全 文 ：研究报告 中 国 酿 造
2011年 第 5期
总第 230期 ·95·
灰树花胞内多糖和胞外多糖的组成分析
王艳萍1， 黄 剑1， 刘舒翔2， 高应瑞1， 赵运星1
(1. 天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457;2. 天津大自然装饰有限公司，天津 300221)
摘 要:为研究灰树花胞内多糖和胞外多糖在组成上的差别与共同点，文中采用薄层色谱法(TLC) 和柱前衍生化高效液相色谱法
(PMP-HPLC) 对灰树花(Grifola frondosa) 的胞内多糖和胞外多糖进行组成测定。首先采用 TLC法分离，进一步采用 PMP-HPLC法
分离确定。实验结果显示，发酵液多糖( 胞外多糖) 仅由葡萄糖组成;来自胞内的菌丝体多糖和子实体多糖则均由葡萄糖和半乳糖
组成，其摩尔比例分别为1∶8. 02和 8. 42∶1。因此胞内多糖和胞外多糖在单糖组成上不一样，但都含有葡萄糖。
关 键 词:灰树花多糖;单糖组成;薄层分离;液相色谱
中图分类号:O657．7 文献标识码:A 文章编号:0254 －5071(2011)05 －0095 －03
Composition analysis of intracellular and extracellular polysaccharide of Grifola frondosa
WANG Yanping1，HUANG Jian1，LIU Shuxiang2，GAO Yingrui1，ZHAO Yunxing1
(1. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457，China;
2. Tianjin Nature Decoration Co.，Ltd.，Tianjin300221，China)
Abstract:To characterize the differences and similarities between intracellular polysaccharides (IPS)and extracellular polysaccharides (EPS)of
Grifola frondosa，the compositions of IPS and EPS were determined by TLC and PMP-HPLC. TLC was used for separation and then PMP-HPLC
was used for further determination of the compositions. The results showed that EPS in broth was only composed of glucose，while IPS in mycelium
or fruiting body consisted of both glucose and galactose with a mol ratio of 1∶8. 02 or 8. 42∶1，respectively. The composition of IPS and EPS
was different，but both contained glucose.
Key words:Grifola frondosa polysaccharides;monosaccharide compositions;TLC;HPLC
灰树花是一种珍稀的食、药兼用真菌，具有明显的抗肿
瘤，改善免疫系统功能等作用［1］。近年来，我国学者已经对
灰树花的化学组成和药学功能有了较深入研究［2］。多糖的
单糖组成测定是提供多糖基本信息的重要的环节［3］，目前
对真菌多糖组成的研究也非常多，有少数研究显示，不同提
取来源的真菌多糖在组成和结构上不尽相同［4］，目前国内
尚未对这此进行系统和完整的分析比较，特别是将同一株
真菌多糖所产生的胞外多糖和胞内多糖进行比较的研究非
常少，不利于构效关系的深入研究。本实验以来自灰树花
菌种(Grifola frondosa) 的胞内多糖和胞外多糖为研究对象，
采用薄层色谱和柱前衍生化高效液相色谱法对其单糖组成
进行测定，再根据色谱结果比对其间的差别和共同点。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 样品来源
胞内多糖提取自子实体和菌丝体，胞外多糖来源于发
