全 文 ：·药理·
风轮菜活性部位体外抗氧化作用的实验研究
李　娟 ,吴斐华＊ ,苏锦冰 ,马世平＊(中国药科大学中药药理教研室 南京 211198)
摘要:目的　研究风轮菜活性部位(CCE)的体外抗氧化活性 ,为将其开发为新的抗氧化药物提供实验依据。方法　通过体外实验测定CCE对
超氧阴离子(O -2)、羟基自由基(·OH)及有机自由基 DPPH·的清除作用以及对亚铁离子-维生素 C(Fe2+-VitC)诱导的小鼠肝脂质过氧化的影
响。建立高浓度葡萄糖损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的体外模型 ,测定 CCE对细胞超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的影
响。结果　CCE能有效清除O -2 、·OH 和 DPPH 自由基 ,其中·OH 的清除力最强 , 对 Fe2+-VitC 诱导的肝匀浆脂质过氧化反应有明显的抑制
作用 ,且呈浓度依赖性。此外 , CCE能明显提高高糖刺激下内皮细胞中的 SOD水平 ,降低 LDH 活性。结论　CCE具有显著的体外抗氧化活
性。
关键词:风轮菜;自由基;抗氧化;内皮细胞
中图分类号:R969　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2012)-09-0017-04
作者简介:李　娟 , 女。中国药科大学中药学院中药药理专业 2009
级硕士研究生。联系电话:13705174403 , E-mail:amoshore@163.com
通讯作者:吴斐华。 E-mail:fhw u2000@yahoo.com.cn;马世平 , E-
mail:spma@cpu.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81102862),中国药科大学中
央高校基本科研业务费专项基金培育项目(JKP2009008)
Study on antioxidation of active fraction from ClinopodiumChinese in vitro
LI Juan ,WUFei-hua＊ ,SUJin-bing ,MA Shi-ping(Department of Pharmacology for Chinese Materia Medica ,Chi-
na Pharmaceutical University ,Nanjing , 211198 ,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To invest ig ate the ant ioxidation of act ive fraction f rom Clinopodium chinese(CCE)
in vit ro ,which w ould provide experimental evidences fo r further research.METHODS　The antioxidant act ivity
of CCE was evaluated by measuring the clearance of 2-diphenyl-2-picrylhydrazy l (DPPH), superoxide anion
(O-2 ),hydroxyl radical(·OH), and inhibi tion rat io of lipid peroxidation of mice-liver homogenate using an in vit-
ro system.Human umbilical vascular endothelial cells(HUVECs)were t reated w ith high g lucose and CCE , then
the activi ties of superoxide dismutase(SOD)and lactate dehydrogenase(LDH)were measured.RESULTS　CCE
exhibited a concentration-dependent inhibitory effect on the DPPH ,·OH ,O-2 and lipid perox idat ion significantly ,
especially the scavenging capacity for ·OH.Moreover , t reatment w ith CCE markely increased the level of SOD and
eff iciently decreased the activity of LDH in HUVECs incubated by high glucose.CONCLUSION　The active f rac-
tion f rom Clinopodium chinese possesses significant antioxidant act ivity in vit ro.
KEY WORDS:Clinopodium chinese;Free Radical;Antioxidant;HUVEC
　　机体抗氧化防御系统失衡会导致体内自由基积聚 , 进而
对机体细胞造成损伤。同时 , 自由基紊乱还参与机体多种疾
病的发病机制 ,如心脏病 、癌症 、糖尿病等〔1〕。其中 ,糖尿病引
起的高血糖会导致机体自由基紊乱 ,产生氧化应激 , 从而对心
血管造成损伤〔2〕。因此 , 研究和开发天然的抗氧化药物对防
治糖尿病心血管并发症有着重要意义。
风轮菜属唇形科植物(Clinopodium Chinese(Benth.)
