全 文 ：2011 年 9 月
第 31 卷 第 9 期
基础医学与临床
Basic ＆ Clinical Medicine
September 2011
Vol． 31 No． 9
收稿日期:2010 － 05 － 17 修回日期:2010 － 11 － 29
基金项目:国家自然科学基金(30070702) ;海南省自然科学基金指导性计划(80570)
* 通信作者(corresponding author):yaoruan@ sina． com
文章编号:1001 -6325(2011)09 -1036 -04 技术与方法
重阳木花粉过敏原的分离、纯化和鉴定
姚 敏1* ，刘志刚2，孟 光1，孔小丽2
(1. 海口市人民医院 检验科，海南 海口 570208;2. 深圳大学 过敏反应与免疫学研究所，广东 深圳 518060)
摘要:目的 对重阳木花粉变应原蛋白进行分离、纯化和鉴定。方法 采用 Cocas 液提取重阳木花粉的粗提液，通
过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白质组分，并测定其分子质量;收集过敏患者
血清，用 Western blot法鉴定其变应原成分;通过离子交换层析对重阳木花粉变应原进行初步纯化和免疫印迹鉴
定。结果 分离得到重阳木花粉 18 条蛋白带，其中分子质量为 12 和 14 ku的是重阳木花粉的特异性变应原，通过
离子交换柱层析方法纯化得到其相应的纯化蛋白。结论 对重阳木花粉变应原进行了初步的分离、纯化和鉴定，为
临床重阳木花粉过敏疾病的诊断和治疗奠定了基础。
关键词:重阳木花粉;变应原;离子交换柱层析
中图分类号:R 392. 12 文献标志码:A
Separation，purification and identification of allergen from Bischofia polycarpa pollen
YAO Min1* ，LIU Zhi-gang2，MENG Guang1，KONG Xiao-li2
(1. Dept． of Clinical Laboratory，Peoples Hospital of Haikou City，Haikou 570208;2. Allergy and Immunology Institule，School of Medicine，
Shenzhen University，Shenzhen 518060，China
Abstract:Objective To purify and characterize the pollen allergens isolated from Bischofia polycarpa pollen．
Methods Pollen extract from Bischofia polycarpa was prepared and analyzed by SDS-PAGE． Antigenic properties
of the separated proteins were analyzed by Western blot． Ion-exchange chromatography was used for the purification
of the antigens． Then purified products were characterized by Western blot． Results For the pollen extract of
Bischofia polycarpa，18 protein bands was found in SDS-PAGE． Two of these protein bands，with a molecular
weight of 12 and 14 ku，showed immunoreactivity with IgE from sera of Bischofia polycarpa pollen allergic patients．
After the ion-exchange chromatography we got the purified protein． Conclusion Pollen allergens in Bischofia poly-
carpa pollen were purified and characterized． The result will provide a basis for the diagnosis and treatment of
Bischofia polycarpa pollen related allergy．
Key words:Bischofia polycarpa pollen;allergen;ion-exchange chromatography
重阳木(Bischofia polycarpa) ，别名乌杨、枫杨、
赤木等，为大戟科重阳木属，是一种热带、亚热带常
见植物，在我国主要分布于华南地区。树姿高大雄
伟，甚为壮观，多作为行道树被广泛栽培，成为绿化
美化的首选树种，也是华南地区引起花粉症的主要
过敏原［1 － 2］。为了进一步探讨该花粉中的致敏成
DOI:10.16352/j.issn.1001-6325.2011.09.008
姚敏 重阳木花粉过敏原的分离、纯化和鉴定
分，本研究通过 SDS-PAGE、Western blot和离子交换
