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秦韶燕 ,戴玉杰＊ ,贾士儒 ,郭　伟 ,丁文杰 ,张　峰
(天津市工业微生物重点实验室 ,天津科技大学生物工程学院 ,天津 300457)
摘　要:采用离子交换色谱对发菜多糖进行分离纯化 ,对 OH-型和 Cl-型交换色谱对发菜多糖分离纯化效果进行初步
的比较 。离子交换色谱柱(Ф2.6×30),采用 DEAE-Celulose离子交换树脂和 NaCl梯度洗脱对发菜多糖进行纯化 。
使用 PeakFit4.12对色谱峰的峰高 、峰宽 、保留体积 、对称因子各参数进行比较 。选择一种分离纯化效果较好的离子交
换色谱类型 ,使用上样浓度为 1mg/mL(上样体积 50mL),分别采用 0～1mol/LNaCl、CH3COONa、NH4Cl溶液为洗脱剂 ,
洗脱流速为 1.0mL/min,比较三者洗脱效果 ,进而确定其最佳洗脱剂和洗脱浓度 。结果表明 , OH-型离子交换色谱对发
菜多糖有更好的分离纯化效果 , NaCl的洗脱效果更好 ,最佳洗脱浓度为 0.2mol/L。
关键词:洗脱剂 ,离子交换 ,纯化 ,发菜 ,多糖
EfectofdiferenttypesofDEAEceluloseresin,
elutionregentsandelutionmethodsonthepurification
ofextracelularpolysaccharidesofNostocflageliforme
QINShao-yan, DAIYu-jie＊ , JIAShi-ru, GUOWei, DINGWen-jie, ZHANGFeng
(TianjinKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology, SchoolofBioengineering,
TianjinUniversityofScience＆ Technology, Tianjin300457 , China)
Abstract:The isolation and purification ofpolysaccharide from Nostoc flageliforme by ion-exchange
chromatographywithDEAEcelulosewerestudied.Thecolumnofion-exchangechromatography(Ф2.6×30)was
packedwithDEAEceluloseanionion-exchangeresinandgradientelutedwithNaClsolutions.Thecontentofthe
polysaccharidewasdeterminedwiththephenol-sulfuricacidmethod.TheefectsofdiferenttypesofDEAE
celuloseresinontheseparationeficiencywereexaminedwith0.0 ～ 1.00mol/Lofgradientelution.PeakFit4.12
softwarewasemployedtocolectthechromatographicpeakdatasuchastheheight, width, retentionvolumeand
symmetryfactorofthepeaks.Theelutionvelocitywas1.0mL/min.ThesamplingrentelutionregentssuchasNaCl,
CH3COONaandNH4Clonseparationeficiencywereexamined.Itwasfoundthatthebestseparationeficiency
couldbeobtainedusingOH-typeofDEAEceluloseresinwithNaClastheelutionregent.Withthisregent, the
comparisonofgradientelutionwithequivalentelutionwasconductedandtheresultsshowedthattheseparation
eficiencyoftheequivalentelutionwasbeterthanthatofthegradientelution.Theoptimalelutionconcentrationwas
0.2mol/LNaCl.Thepolysaccharidewasfurtherpurifiedwithgelchromatography.