O.Kuntze〔Chinensis Benth.〕)多为民间用药(见图 1), 在福建
常用作治疗糖尿病 , 其化学成份主要有黄酮类 、皂苷类 、有机
酸类 、芳香族类 、三萜类 、甾体类等〔3〕。实验室前期研究结果
表明 , 风轮菜乙醇提取物能显著降低糖尿病小鼠血糖 , 并对过
氧化氢损伤的内皮细胞具有显著保护作用〔4 , 5〕。 本文采用体
外自由基清除实验以及高糖诱导的内皮细胞氧化应激损伤模
型 , 研究风轮菜活性部位(CCE)的抗氧化活性 , 对其降血糖及
血管内皮保护作用的可能机制作出初步研究 , 为进一步将其
开发为糖尿病及其并发症治疗药物奠定基础。
1　实验材料与方法
1.1　实验材料　风轮菜全草采集于福建省莆田县 , 经中国药
科大学生药学研究室濮社班副研究员鉴定为Clinopodium chi-
nense(Benth.)O.Kuntze。HUVEC 细胞(由中国药科大学中
·17·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 24 No.9 2012
药药理教研室提供);DM EM 培养基(Gibco);胎牛血清(杭州
四季青生物工程有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒 、
乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所);考马
斯亮蓝 、1 , 1-二苯基-2-苦基肼基游离自由基(DPPH)、邻苯三
酚(Sigma);硫代巴比妥(TBA)、三氯乙酸(TCA)(中国医药集
团上海化学试剂公司);其他化学试剂均为国产分析纯。
图 1　风轮菜
1.2　实验动物　清洁级 ICR雄性小鼠 , 体重 20 ～ 22g , 扬州
大学实验动物中心提供 ,合格证号:SCXK(苏)2007-0001。
1.3　实验仪器　Mini1240 型紫外可见分光光度计 , Shimadzu
公司;酶标仪 Multiskan Spectrum 1500-320 , Thermo Electrom
Corpo ration;5210 型超声水浴仪 , Branson 公司;SW22 型恒温
水浴仪 , Julabo公司;XT220A 型电子天平 , OHAUS 公司;SW-
CJ-IF超净台 ,苏州安泰空气技术有限公司;3111 型细胞培养
箱 , Thermo Electron Corporation;XSZ-D2 倒置显微镜 , 重庆光
学仪器厂;1-15K 低温离心机 , Sigma Corporation。
1.4　实验方法
1.4.1　风轮菜活性部位的制备:风轮菜用 80%乙醇回流提
取 3 次 ,合并提取液 , 减压浓缩 ,将浓缩液 , 依次用 3 倍量的石
油醚 、乙酸乙酯萃取 4 次 , 将乙酸乙酯提取物用大孔树脂进行
柱层析 , 水洗脱杂质后 , 乙醇梯度洗脱(洗脱范围为 20 ～
80%),收集乙醇洗脱液 , 减压浓缩干燥 , 得风轮菜活性部位
CCE(得率 1.56%)。采用紫外分光光度法 , 以 NaNO2 -Al
(NO 3)3-NaOH 显色测定 CCE 中总黄酮含量 , 以芦丁计 , 黄
酮类化合物的总含量为 63.5%。
1.4.2　CCE 清除 DPPH·自由基的作用:用 60%的乙醇配制
0.2mmol·L -1的 DPPH·溶液 , CCE 浓度分别设为 10、30 、60 、
90 、120mg· L-1。 取 2mL 不同浓度的 CCE 分别加入 2mL
DPPH·溶液中 , 摇匀后室温放置 30min。通过比色法检测反
应液在 517nm 处的吸光度 , 并计算药物的清除率 , 计算公式
为:清除率(%)=〔1-(A1-A2)/ A0〕×100 , 其中:A1 为不同
浓度 CCE 与 DPPH·溶液吸光度 , A2 为不同浓度 CCE 与 60%
乙醇溶液的吸光度 , A0 为 DPPH·溶液与蒸馏水的吸光度。
