全 文 ：遗 传 学 报 , 1 5 ( 1 ) : 4 0一呼5 , 1 9 8 8
润匕细 G . ” 时“ 目时“
用 5 1 核酸酶作图法侧定蓖麻蚕 18 5 r R N A
基因的5’ 端位置 ,
郑仲承 曹萍 钱肖贞 李载平
(中国科学院上海生物化学研究所 )
测定墓因 , ’ 端位置是研究基因转录调控的一个重要前提 。 本文将蓖麻蚕 1 8 5 rR N^ 基
因 ND A 的 5
’ 端用 ’ , P 标记 , 然后与 1 85 rR N人 杂交 , 再用 sl 核酸酶水解掉非杂交区的 洲 A
和 R N人 。 分析放射自显影的结果 , 测出 18 5 r R N 人 基因 5` 端的位置。 在 185 rR N^ 基因的
B ,I 1
: 位点向 石七。 kI , 方向延伸约 2 2 o b p 处 ,从这一结果 , 可知道蓖麻蚕 r R N A 基因的转录方
向是 5 ’ coE 双I r一 glB l l : 3` o关. 词 : 蓖麻蚕 , rR N A 基因 , sl 核酸酶作图法 , 18 5 rR N A S ’ 末端 , 基因转录方向
对 r R N A 基 因转录的研究有助于了解真核生物基因表达的调节控制。 我们以蓖麻
蚕 r R N A 基因为对象 ,在以前工作。 一 3J的基础上 , 着重在 D N A 一级结构水平上剖析这
个墓因 , 了解转录启动子的位置及其顺序 ,与初级转导物加工有关的信号顺序和与基因表
达有关的调控元件。 作为一个基础性工作 , 必须先确定 18 5 r R N A 基因 5’ 末端的位置
和确定这一基因的转录方向。
M
a n n i n g 等人田曾用 ” P 标记的 与 1 8 5 r R N A 3 ’ 末 端 互补的 e D N A 作 探针 , 与
r R N A 基因的限制性内切酶片段杂交 , 测定了家蚕 r R N A 基因转录方向。 在这个方法
中 , 要用反转录酶制备 c D N A , 对所得结果的分析也较为麻烦。 我们就试图用纯 化 的
18 5
、
28 5 和 5 . 8 5 : R N A 作探针 ,分别与 r R N A 基因的限制片段杂交来确定这些基 因
的定位 , 并认定基因转录方向【光 但实践证明 , 5 . 8 5 r R N A 需由 28 5 r R N A 变性释放
出来 , 它分子小 , 含量少 , 难以纯化 , 杂交后显影带弱 , 易造成假象。 通过对 5 . 8 5 r R N A
基因顺序的测定闭确定前文 f3] 报告的 , . 8 5 r R N A 基因定位就是这一假象造成的 , 为此我
们用更为精确的 5 1核酸酶作图法切测定了 18 5 r RN A 的 5’ 末端的位置 , 同时进一步确
定了这一基因的转录方向 。
材 料 与 方 法
(一 ) r R N A 签因 ( r D N A )
按照蓖麻蚕 r D N A 的限制性内切酶酶切图谱氏习以及初步定位 slI 的结果 , 制备了包
括有 1 8 5 r D N A 的 3 ` 或 5 ` 端的两个 r D N A 次 级 克隆 p A R P : E : 和 p A R p : E , (图 1 ) 。
, D N A 的克隆和质拉 D N A 抽提方法与前文相同以 , ]。 限制性内切酶和 D N A 连接酶 由
本文于 19 8 6 年 1 1月 2 9 日收到 。
. 国家自然科学塞金资助的课且 。
1 期 郑仲承等: 用 s1 核酸酶作口法测定蓖寐蚕 18s R rN A 基困的 5’ 端位里 峥盈
18 5 8 25
r气 -一 , , r ~ 尸 - 一 丫 ,
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图 1 蓖麻蚕 r D N A 限制性内切酶圈谱和 p A R P : E : , p A R P : E : 次级克隆和探针制备
A
. 限制酶图谱表示 1 8 5 和 2 8 5 r R N A 荃因大致定位 ; B . p A R P : E : 与 , A R P : E : 次级克隆 ;
C
. 探针 1 ( P, E , ) 与 m ( B g , E, ) 的制备 , 可见到两条互补链中分别有一条的 , ’ 劝被标记 ; .D
标记探针的自显影图 ,箭头所示片段 “ 、 川 , 自扭胶中洗脱出来 。
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1 R e s t r i c t i o n m a p o f r D N A a n d ht e p r e P a r a t i o n o f P A R P
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T h e l o c a t i o n o f 18 5 a n d 2 8 5 r R N A c o d i n g . e q u e n c一 ; B . p A R P: E: a n d p A R P: 乌
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S : S口 11. E : 肠o R I .