Keywords:elutionregents;ion-exchange;purification;Nostocflageliforme;polysaccharide
中图分类号:TS201.3　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2010)05-0252-04
收稿日期:2009-07-13　＊通讯联系人
作者简介:秦韶燕(1984-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:发酵工程。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20376061, 20776112)。
　　发菜(Nostocflageliforme)是一种具有独特功能
的可食用陆生经济蓝藻 ,主要分布在干旱半干旱地
区 ,为了适应极端环境 ,在自然生长过程中发菜分泌
一种胶质物质到胞外 ,以保护其细胞免受干旱和紫
外线伤害 ,其主要成分为多糖 。研究发现 ,发菜作为
一种生物资源 ,具有很多重要功能 ,例如改进土壤的
持水能力 、去除废水中的重金属 ,还可以作为食品添
加剂等 [1-3] 。对发菜多糖的结构进行研究发现 ,发菜
多糖为一种非硫酸化酸性多糖 ,由葡萄糖 、木糖 、半
乳糖 、甘露糖四种中性单糖和葡萄糖醛酸组成 [ 4 ] 。近
年来发现 ,发菜多糖对一些具封套的病毒如 I型单纯
疱疹病毒 、人巨细胞病毒和流感病毒等具有抗病毒
活性 ,并可杀死离体培养的肿瘤细胞 [ 5 ] 。另外 ,发菜
多糖还具有清除自由基活性 [ 6] ,因此 ,对发菜多糖进
行分离和纯化具有重要意义。离子交换法是一种常
用的多糖纯化方法。对于阴离子交换树脂 ,根据被
分离物质性质的不同 ,可采用不同型式的离子交换
树脂进行纯化 。对于 DEAE型离子交换树脂 ,在分
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2010.05.045
253　
离过程中很多研究都使用 Cl-树脂 ,以 NaCl为洗脱
剂做梯度洗脱纯化多糖。然而没有对不同型式树
脂 、不同洗脱剂以及不同洗脱方式对多糖纯化效果
进行比较。本文使用 DEAE-Celulose离子交换树脂
分离纯化发菜多糖 ,系统研究不同型式 、洗脱剂以及
不同洗脱方式对离子交换色谱纯化发菜多糖的影
响 ,以确定发菜多糖 DEAE离子交换色谱纯化最佳
工艺条件 ,为发菜多糖分离纯化过程进一步放大提
供基础数据 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
发菜多糖 　从液体悬浮培养液提取 [ 7 ]获得;
DEAE-Celulose纤维素树脂　上海有机化学研究所
实验厂;水　去离子水 ,使用前先加热煮沸以除去溶
解的气体;其余实验化学试剂　均为国产分析纯。
离子交换色谱柱(Ф2.6×30)　上海华美实验仪
器厂;BT00-100M蠕动泵　保定兰格恒流泵有限公
司;722光栅分光光度计　上海精密科学仪器有限公
司;TH-1000A梯度混合器　上海沪西分析仪器厂;
DBS-100全自动部份收集器 　上海沪西分析仪
器厂。
1.2　实验方法
1.2.1　样品处理　发菜液体悬浮培养液经超滤膜浓
缩后 ,加入无水乙醇醇沉 ,使溶液中乙醇终浓度为
80%(体积比), 4℃静止放置 24h,离心收集沉淀 ,干
燥后称重。用蒸馏水配制成 1mol/L多糖溶液 50mL,
待用。
1.2.2　装柱　将 DEAE-Celulose阴离子交换树脂经
预处理 [ 8]后 ,用 0.5mol/LNaOH浸泡树脂 30min,用
水洗至中性 , 为 OH-型阴离子交 换树脂;用
0.5mol/LHCl浸泡树脂 30min,用水洗至中性 ,为 Cl-
型阴离子交换树脂。把处理好的树脂分散于去离子
水中搅拌呈悬浮状并脱气 ,然后装柱 。
1.2.3　洗脱剂的选择　采用 1mol/LNaCl线性梯度
洗脱方式进行洗脱 ,来比较两种不同类型离子交换
树脂的纯化效果 ,选择一种分离效果好的离子交换