1.4.3　CCE 清除超氧阴离子(O -2)的作用:本文采用邻苯三
酚自氧化法体外诱发 O-2 , 检测 CCE 对 O-2 的清除作用。于
试管中分别加入不同浓度的 CCE 各 1mL、0.1mol·L-1 T ris-
HCl缓冲液(pH 8.2)4.5mL 及蒸馏水 3.2mL , 混匀后 25℃反
应 20min , 然后加入 45mmol·L-1的邻苯三酚 0.1mL , 迅速摇
匀反应 3min ,最后加入 10mmol·L-1盐酸终止反应 , 于 325nm
处测量其吸光度 , 并计算药物清除率 , 公式为:清除率(%)=
〔1-(A 1-A2)/A0〕×100 , 其中:A1 为不同浓度 CCE 的吸光
度 , A 2 为以水替代邻苯三酚时的吸光度 , A0 为以水替代 CCE
时的吸光度。
1.4.4　CCE 清除羟基自由基(·OH)的作用:Fenton 反应是体
外产生·OH 的经典体系 ,因此本文将其用于检测 CCE 对·OH
的清除作用。在试管中分别加入不同浓度的 CCE 、6mmol·
L-1的 FeSO4 溶液以及 6mmol·L-1的过氧化氢溶液各 1mL ,
摇匀后静置 10min , 再加入 6mmol·L-1的水杨酸溶液 1mL , 室
温反应 30min后在 510nm 处测量其吸光度 ,并计算药物清除
率 , 公式为:清除率(%)=〔1-(A 1-A 2)/A0〕×100 ,其中:A1
为不同浓度 CCE的吸光度 , A2 为以水替代水杨酸的吸光度 ,
A0 为以水替代 CCE的空白吸光度。
1.4.5　CCE对 Fe2+-VitC 诱导的小鼠肝脂质过氧化的影
响:将小鼠禁食过夜后 ,取肝脏用冰生理盐水制成 5%的肝匀
浆。取试管分别加入 5%的肝匀浆 1mL、不同浓度的 CCE 各
0.1mL(空白对照加蒸馏水), 再分别加入 50μL 的 FeSO 4·
7H2O和 VitC(终浓度均为 1mmol·L-1),混匀后 37℃振荡反
应 1.5h。取出反应液分别加入 10%的三氯乙酸 2mL 反应
5min , 然后加入 0.67%的硫代巴比妥酸 1mL ,混匀后沸水反
应 15min。反应结束后将反应液流水冷却 , 3500rpm 离心
5min , 取上清于 532nm 处测定吸光度 , 并计算丙二醛(MDA)
生成抑制率。
1.4.6　CCE 对高糖损伤的内皮细胞 LDH 和 SOD 活性的影
响:HUVECs 用 10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养。将细
胞随机分为 5组:正常组为 HUVECs 与 5.5mmol·L-1葡萄糖
共培养 、模型组为 HUVECs 与 33mmo l·L-1的葡萄糖共培养 ,
其余 3 组为 HUVECs 与CCE(3、10 、30mg·L-1)、33mmol·L-1
的葡萄糖共培养。共培养 72h 后 ,收集细胞上清液用于测定
LDH活性。同时 , 收集各组细胞 , 分别加入 100μL 细胞裂解
液(20mL 裂解液配制:40μL 0.5mol·L -1EDTA;4mL 10%
SDS;1m L 1mol·L-1 Tris-Hcl;14.96m L H2O , pH 6.8)冰浴裂
解 0.5h , 12000rmp 离心 10min , 取裂解液上清测定 SOD 活
性。每次实验设 3 个复孔 , 每个实验重复 4 次。
1.5　统计学处理　所有实验数据均以 x±s表示 , 采用 t 检
验进行组间比较 , P <0.05 认为有统计学差异。
2　实验结果
2.1　CCE 对 DPPH 自由基的清除作用　DPPH·是一种稳定
的有机自由基 , 常被用作体外测定药物的抗氧化活性。本实
验结果(见表 1), CCE 在 3 ～ 120mg·L-1的浓度下对 DPPH·
有明显的清除作用 , 且随剂量增加 , 抑制作用增加 , 其 IC50为
32.7mg·L-1 。
·18·
海峡药学　2012年　第 24卷 第 9期