层析等方法对该花粉的变应原进行分离、鉴定，旨在
为重阳木花粉过敏的诊断和免疫学治疗提供基础资
料。
1 材料与方法
1. 1 材料来源
重阳木花粉采集自海口市区公园，患者血清均
来自海口市人民医院耳鼻喉科门诊就诊患者，经点
刺试验证实为重阳木花粉过敏者。所有患者均填写
知情同意书。
1. 2 主要试剂
丙烯酰胺(Acr) (BBI) ;十二烷基硫酸钠(SDS)
(Bio-Rad公司) ;亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵
(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷
(Tris)、联苯二胺(DAB) (Amresco 公司) ;上样缓冲
体系、蛋白 Marker和预染蛋白 Marker(MBI Fermentas
公司) ;生物素标记的 IgE二抗、辣根过氧化物酶标记
的亲和素(链霉亲和素) (Kirkegaard ＆ Perry Aborato-
ries公司) ;DEAE-Cellulose DE-52(Amersham Pharma-
cia公司)。其余均为国产分析纯试剂。
1. 3 花粉粗提液的提取
在花开季节采集重阳木花粉，9 号分样筛过筛，
自然干燥，按 Cocas 液常规提取［3］:取花粉于液氮
中充分研磨，按 1∶ 3 的比例用丙酮 4℃浸泡去脂至
上清澄清。去丙酮，干燥后称取 5 g，以 1∶ 20 比例加
入 Cocas液(NaCl 5. 0 g，NaHCO3 2. 75 g，结晶酚 4 g
加蒸馏水至 1 000 mL，pH 8. 2)100 mL，搅拌提取
72 h，静置 0. 5 h 后，上清液对蒸馏水透析，冷冻干
燥浓缩，使样品终浓度为 10 mg /L，以上操作均在
4 ℃进行。
1. 4 花粉粗提液中变应原的分离
采用 SDS-PAGE体系［4］对重阳木花粉粗提液变
应原进行分离。分离胶 12%和浓缩胶 5%对花粉粗
提液中的蛋白组分进行电泳分离，电泳凝胶用考马
斯亮蓝 R-250 染色液染色，并进行蛋白浓度的测
定。
1. 5 花粉粗变应原的免疫学特性鉴定
用 10 份对重阳木花粉过敏患者的血清，采用
Western blot方法对花粉变应原进行免疫学特性鉴
定，具体步骤如下: (1)用 Bio-Rad 转移槽将凝胶中
的蛋白条带转移至硝酸纤维膜上; (2)用 TBS 洗涤
硝酸纤维膜 2 次，每次 5 min; (3)将膜用 1% BSA
封闭液封闭(4 ℃过夜) ; (4)用含 0. 05% Tween20
TBST洗膜 3 次，每次 5 min; (5)加过敏者阳性血清
(用 1% BSA-TBST进行 1 ∶ 9 稀释) ，37 ℃孵育2 h;
(6)同上洗膜 3 次后，加入 1∶ 1 000 倍稀释的生物素
标记的 IgE二抗，室温孵育 2 h; (7)同上洗膜 3 次
后，加入 1∶ 1 000 倍稀释的链酶亲和素-HRP，室温孵
育 2 h; (8)同上洗膜 5 次，DAB(3，3-二氨基联苯
胺)显色，摄像后分析其相对分子质量，该实验重复
3 次。
1. 6 粗提液的离子交换柱层析与检测
花粉粗提液对 0. 02 mol /L Tris-HCl(pH 7. 2)缓
冲液透析 24 h后，进行 DEAE-Cellulose DE-52离子交
换柱层析。以 0. 02 mol /L(pH 7. 2)的 Tris-HCl 缓冲
液充分平衡，透析后花粉粗提液经 0. 45 μm滤膜过滤
后上样，待穿透峰后的基线走平后，改用洗脱缓冲液
(0. 5 mol /L NaCl，0. 02 mol /L Tris-HCl)进行线性离
子梯度洗脱，流速 2 mL /min，时间 80 min，自动收集
器收集各峰液。用 0. 02 mol /L Tris-HCl 缓冲液
(pH 7. 2)透析除盐，冷冻干燥，干燥样品溶于少量缓
冲液中，使样品终浓度为 0. 02 g /L。采用 Western
blot方法确定各峰收集液中蛋白的免疫活性部分。
2 结果
2. 1 花粉粗浸液的 SDS-PAGE
重阳木花粉主要有 18 条深浅不一的蛋白区带，
在 25 ～ 35 ku 和 14 ku 以下的区带蛋白含量最丰富
(图 1)。
图 1 花粉粗提液 SDS-PAGE图
Fig 1 SDS-PAGE analysis of pollen extract
(Coomassie brilliant blue stain)
M. standard molecular weight markers;1. SDS-
PAGE analysis of Bischofia polycarpa pollen
extract
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2. 2 花粉特异性变应原鉴定
重阳木花粉提取液中可与过敏性患者血清 IgE
结合反应阳性的蛋白质分子质量分别为 12 和 14ku
(图 2)。
图 2 重阳木花粉免疫印迹图谱
Fig 2 Western blot of Bischofia polycarpa
pollen extract
M. standard molecular weight markers;1 ～ 10. IgE im-
munoblots of sera from 10 Bischofia polycarpa pollen al-