4 2 遗 传 学 报 1 5卷
本室工具酶组制备。
(二 ) r D N A 的末端标记
用 1 一” p 一A T p 。 分别标记 p A R P :Et 中的 p :瓦 片段和 p A R P :E :中的 B g :E :的 5` 末
端 【` , , 探针制备的具体方法见正文与图 o2
(三 ) 杂交反应
一端标记的 D N A 探针溶解在 80 肠 甲酞胺 ( 1 0 m M T isr 一 H cl , p H ~ 6 . , 、 4 0 m杯
aN C I
、 1 m M E D T A )中。 测定 c pm 后以每 2 0 0 0 0一 1 0 0 0 0 0 c pm 为一份 , 分成若干份。 对
照组不加 r R N A ,实验组则加人 50 一 10 拼 9 r R N A 。 总反应体积为 30 八 反应混合物先
在 90 ℃加热 15 分钟 , 然后在 ” ℃杂交 16 一 20 小时。
(四 ) 5 1 核破曲醉讼
对照组在保温后立即加人酒精沉淀 D N oA 实验组则加人 2 70 川冷的 5 1酶缓冲液
( s e m M N
a 0 A ` , 声 ~ 4 . 0 、 5 0 m M N a CI 、 6 m M Z n S .O ) 加人 5 1核酸酶 ( B o e h r i n g e r )
1 50 单位一 10 0 0 单位 , 37 ℃反应 1 小时 , 然后用酒精沉淀。 D N A 沉淀在用酒精洗涤干澡
后溶于 90 多甲酞胺一 0 . 03 拓澳酚蓝后 , 在琼脂糖电泳中展开 , 并对 x 一片作放射自显影 。
结 果 与 讨 论
(一 ) 用 5 1核酸酶田讼法测定甚因 S’ 端与转录方向的原理
按照以前的研究结果。 一 31 我们知道 1 8 5 r R N A 基因定位在 r D N A 的 P :一 E : 片段上面 , 因此分别构建了 p A R P I E : 与 p A R P王 : 两个 r D N A 的次级克隆。 它们应该 分
别含有 1 8 5 r R N A 基因的 5 , 或 3 , 末端。
因为事先我们不能确定 5’ 末端与 3’ 末端的所在 , 所以末端测定就需与转录方向测定
同时进行。 分别将这两个次级克隆 当中的双链片段中一条链的 5` 末端用 ’孕 标记 (图 1 ) 。
当然 , 这两条链中只有一条是我们所要确定的有意义链。 如图 1 所示 , p A R IP E : 的片段
1 中下面一条链 5’ 端被标记 , 而 p A R PI 乌 片段 n l 中上面一条链 5 ’ 端被标记 , 这样就构
成了两个来自不同的互补链 , 又都只是一端 ( 5’ 端 ) 被标记的杂交探针。
接着将这两个探针分别与 18 5 r R N A 杂交 (图 2 )。 如图 2 , B所示 , 如果基因转录
方向由 P :一 E : , 则 18 5 rR N A 的极性 ( 5’ , 3’) 与图中双链 D N A 的 上面 一条链相同 , 即下面一条链是有意义链。 所以 , 18 5 r R N A 只与下面一条链杂交。 这样 , 18 5
r R N A 与片段 11 (来自 PA R P: E : 的下面一条链 ) 和片段 111 (来自 p A R P : E J 的下面一条
链 ) 分别杂交。 经 5 1核酸酶水解后 , 与片段 n 形成的杂种保留了末端的 ’平 , 因此有放
射自显影区带 , 而与片段 1 1杂交形成的杂种因为片段 1 1下面一条链是非标记片段 ,所以
无自显影区带 。 相反 , 如果基因转录方向是由 E :一 P: , 则结果与上述的相反 , 即 1 8 5r RN A 与 n 杂交时无自显影区带 , 与 1 1杂交时有自显影区带。 这样就可以测出基因的
转录方向。 而与此同时 , 根据 自显影区带的分子量大小可以知道 18 5 r R N A 基 因 5’ 末
端与已知的限制性内切酶切点之间的距离有多少 , 从而可以测出 18 5 r R N A 基 因 5’ 端
的位置。
l) 丫一 ” p 一人 T P ( 3 0 0 0 C il m M ) 来自 A m e r比 。二 公司 ,碱性磷酸酮酶和多核昔酸激酶均购自 B R L 公司 .