表 1　CCE对 DPPH 清除作用的影响　(n=6)
组别 浓度/(mg·L -1) A517nm 清除率%
对照组 - 1.008±0.0009 -
CCE 3 0.968±0.001＊＊ 4.1
10 0.864±0.001＊＊ 21.9
30 0.706±0.001＊＊ 35.5
60 0.459±0.001＊＊ 58.2
90 0.302±0.001＊＊ 71.7
120 0.096±0.001＊＊ 92.0
注:＊＊P<0.01 ,与对照组相比
2.2　CCE 对 O-2 自由基的清除作用　O-2 自由基是活性氧
的一种 ,在体内由超氧化物歧化酶(SOD)清除 ,过量的 O-2 会
给机体造成损害(见表 2)。 CCE(3 ～ 120mg·L-1)对 O-2 自由
基的清除作用呈浓度依赖性 ,其 IC50为 28.6mg·L-1 。
表 2　CCE对清除 O -2 自由基的影响　(n=6)
组别 浓度/(mg·L -1) A325nm 清除率%
对照组 - 1.006±0.0005 -
CCE 3 0.991±0.001＊＊ 14.7
10 0.747±0.002＊＊ 35.0
30 0.651±0.001＊＊ 42.6
60 0.528±0.001＊＊ 53.8
90 0.384±0.001＊＊ 64.2
120 0.112±0.001＊＊ 90.7
注:＊＊P<0.01 ,与对照组相比
2.3　CCE 对·OH 自由基的清除作用　·OH 和 O -2 自由基是
活性氧中对机体最具损伤力的自由基 , 尤其是·OH。它能与
体内多种物质相互作用 ,导致细胞的氧化损伤。因此·OH 自
由基的清除率是反应药物抗氧化活性的临床应用的重要指标
(见表 3)。与空白对照组相比 , CCE(3 ～ 120mg·L-1)对·OH
具有显著的清除作用 ,且呈浓度依赖性 , IC50为 14.6mg·L-1 。
表 3　CCE对清除·OH 自由基的影响　(n=6)
组别 浓度/(mg·L -1) A510nm 清除率%
对照组 - 1.186±0.009 -
CCE 3 1.923±0.036＊＊ 23.2
10 1.517±0.007＊＊ 47.2
30 1.385±0.001＊＊ 55.3
60 1.136±0.001＊＊ 75.2
90 1.049±0.008＊＊ 81.7
120 0.993±0.001＊＊ 85.9
注:＊＊P<0.01 ,与对照组相比
2.4　CCE 对 Fe2+-VitC 诱导的小鼠肝脂质过氧化的抑制作
用　脂质过氧化是氧自由基损伤机体的重要方式之一 , 其主
要检测指标是 MDA的含量。肝脏是脂质过氧化反应较为敏
感的器官 , 因此本实验通过检测肝匀浆 MDA 含量来研究
CCE对脂质过氧化的抑制作用。 CCE(3 ～ 120mg·L -1)对
Fe2+-VitC 诱导的小鼠肝匀浆脂质过氧化有显著抑制作用 ,
且随剂量增加 , 抑制作用增加 , CCE 的 IC50为 37.1mg·L-1
(见表 4)。
表 4　CCE对 Fe2+-VitC诱导的小鼠肝脂质过氧化的影响　(n=6)
组别 浓度/(mg·L-1) A532nm
MDA
/(nmol·g -1)
抑制率/ %
对照组 - 0.466±0.002 5.60±0.033 -
CCE 3 0.329±0.003 3.59±0.041＊＊ 35.9
10 0.305±0.002 3.24±0.026＊＊ 42.2
30 0.289±0.002 3.00±0.026＊＊ 46.4
60 0.265±0.002 2.65±0.026＊＊ 52.7
90 0.233±0.002 2.18±0.029＊＊ 61.0
120 0.204±0.002 1.75±0.025＊＊ 68.6
注:＊＊P<0.01 ,与对照组相比
2.5　CCE 对高糖损伤 HUVECs 中 SOD和 LDH 活性的影响
　由图 5 可见 , 与正常组相比 , 高糖模型组内皮细胞中 SOD
