处理 30 min，冷却后补足重量，过滤，
精密量取续滤液 5 mL于 10 mL容量瓶中，精密加入
2 mL内标物溶液，加 70% 乙醇定容至 10 mL，过
0. 45 μm的微孔滤膜，即得。
2. 4 测定方法 高效液相色谱法(2010 版中国药
典一部附录ⅣD) ，结合指纹图谱的要求进行测定。
精密吸取供试品溶液 8 μL，注入高效液相色谱仪，
记录 62 min 的色谱图，即得。以没食子酸色谱峰
(S)的保留时间和峰面积为 1，计算相对保留时间和
相对峰面积。
2. 5 方法学考察
2. 5. 1 精密度试验:将样品 10 连续进样 5 次，计
算 18 个共有峰的相对保留时间 RSD 在 0. 23% ～
0. 75%、相对峰面积 RSD 在 0. 5% ～ 3. 4%，结果显
示仪器精密度良好。
2. 5. 2 稳定性试验:对样品分别测定 0、2、4、8、
12、24 h的色谱行为，并分别计算相对保留时间 RSD
在 0. 47% ～ 5. 59%及相对峰面积 RSD 在 1. 74% ～
6. 68%，结果显示样品在 24 h内基本稳定。
2. 5. 3 重现性试验:分别精密称取样品 7 共 5 份，
按供试品制备项下方法制备样品，注入液相色谱仪，
测定，分别计算相对保留时间 RSD 在 0. 40% ～
0. 76%、相对峰面积 RSD 在 0. 8% ～ 3. 3%，结果显
示重复性良好。
2. 6 HPLC 指纹图谱的建立 取供试品溶液 5
μL，注入液相色谱仪，按选定的测试条件进行检测。
同一条件下，测定所有供试品的 HPLC 色谱图，见图
1。根据 10 批次供试品测定结果所给出的峰数、峰
值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关参数，进
行分析、比较，制定优化的指纹图谱。以没食子酸为
内标峰，共标定了 18 个共有峰。
2. 7 指纹图谱分析 按“2. 4”项下方法测定 10 批
黑种草子，检测结果见表 3、4。根据 10 批供试样品
HPLC图给出的相关参数，比较、分析供试品谱图和
内标物谱图，采用相对保留时间标定共有指纹峰，标
定了 18 个共有峰，建立了黑种草子药材的 HPLC 图
谱。黑种草子供试品的非共有峰面积与总峰面积相
比，小于 10%。
黑种草子相似度评价:将 10 个批次黑种草子样
品 HPLC测试数据导入国家药典委员会“中药指纹
图谱相似度评价系统(2004A)”软件，将色谱峰自动
匹配，然后生成对照图谱，进行谱峰差异性评价和整
体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件
得出黑种草子样品 HPLC 指纹图谱共有模式图，见
图 2，与共有模式比较，10 个批次黑种草子相似度见
表 5。
3 讨论
3. 1 色谱柱的选择 以 Zorbax ODS 柱为保护柱，
考察了 Zorbax Extend-C18 (250 mm × 4. 6 mm，5
μm) ，Zorbax SB-C18(250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ，Han-
ban-C18(250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ，Shim-pack ODS
C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱，以 Shim-pack
ODS C18(150 mm ×4. 6 mm，5 μm)柱对色谱峰的分
离度最好，且色谱峰峰形最佳，因此，采用 Shim-pack
ODS C18(150 mm ×4. 6 mm，5 μm)柱为固定相。
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图 1 黑种草子药材标准 HPLC图谱
表 3 黑种草子药材共有峰相对保留时间
1(S) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
1 1. 000 1. 752 2. 28 2. 337 2. 745 2. 961 3. 036 3. 190 3. 343 3. 438 3. 641 3. 759 4. 542 4. 642 5. 036 5. 805 6. 581 7. 779 7. 943
2 1. 000 1. 756 2. 274 2. 336 2. 746 2. 955 3. 025 3. 181 3. 333 3. 425 3. 625 3. 747 4. 510 4. 618 5. 001 5. 755 6. 525 7. 710 7. 872
3 1. 000 1. 748 2. 262 2. 332 2. 717 2. 921 2. 993 3. 143 3. 286 3. 393 3. 592 3. 709 4. 461 4. 565 4. 959 5. 694 6. 461 7. 629 7. 788