树脂 ,分别用 1mol/LNaCl、CH3COONa、NH4Cl进行
线性梯度洗脱 ,比较不同的洗脱剂的洗脱效果。以
时间为横坐标 ,以多糖含量为纵坐标 ,绘制多糖流出
曲线。
1.2.4　洗脱浓度的确定　分别用 0.1、 0.2、 0.3、0.4、
0.5、1mol/L洗脱剂进行等度洗脱。比较不同的洗脱
剂的洗脱效果。以时间为横坐标 ,以多糖含量为纵
坐标 ,绘制多糖流出曲线。
1.2.5　多糖含量的测定　苯酚-硫酸法 [ 9 ] 。
1.2.6　分离效果的评价　利用色谱峰的峰高 、峰宽 、
保留体积以及峰对称性几方面来考察色谱柱对多糖
的分离效果 。本实验采用 PeakFit4.12软件对色谱峰
进行处理 ,通过考察每个峰的不同参数来比较多糖
分离效果。峰形较好的色谱峰应该对称 、窄 、无前倾
及拖尾 ,在实际工作中 ,还要求保留体积越小越好 ,
节省人力和物力 。
峰高(peakheight, h)即峰的最高点至峰底的距
离 ,峰高值越大 ,各组分峰越容易分开 。另一种是半
(高)峰宽 W1/2(PeakWidthatHalfHeight),即在峰高
一半处的色谱峰的宽度 ,单位可用时间或距离表示。
在此以半峰宽作为比较参数。保留体积 (VR)
(Retentionvolume)为组分从进样到出现峰最大值所
需的洗脱液体积 。保留时间越短 ,说明需要的时间
越短 , 分离过程要尽可能短。拖尾因子 (tailing
factor, T)用以衡量色谱峰的对称性 ,也称为对称因子
(symmetryfactor)或不对称因子。正常色谱峰为对称
于峰尖的正态分布曲线 , 不正常的色谱峰有拖尾峰
和前伸峰 。无论是拖尾峰 ,还是前伸峰 ,都有可能造
成几个峰的重叠 ,分离的不够彻底 ,所以对称性也是
色谱柱分离效能评价很重要的指标。
2　结果与讨论
2.1　OH-与 Cl-型离子交换树脂分离效果比较
分别用 OH-与 Cl-型离子交换树脂装柱 , 以
1mg/mL多糖浓度(上样体积 50mL), 0～ 1mol/LNaCl
溶液线性梯度洗脱 ,洗脱流速为 1.0mL/min,用部分
收集器收集 ,结果如图 1。从图中可以看出 ,无论 Cl-
型和 OH-型离子交换树脂 ,发菜多糖都呈现一个吸
收峰 。采用 PeakFit4.12软件对色谱峰进行分峰处
理 ,得到峰的峰高 、半峰宽 、保留体积 、对称性等数值
见表 1 ,比较两种类型离子交换树脂的分离效果。
图 1　Cl-型和 OH-型离子交换树脂洗脱曲线
注:a为 Cl-型离子交换树脂洗脱曲线;
b为 OH-型离子交换树脂洗脱曲线。
表 1　OH-型和 Cl-型离子交换树脂洗脱曲线参数比较
峰高 半峰宽 保留体积 对称因子
Cl-型 0.812 128.30 430.00 2.38
OH-型 1.637 79.24 310.00 1.40
　　由表 1可以看出 , OH-型离子交换树脂洗脱曲线
较 Cl-型保留体积小 ,宽度窄 ,而且 OH-型离子交换
树脂洗脱曲线比 Cl-型离子交换树脂洗脱曲线最高
值大 ,对称性因子为 1.4,观察比较两个图流出曲线
也可以看出 , OH-型光滑度较好。因此在相同的纯
化条件下 , OH-型离子交换树脂对多糖的分离效果
要比 Cl-型离子交换树脂好 。
2.2　不同洗脱剂洗脱曲线比较
使用 OH-型离子交换树脂装柱 ,以 1mg/mL多糖
浓度(上样体积 50mL), 0～ 1mol/LNaCl, CH3COONa、
NH4Cl溶液线性梯度洗脱 ,洗脱流速为 1.0mL/min,
用部分收集器收集 ,结果如图 2。
　　采用 PeakFit4.12软件对色谱峰进行分峰处理 ,
得到峰的峰高 、半峰宽 、保留体积 、对称性等数值 ,比
较洗脱剂对离子交换树脂分离效果的影响 。
254　
图 2　CH3COONa和 NH4Cl洗脱曲线
注:a为 CH3COONa洗脱曲线;b为 NH4Cl洗脱曲线;
图 1(b)为 NaCl洗脱曲线。
表 2　NaCl、CH3COONa、NH4Cl洗脱曲线参数比较
峰高 半峰宽 保留体积 对称因子