lergic patients
2. 3 花粉变应原的离子交换柱层析
重阳木花粉粗浸液离子交换柱层析结果显示，
花粉主要有 4 个蛋白峰(图 3)。
图 3 重阳木花粉粗提液离子交换层析图
Fig 3 Chromatogram of partially purified Bischofia
polycarpa pollen extract on DE-52 column
2. 4 SDS-PAGE和Western blot结果
重阳木花粉粗提液经离子交换柱层析后，蛋白
主要分布在 I 峰、II峰中(图 4) ，免疫印迹的结果显
示(图 5) ，相对分子质量约为 12 和 14 ku 的蛋白质
能与过敏患者血清 IgE结合，为主要变应原组分，分
布在第 II峰中。
3 讨论
花粉症是敏感个体对花粉的一种超敏反应。机
体首次接触花粉过敏原，体内产生 IgE 抗体，结合于
肥大细胞和嗜碱性粒细胞，再次接触时，花粉过敏原
与上述细胞表面两个或两个以上的临近 IgE 分子搭
桥结合，导致肥大细胞脱颗粒释放生物活性介质，引
起鼻黏膜、眼结膜和支气管炎性反应，甚至哮喘发
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姚敏 重阳木花粉过敏原的分离、纯化和鉴定
作。1990 ～ 2000 年我国城市儿童哮喘的患病率从
0. 11% ～ 2. 09%上升到 0. 12% ～ 3. 34%［1］。在西
方国家，由花粉引起的过敏症发病率高达 30%［5］。
海南省是我国唯一位于热带地区的省份，该地
区热带植物种类繁多，四季开花不断，空气中热带植
物花粉含量多，临床过敏性疾病患者较多。海口地
区热带植物花粉致敏性中发现，重阳木花粉阳性率
为 55. 2%(276 /500)［6］，由于重阳木花期长、花粉产
量大、花粉轻以及易飘散远方，因此具有很大的过敏
潜能。据世界卫生组织(WHO)以及世界著名的变
应原公司(如 ALK公司、默克公司)提供用于过敏性
疾病诊断的变应原目录中(约 400 ～ 500 种) ，目前
尚未有热带地区气传致敏花粉变应原，同时也未见
热带地区气传致敏花粉的相关研究报道。由于空气
中花粉飘散种类、数量及季节布规律与其所处的地
理位置有着密切的联系［7 － 9］，因此，研究用产自本土
的过敏原来诊断并治疗本地所患过敏性疾病也显得
尤为重要［10］。
目前，国内花粉浸液在进行临床诊断和治疗时
都存在不足，主要是由于花粉粗提液中含有多种蛋
白成分，其中包含主要、次要变应原以及其他一些非
变应原蛋白。本研究通过对重阳木花粉粗提液的制
备，对重阳木花粉变应原进行了初步的分离、纯化和
鉴定，后期将继续将对本实验 DE-5 柱层析所获的
第Ⅱ峰进一步纯化，为进一步开展热带植物花粉过
敏性疾病实验室检测方法的建立奠定基础。
参考文献:
［1］何韶衡，刘志刚．基础过敏反应学［M］． 北京:科学出版
社，2009，535 － 544．
［2］姚敏，孟光，刘志刚，等． 重阳木花粉相关变应原 profilin
基因的克隆、表达及免疫学鉴定［J］．现代免疫学，2008，
28:385 － 388．
［3］乔秉善．变态反应学实验技术［M］．第 2 版．北京:中国
协和医科大学出版社，2002:47 － 223．
［4］郭晓君． 蛋白电泳试验技术［M］． 北京:科学出版社，
1999:123 － 145．
［5］ Vieths S，Scheurer S，Ballmer-Weber B． Current under-
standing of cross reactivity of food allergens an pollen［J］．
Ann N YAcad Sci，2002，964:47 － 68．
［6］孟光，李春林，蔡琼香，等． 海口地区热带植物花粉致敏
性调查［J］． 临床耳鼻咽喉科杂志，2005，19:1044 －
1045．
［7］ Singh AB，Kumar P． Aeroallergens in clinical practice of
allergy in India． An overview［J］． Ann Agric Environ Med，
2003，10，131 － 136．
［8］Singh AB，Kumar P． Common environmental allergens cau-
sing respiratory allergy in India［J］． Indian J Pediatr，
2002，69:245 － 250．
［9］Boral D，Chatterjee S，Bhattacharya K． The occurrence and
allergising potential of airborne pollen in West Bengal，Indi-
a［J］． Ann Agric Environ Med，2004，11:45 － 52．
［10］Swoboda I，De Weerd N，Bhalla PL，et al． Mutants of the
major ryegrass pollen allergen，Lol p 5，with reduced IgE-
binding capacity:candidates for grass pollen-specific im-
munotherapy［J］． Eur J Immunol，2002，32:270 － 273．
9301