4 1. 000 1. 748 2. 212 2. 333 2. 714 2. 919 2. 988 3. 134 3. 277 3. 382 3. 579 3. 694 4. 438 4. 543 4. 935 5. 663 6. 423 7. 593 7. 752
5 1. 000 1. 757 2. 276 2. 346 2. 743 2. 953 3. 022 3. 175 3. 324 3. 426 3. 628 3. 747 4. 513 4. 620 5. 015 5. 762 6. 540 7. 729 7. 891
6 1. 000 1. 754 2. 269 2. 337 2. 733 2. 94 3. 011 3. 164 3. 313 3. 413 3. 613 3. 732 4. 498 4. 605 4. 998 5. 748 6. 519 7. 704 7. 865
7 1. 000 1. 749 2. 271 2. 337 2. 74 2. 948 3. 020 3. 176 3. 330 3. 425 3. 627 3. 749 4. 523 4. 628 5. 020 5. 786 6. 564 7. 763 7. 927
8 1. 000 1. 753 2. 275 2. 339 2. 747 2. 955 3. 028 3. 184 3. 338 3. 432 3. 634 3. 756 4. 532 4. 637 5. 029 5. 799 6. 578 7. 780 7. 944
9 1. 000 1. 756 2. 274 2. 337 2. 743 2. 948 3. 021 3. 174 3. 329 3. 424 3. 625 3. 746 4. 519 4. 623 5. 013 5. 780 6. 554 7. 755 7. 920
10 1. 000 1. 754 2. 271 2. 334 2. 737 2. 945 3. 017 3. 171 3. 326 3. 420 3. 622 3. 743 4. 512 4. 617 5. 007 5. 771 6. 544 7. 740 7. 903
平均 1. 753 2. 266 2. 337 2. 737 2. 945 3. 016 3. 169 3. 320 3. 418 3. 619 3. 738 4. 505 4. 610 5. 001 5. 756 6. 529 7. 718 7. 881
RSD% 0. 2 0. 9 0. 2 0. 4 0. 5 0. 5 0. 6 0. 7 0. 5 0. 5 0. 6 0. 7 0. 7 0. 6 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8
表 4 黑种草子药材共有峰峰面积比值
1(S) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
1 1. 000 0. 685 0. 276 0. 425 2. 281 0. 210 0. 200 0. 498 0. 293 2. 359 0. 088 0. 081 0. 281 0. 222 0. 892 0. 120 0. 710 0. 854 0. 220
2 1. 000 0. 565 0. 277 0. 280 1. 480 0. 163 0. 205 0. 391 0. 206 1. 570 0. 059 0. 059 0. 203 0. 164 0. 848 0. 197 0. 679 0. 585 0. 216
3 1. 000 0. 901 0. 309 0. 466 1. 785 0. 199 0. 277 0. 501 0. 187 2. 001 0. 111 0. 103 0. 292 0. 248 0. 806 0. 126 0. 671 0. 908 0. 211
4 1. 000 1. 362 0. 345 0. 467 2. 513 0. 188 0. 328 0. 576 0. 185 3. 113 0. 092 0. 110 0. 338 0. 251 1. 121 0. 210 0. 850 1. 188 0. 318
5 1. 000 0. 724 0. 276 0. 357 1. 887 0. 163 0. 260 0. 439 0. 254 1. 838 0. 096 0. 093 0. 273 0. 179 1. 012 0. 156 0. 482 1. 305 0. 239
6 1. 000 0. 762 0. 346 0. 542 2. 030 0. 279 0. 281 0. 633 0. 202 2. 594 0. 092 0. 105 0. 294 0. 275 0. 991 0. 225 0. 821 1. 107 0. 368