活性明显减低(P <0.05), CCE 3mg·L-1组 SOD 活性较模型
组显著提高(P <0.05), CCE 10 、30mg·L-1组 SOD 活性极显
著提高(P <0.01)。结果表明 CCE 能通过增加胞内 SOD 活
性来抑制高糖引起的内皮细胞氧化损伤。
图 5　CCE对高糖损伤 HUVECs中 SOD 活性的影响
注:#P <0.05 ,与正常组比较;＊P <0.05 , ＊＊P <0.01 ,与模型
组比较。
图 6 所示 , 与正常组相比 ,高糖模型组细胞中 LDH 水平
极显著升高(P <0.01), CCE 3 、10、30mg·L -1组 LDH 水平较
模型组均极明显降低(P <0.01)。结果表明 , CCE 对高糖导
致的细胞膜氧化损伤具有明显的改善作用。
图 6　CCE对高糖损伤HUVECs中 LDH 活性的影响
注:##P<0.01 ,与正常组比较;＊＊P<0.01 ,与模型组比较。
·19·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 24 No.9 2012
3　讨论
O -2 、·OH 及 H2O 2等自由基是机体代谢过程中产生的中
间产物 ,当机体自由基清除机制紊乱时 , 过量自由基会与体内
某些生物大分子如蛋白质 、核酸 、脂质等发生反应 , 从而影响
细胞物质及能量的正常代谢〔6〕。目前研究表明 , 癌症 、糖尿
病 、衰老及免疫等多种疾病的病理机制均与体内氧化应激的
产生有关。许多有关天然抗氧化药物的研究表明 , 黄酮类物
质在体内和体外都具有较强的抗氧化性〔7〕, 而风轮菜活性部
位中富含黄酮类化合物 ,为其抗氧化活性提供了可能依据。
机体可通过 SOD、GSH-Px、POD等多种抗氧化酶来清除
体内自由基 ,其中 SOD常用于检测药物的体内外抗氧化活性
指标。它可以使体内脂质过氧化物转化为相应的醇 ,从而阻
断氧化反应。 LDH 是机体重要的能量代谢酶 , 其主要存在于
胞浆中 ,当机体自由基造成细胞膜损伤时 , 会被释放至细胞外
液中。因此 ,体外抗氧化实验中检测 LDH 可以反映出细胞的
氧化损伤程度。
本实验通过 Fe2+-VitC 诱导的小鼠肝匀浆脂质过氧化 、
Fenton 反应体系 、邻苯三酚法和 DPPH·自由基分光测定法 ,
检测 CCE 对 MDA生成 、·OH 自由基 、O-2 自由基及 DPPH 自
由基的抑制及清除作用。实验结果表明 CCE 能够明显抑制
由 Fe2+-VitC 诱导的小鼠肝匀浆脂质过氧化 , 降低 M DA 生
成 ,并能有效清除·OH 、O-2 及 DPPH 自由基 , 其中对比几种
自由基的 IC5 0表明 , CCE 对·OH 具有最强的清除效果 , 其
IC50仅为 14.6mg·L-1 。
本实验室前期研究表明 , 风轮菜具有降低血糖及内皮保
护的作用 , 同时 CCE 具有清除自由基的能力。为此 , 我们建
立高糖损伤的 HUVECs 模型 ,探讨 CCE 对高糖引发的内皮
细胞氧化应激损伤的保护作用。高血糖是导致糖尿病心血管
并发症的重要因素 , 其机制主要是高糖导致的机体产生氧化
应激〔8〕。对糖尿病人血清检测可以发现 ,其 SOD水平显著低
于正常水平 , 而 MDA 水平则显著高于正常水平〔9〕。本实验
结果表明 , CCE 能显著提高高糖刺激下内皮细胞损伤模型中
的 SOD 水平 ,说明其能通过调节体内抗氧化酶活性来降低机
体氧化应激水平。同时 , CCE 对细胞上清中 LDH 释放的显
著降低作用说明其能改善机体氧化应激对细胞膜的损伤 , 从
而达到内皮保护作用。
参考文献
〔1〕Nordberg J , Arner E.S.J.React ive oxygen species , ant ioxidan ts , and
the mammalian thioredoxin system〔J〕.Free Radic Biol Med , 2001 , 31
(11):1287-1312.