酵液，其均由灰树花菌株(Grifola frondosa) 培养所得。
1. 1. 2 试剂
衍生化剂:1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 为分析
纯;甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖(Sigma
公司) ;乙腈为色谱纯;水为高纯水。荧光硅胶板(GF254，
德国 Merck公司) ;其他试剂均为分析纯。
1. 1. 3 仪器
日立 D-2000 Elite高效液相色谱仪;5415D型艾本德离心
机;ZF-A暗箱紫外分析仪;Scientz-IID型超声波细胞破碎仪。
1. 2 方法
1. 2. 1 子实体和菌丝体的超声处理
称量子实体和菌丝体各 10. 0g，按料液比 1∶10加入蒸馏
水，在 35 ℃进行超声波处理，超声功率 400W;时间25min;脉
冲为超声工作 1s，间隙 2s;超声后过滤收集提取液。
1. 2. 2 多糖的提取与纯化
超声处理后，从发酵液，子实体和菌丝体的提取液中，
各取一定量，均以 4倍体积的 75% vol乙醇醇沉，4℃冰箱内
静置过夜，静置后 8000r /min离心 15min，所得沉淀复溶于
收稿日期:2011 －01 －27
基金项目:天津市滨海新区知识产权专项资金，产学研合作知识产权初创项目支持(2010 － Bk17C026)
作者简介:王艳萍(1962 －) ，女，教授，主要从事食品生物技术工作
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。
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水，再用 Sevag 法［5］除蛋白，6000r /min 离心 20min，取上清
液后干燥得多糖。最后采用苯酚-硫酸法测定多糖样品中
多糖含量［6］，并计算多糖得率。
1. 2. 3 多糖的水解
分别取来自于发酵液、菌丝体和子实体的多糖样品各
1mg于安瓿中，再加入 1mL 三氟乙酸溶液(4mol /L) ，封管
后于 110℃烘箱中水解 2h，得水解样品溶液。
1. 2. 4 薄层分离方法
具体薄层色谱方法参见文献［7］，分离结束后将荧光
硅胶板放在紫外分析仪中通过 254nm的紫外线照射观察。
1. 2. 5 混合单糖标样的液相柱前衍生化［8］
分别取 100μL 的混合单糖( 甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、
半乳糖、木糖) 标准液( 各单糖质量浓度均为0. 15g /L) 于
100μL的 NaOH溶液(0. 6mol /L) 中，置于1mL 的带盖试管
中混合均匀; 再取50μL 的混合液于 5mL 的试管中，加入
50μL的 PMP(0. 6mol /L) 甲醇溶液，漩涡混匀;在70℃烘箱
中反应 100min; 取出放置10min 冷却至室温; 加50μL 的
HC1(0. 3mol /L) 中和;加水至1mL，再加等体积的氯仿，振
摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取 3 次，将水相用 0. 45nm微
孔膜过滤后供 HPLC进样分析。
1. 2. 6 样品的柱前衍生化
取 100μL水解后的样品于 100μL的 NaOH(0. 6mol /L)
溶液中混匀，充分溶解后按“1. 2. 5”的方法进行衍生化，中
和，萃取，并用微孔膜过滤。
1. 2. 7 液相色谱分析条件
色谱柱:XDB-C18(50mm ×4. 6mm，5μm，美国 Agilent 公
司) ;流动相:0. 1mol /L 磷酸盐缓冲液(pH6. 7)-乙腈(v∶v
=83∶17) ;柱温:30℃;检测波长:250nm;流速:1mL /min;进
样体积:10μL。
2 结果与讨论
2. 1 灰树花多糖得率
采用苯酚-硫酸法测定 10g样品中多糖含量，并按以下
公式计算多糖得率。
多糖得率 =多糖质量
样品质量
×100%
表 1 灰树花多糖得率检测结果
Table 1． Polysaccharide yields of Grifola frondosa
灰树花 多糖得率 /% 多糖产量 / g
发酵液多糖 1. 5 0. 148
菌丝体多糖 0. 8 0. 08
子实体多糖 8. 9 0. 89
2. 2 薄层色谱分析