7 1. 000 0. 678 0. 269 0. 372 1. 626 0. 196 0. 208 0. 454 0. 222 1. 696 0. 089 0. 077 0. 269 0. 159 1. 524 0. 311 0. 480 1. 223 0. 326
8 1. 000 0. 658 0. 256 0. 426 1. 573 0. 196 0. 197 0. 460 0. 218 1. 725 0. 074 0. 065 0. 218 0. 206 0. 859 0. 192 0. 583 0. 700 0. 202
9 1. 000 0. 581 0. 286 0. 471 1. 811 0. 185 0. 252 0. 478 0. 268 1. 836 0. 076 0. 075 0. 263 0. 209 1. 157 0. 215 0. 844 0. 996 0. 221
10 1. 000 0. 561 0. 261 0. 272 1. 431 0. 159 0. 202 0. 387 0. 206 1. 553 0. 058 0. 063 0. 203 0. 164 0. 849 0. 200 0. 674 0. 590 0. 215
平均 0. 748 0. 290 0. 408 1. 842 0. 194 0. 241 0. 482 0. 224 2. 029 0. 084 0. 083 0. 263 0. 208 1. 006 0. 195 0. 679 0. 946 0. 254
RSD% 32. 0 11. 2 21. 3 19. 0 17. 9 18. 8 15. 9 16. 1 25. 0 20. 0 22. 4 16. 6 19. 8 21. 7 28. 0 19. 9 27. 8 23. 6
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图 2 10 批黑种草子 HPLC指纹图谱共有模式图
表 5 10 批黑种草子药材相似度
样品号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照指纹图谱
1 1
2 0. 991 1
3 0. 989 0. 995 1
4 0. 984 0. 986 0. 989 1
5 0. 974 0. 973 0. 981 0. 970 1
6 0. 988 0. 993 0. 990 0. 982 0. 979 1
7 0. 961 0. 967 0. 985 0. 980 0. 984 0. 952 1
8 0. 985 0. 984 0. 991 0. 979 0. 981 0. 981 0. 966 1
9 0. 977 0. 972 0. 982 0. 970 0. 982 0. 977 0. 974 0. 992 1
10 0. 977 0. 973 0. 981 0. 969 0. 968 0. 970 0. 955 0. 992 0. 990 1
对照指纹图谱 0. 992 0. 992 0. 996 0. 988 0. 990 0. 992 0. 970 0. 995 0. 991 0. 987 1
3. 2 提取方法的考察 考察 70 %乙醇冷浸、超声
30 min及加热回流 1 h的总峰面积，以 70 %乙醇超
声 30 min 及加热回流 1 h 总峰面积最大，由于超声
法省时，所以选择 70%乙醇超声 30 min。
3. 3 流动相的选择 考察了甲醇-水、乙腈-水、甲
醇-乙腈-水系统，以乙腈-水系统色谱峰分离度最佳，
因此，选择乙腈-水系统为流动相。另外，此时色谱
峰拖尾严重。考察了甲醇-0. 1% 甲酸水、甲醇-
0. 1%乙酸水、甲醇-0. 1% 磷酸水系统，以乙腈-
0. 1%甲酸水系统所得色谱峰峰形最佳，因此，最终
采用乙腈-0. 1%甲酸水系统为流动相。
3. 4 检测波长的选择 因黑种草子所含成分类型
较多，且有效成分不甚明确，考虑到研究指纹图谱的
目的是:尽可能得到多的可供分析的色谱峰信息，以
便挑选出更多的样品共有峰，进而能更全面的控制
药材的品质。为此我们做了样品溶液的紫外光区全
波长扫描。经 DAD检测器在 190 ～ 400 nm扫描，在
280 nm左右给出的色谱峰信息较多，且各个色谱峰
响应值相当，所以选择在 280 nm处检测。
本研究采用了 HPLC 技术，建立了黑种草子的
指纹谱。在实验色谱条件下，能得到较多的色谱峰
且分离效果好，据此所得的相对保留值也十分稳定，
所建立的色谱指纹谱具有较大的稳定性和可控性。
笔者认为该方法能得到黑种草子药材所含组分的大
量信息，其指纹谱能反映黑种草子药材的内在品质，
可用于黑种草子药材品质和真伪品的鉴别。
参 考 文 献
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［3］信学雷，薛慧清 . 黑种草属植物研究进展［J］. 时珍国
医国药，2008，19(6) :1514.
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