〔2〕Giugliano D , Ceriello A , Esposito K.Glucose metabolism and hyper-
glycemia〔J〕.Am J Clin Nut r , 2008 , 87(suppl):217-222.
〔3〕迟海东 ,路金才.风轮菜属药用植物研究进展〔J〕.沈阳药科大学
学报 , 2006 , 23(2):124-128.
〔4〕田冬娜 ,吴斐华 ,马世超 ,等.风轮菜乙醇提取物的降血糖作用及
其机制研究〔J〕.中国中药杂志 , 2008 , 33(11):1313-1316.
〔5〕吴斐华 ,田冬娜 ,刘洋 ,等.风轮菜乙醇提取物对血管内皮细胞的
保护作用研究〔J〕.时珍国医国药 , 2010 , 21(8):2074-2076.
〔6〕张德莉 ,朱圣姬 ,罗光富 ,等.自由基与 DNA氧化损伤的研究进展
〔J〕.三峡大学学报 , 2004 , 26(6):563-567.
〔7〕王姝梅.天然黄酮类化合物的抗氧化作用及构效关系〔J〕.海峡
药学 , 2004 , 16(3):10-13.
〔8〕Matough F.A , Budin S.B , Hamid Z.A , et al.The role of oxidat ive
st ress and antioxidants in diabetic com plications〔J〕.Sultan Qaboos U-
niv Med J , 2012 , 12(1):5-18.
〔9〕单春艳 ,郑少雄 ,陈莉明 ,等.2型糖尿病患者血清氧化应激指标水
平的改变〔J〕.实用糖尿病杂志 , 2005 , 2(2):14-17.
作者简介:张庆业 ,男(1979.4-)。毕业于广州中医药大学。职称:主管药师 ,硕士。从事中药药理及临床药学工作。联系电话:02036591293
通迅作者:唐洪梅 ,女(1970.1-)。毕业于广州中医药大学。职称:主任中药师 ,博士。从事中药新药开发工作。
基金项目:广州中医药大学科研创新基金(11CX027);广东省普通高校重点实验室中医病机与治法研究实验室开放课题(AAF110111A16)
六组肠易激综合征大鼠模型的建立及其症状学评价
张庆业 ,范丽霞 ,闫　雪 ,何嘉仑 ,廖小红 ,唐洪梅(广州中医药大学第一附属医院药学部 广州 510405)
摘要:目的　建立一系列肠易激综合征(IBS)的大鼠模型并作出症状学评价 ,选出优化模型。方法　应用 70只新生 SD 大鼠 ,随机分为 7组:
空白组 、母分组 、束缚组 、醋酸组 、母分+束缚组 、母分+醋酸组 、母分+束缚+醋酸组(简称三因素组),空白组不予干预 ,其余各模型组大鼠在出
生后的第 2天到 21天 ,每天接受不同影响因素的刺激;通过计算粪便点数的变化 、测量大鼠模型腹部回缩反射(AWR)情况来测评各组间肠易激
综合征大鼠模型的建设情况。结果　在不同模型组别的比较中 ,双因素组与三因素的腹泻症状 、肠敏感性增高等改变比单因素组较明显 ,多因
素组模型优于单因素组。结论　运用多种因素建立的大鼠动物模型能够全面地模拟肠易激综合征(IBS)患者的病理生理特征 , 多因素大鼠模
型总体模拟效果优于单因素大鼠模型。
关键词:肠易激综合征;大鼠模型;腹部回缩反射(AWR);症状学评价
中图分类号:R285.5　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2012)-09-0020-04
·20·
海峡药学　2012年　第 24卷 第 9期