对单糖标品及样品水解液进行薄层色谱分析，其薄层
色谱分析结果见图 1。结果表明，发酵液多糖水解后的组
成初步推断为为葡萄糖，子实体多糖的组成为鼠李糖、木
糖、葡萄糖、半乳糖，并可能含有甘露糖。菌丝体多糖的组
成为葡萄糖、鼠李糖，并可能含有半乳糖。由于薄层色谱分
辨率的限制，一些单糖显示的斑点模糊和出现重叠，所以在
此基础上将采用 PMP-HPLC法进一步确认。
图 1 单糖混标，发酵液，子实体和菌丝体多糖水解液的薄层色谱图
Figure 1． TLC chromatograms of standard monosaccharides and hy
drolysates of polysaccharides from broth，mycelium and
fruiting body
2. 3 标品及样品衍生化后液相色谱图
标品液相图谱见图 2，样品水解液液相图谱见图 3。
通过与标品图谱比对可知，发酵液多糖只由葡萄糖组成。
菌丝体和子实体多糖都是由葡萄糖和半乳糖 2 种单
糖组成。
图 2 标准单糖 PMP衍生化色谱分离图
Figure 2． PMP-HPLC chromatogram of mixed standard monosaccharides
2. 4 胞内和胞外多糖的组成分析
通过以上色谱图的信息可计算单糖的摩尔比。摩尔
比:R = f × AM;(A为单糖峰面积;f为校正因子;M为单糖分
子量) ，当定性分析时，校正因子f 为 1. 000，R = AM，经计算
的结果见表 2，通过比较可以发现这 3种多糖的单糖组成都
含有葡萄糖，并占有较大比例。
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图 3 发酵液多糖(A)、菌丝体多糖(B)、子实体多糖(C)水解液色谱图
Figure 3． PMP-HPLC chromatogram of broth polysaccharide hydroly
sate(A)mycelium polysaccharide hydrolysate(B)and fruit
ing body polysaccharide hydrolysate(C)
表 2 各灰树花多糖单糖组成测定及其之间比对结果
Table 2． Analysis ofmonosaccharide compositions of Grifola frondosa
polysaccharides from broth，mycelium and fruiting body
灰树花 单糖及其峰面积 单糖摩尔比 葡萄糖所占比例 /%
发酵液多糖
( 胞外多糖)
葡萄糖:4384284 - 100. 0
菌丝体多糖
( 胞内多糖)
葡萄糖:193302
半乳糖:1700784
1∶8. 02
( 葡萄糖∶半乳糖)
11. 1
子实体多糖
( 胞内多糖)
葡萄糖:8826496
半乳糖:1049819
8. 42∶1
( 葡萄糖∶半乳糖)
89. 4
3 结论
同一株真菌产生的胞内和胞外多糖在组成上有哪些差
别与共同点，国内对这个问题的研究还非常少，因此以同一
灰树花菌株的胞内多糖和胞外多糖作为研究对象，比对其
的组成差别和共性。从单糖类别分析，来自于胞外的发酵
液多糖仅由葡萄糖组成，而胞内的菌丝体和子实体多糖均
由葡萄糖和半乳糖组成，这说明胞内多糖和胞外多糖是不
一样的;从单糖组成比例上看，三者都是以葡萄糖为主要组
成，且在发酵液和子实体多糖中含有较大比例，比例分别为
100%和 89. 4%，见表 2，这是其共同点，同时也与冯慧琴
等［4］的研究结果相似，即子实体和菌丝体的多糖组成都以
葡萄糖为主，但是其实验的研究对象并非来源于同一菌种，
所以只能说明大多数的灰树花多糖可能在组成上有这样一
类共性，而由于本实验比对的是同一菌株，但子实体、菌丝
体和发酵液的培养方法不一样( 子实体是种植培养，菌丝体
和发酵液来自深层发酵) ，那么通过该比对实验可以更进一
步的推测培养方法对多糖的影响，即虽然培养方法不一样
但同为胞内的菌丝体多糖和子实体多糖在组成上更为相
似，虽然同是深层发酵，但菌丝体多糖( 胞内多糖) 和发酵液
多糖( 胞外多糖) 则有较大差异，初步推断，不同来源对灰树
花多糖的组成影响较大，而培养方法影响相对较小，但这需
要更多相关实验的比对和研究。
参考文献:
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