NaCl 1.637 79.24 310 1.4
CH3COONa 1.173 124.25 340 2.51NH4Cl 0.323 172.05 460 1.63
　　由表 2看出 , NaCl、CH3COONa、NH4Cl洗脱曲线
中 , NaCl洗脱曲线的最高值最大 ,而且半峰宽最小 ,
保留体积也是最小 ,为 310mL。因此 ,采用 NaCl为洗
脱剂洗脱效果最佳 ,对称因子为 1.4。
2.3　NaCl最佳洗脱浓度的确定
洗脱剂浓度对多糖的分离效果具有重要影响 ,
传统的梯度洗脱仅仅是在分离的初级阶段 ,目的是
摸索洗脱条件。然而 ,在大规模分离纯化过程中 ,等
度洗脱更为方便 ,为了将来适应大规模分离纯化多
糖的需要 ,采取不同 NaCl洗脱浓度 ,进行等度洗脱 ,
以确定合适的洗脱剂浓度 。多糖浓度 1mg/mL,上样
体积 50mL,洗脱流速为 1.0mL/min,分别用 0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5、1mol/LNaCl进行等度洗脱 ,用部分收集
器收集。对洗脱曲线分峰处理后 , 各参数比较如
图 3。
图 3　不同浓度 NaCl洗脱曲线各参数比较
由图 3可以看出 ,在不同浓度 NaCl洗脱曲线中 ,
当 NaCl浓度为 0.2mol/L时 ,峰高最大 ,峰宽最窄 ,而
且对称因子也是最小的 ,保留体积也接近最小。综
合各参数比较 ,选择 NaCl浓度 0.2mol/L为最佳洗脱
浓度 ,既节省药品 ,又能方便后续透析操作。图 4为
NaCl浓度为 0.2mol/L时 , 发菜多糖的等度洗脱
曲线。
2.4　纯化后多糖纯度和蛋白含量测定
经过 OH-型离子交换树脂纯化发菜多糖 ,以
0.2mol/LNaCl洗脱 ,收集发菜多糖溶液装入 50mL
透析袋中 ,用 500mL去离子水透析 ,每 8h换一次水 ,
图 4　0.2mol/LNaCl等度洗脱曲线
透析 2d。透析后冷冻干燥 ,即为纯化多糖。分别配
制 0.25mg/mL的纯化后多糖溶液 ,采用苯酚-硫酸法
测定多糖的纯度 。并配制 1.0mg/mL纯化后多糖溶
液 ,用考马斯亮蓝染色法测定纯化后多糖中蛋白含
量 ,实验结果见表 3。
表 3　纯化前后多糖纯度和蛋白含量
DEAE-Cellulose树脂 多糖纯度(%)
蛋白含量
(μg/mL)
纯化前 31.9±0.11 14.551±0.14
纯化后 81.2±0.09 1.978±0.19
　　由表 3可见 ,纯化前后的发菜多糖纯度进行比
较 ,多糖的纯度由原来的 31.9%提高到 81.2%。蛋白
含量从原来的 14.551μg/mL降低到 1.978μg/mL,纯
化后多糖纯度明显提高 ,而且蛋白含量降低 。
3　结论
本研究考察了不同洗脱剂及不同洗脱方式和不
同型式的 DEAE离子交换树脂对纯化发菜多糖效果
的影响。结果表明:采用 OH-型离子交换色谱较 Cl-
型对发菜多糖有更好的分离纯化效果;NaCl作为洗
脱剂洗脱效果最好 ,通过不同浓度的 NaCl等度洗脱
实验 , 发现洗脱最佳浓度为 0.2mol/L, 粗多糖经
DEAE-Celulose纯化后 ,多糖的纯度由原来的 31.9%
提高到 81.02%。蛋白含量从原来的 14.551μg/mL降
低到 1.978μg/mL,这为发菜多糖离子交换色谱纯化工
艺的进一步扩大提供了基础数据 。
参考文献
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255　
　　　　
原　龙 ,范　泳 ,徐文芳
(西安工程大学环境与化学工程学院 ,陕西西安 710048)
摘　要:采用单因素实验和 L9(34)正交实验对绿茶中茶多糖的提取工艺进行了研究 ,研究了料水质量比 、浸提温度 、浸
提时间 、浸提次数对茶多糖提取的影响。结果表明 ,影响茶多糖得率的主次因素为:料水质量比 、浸提温度 、浸提次数 、
浸提时间;最佳提取工艺条件为:料水质量比为 1∶25 ,提取温度 85℃,提取时间为 90min,提取 1次 。在此最佳工艺条
件下 ,茶多糖得率为 1.92%。
关键词:茶多糖 ,提取工艺 ,优化
Optimizationofextractionprocessofpolysaccharidefromgreentea
YUANLong, FANYong, XUWen-fang
(SchoolofEnvironmentandChemicalEngineering, Xi anPolytechnicUniversity, Xi an710048 , China)
Abstract:UsingthemethodsofsinglefactortestandorthogonaltestofL9 (34 )tostudytheextractionof
polysaccharide.Theefectsofproportionbetweenwaterandmaterial, extractiontemperature, extractiontimeand
extractiontimesonpolysaccharideyieldwerestudied.Theresultsshowedthatthemainfactorswereproportionof
waterandmaterial, extractiontemperature, extractiontimeandextractiontimes.Theoptimalextractionconditions
wereproportionofwaterandmaterial1∶25 , extractiontemperature85℃, extractiontime90min, extractonce.Under
theseconditions, thefinalpolysaccharideyieldwas1.92%.
Keywords:polysaccharide;extractionprocess;optimize
中图分类号:TS272.5+1　　　　文献标识码:B　　　　文 章编 号:1002-0306(2010)05-0255-02
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146-150.
　　茶多糖是一类从茶叶中提取出来的多糖类化合
物 ,具有增强免疫力 、降血脂 、降血糖 、抗辐射 、抗凝
血 、抗血栓等功效 ,具有多种药理作用 ,且原料很丰
富 ,开发前景非常广阔 [ 1-3] 。茶多糖为水溶性 ,易溶
于水 ,不溶于高浓度有机溶剂 ,高温下易丧失活性 ,
过酸或偏碱性均会使多糖部分降解 [ 4] 。本文以普通
绿茶为原料 ,采用热水浸提法 ,应用单因素实验及正
交设计对茶多糖的分离提取条件进行了优化 ,为今
后工业化生产提供了有效的理论根据 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
95%乙醇 、乙酸乙酯 、3%三氯乙酸等　均为分
析纯试剂;绿茶　为西安市售普通绿茶。
紫外可见分光光度计　岛津 2450;5810真空冷
冻离心机　eppendorf型;DK-98-1型恒温水浴箱 。
1.2　实验方法
1.2.1　茶多糖提取工艺流程　称取茶叶 5g※粉碎(200
　　　
收稿日期:2009-07-17
作者简介:原龙(1972-),男 ,硕士 ,讲师 ,研究方向:生物提取和发酵。
目)※水浸提 90min※纱布过滤※离心(4000r/min, 15min)※
取上清液于 250mL锥形瓶※三氯乙酸法去除蛋白 [ 5] ※离心
(4000r/min, 15min)※乙酸乙酯萃取法除茶多酚 [ 6]※ 95%乙
醇沉淀离心(2次)※冷冻干燥※茶多糖
1.2.2　测定方法 　采用苯酚 -硫酸法测定多糖的
含量 [ 7] 。
2　结果与讨论
2.1　料水质量比的选择
在 80℃下浸提 90min,料水质量比的选择分别为
1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25,茶多糖得率如图 1。
图 1　料水质量比对茶多糖得率的影响
由图 1可知 ,在料水质量比为 1∶5～1∶20时 ,随着