期 郑仲承等 : 用 sI 核酸酶作图法测定蓖麻蚕 18 5r RN A 基因的 , ’ 端位里
七, n s e r i洲 o n d卜ce U.
转录方向
七
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与 r RN A 杂交
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多摆泣影 聋
放射自显影
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图 2 用 5 1 核酸醉图谱法侧定 t D N A 转录方向
A
· 转录方向有两种可倪性 ; B . 测定的两种可能结果 。
班 x . 2 D e t e r m i n i n g t h e r D N A t r a n o c r i p t in g d i r e c t i o n b y 5 1 n u e l e a . e m a p p i n 琢
A
.
T w o p o s * i b il i t i . s o f t h e t r a n 一e r i P t i n g d i r e e t i o n ; B . T 份 0 p o s s i b l e r e . u l t s
一 r R N A ; . - , ; P l a b e l l e d e n d .
(二 ) 测定结果
测定结果如图 3 所示。 由图 3 可以看出 , 18 5 r R N A 与 B g再: (即片段 m ) 杂交时才
显示 出自显影区带 , 而与 lP 瓦 (即片段 11) 杂交时不显示任何区带 , 这说明蓖麻蚕 r D N A
的转录方向应该是由 E :一 P l 。 由标准分子量作图推算出 1 8 5 rR N A 基 因 的 5’ 端在
B g l l l
:一cE o R I: 片段内 ,即它位于 B gl l l : 向 cE o R I: 方向延伸大约 2 2 0 b p 处 (图 4 , A ) ,从而确定了 18 5 r R N A 基因 5’ 端的位点。
当然也可与 28 5 r R N A 杂交来测转录方 向 , 即 将含 28 5 r R N A 基 因的 E :几 和
S P
: 片段 (见图 l) 分别按上述方法标记 , 分离片段后与 28 5 r R N A 杂交。 我们用此技术
测出的基因转录方向与本文相同 。 当然若用 3’ 末端标记时则可测定 3’ 端定位 。
我们试用了不同量的 5 1核酸酶 , 所得结果是一致的 , 但当 5 1酶用量为 1 0 0 0 单位
时 ,被 5 1酶保护的片段略小 (图 3 ) 。 可能少量双链 D N A 亦被水解了 。
我们认为用 r R N A 与 r D N A 进行分子杂交 , 然后以 5 1 核酸酶来处理 , 这个方法既
可测 r R N A 基因 3’ 或 5’ 端定位 , 同时又可以确定基因的转录方向。 尤其对转录方 向测
. .
。 遗 传 学 报 巧 卷
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. 圈 3 , D N A 的 5 1 核酸醉图诊
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。 片段 11 ( p 一几 ) + r R N A ; 2一 4 . 片段 I (I P : E一) + r R N ^ + S一; 5 . 片段 111伊` * E, )+ r R N A ,
`一 8 . 片段 111 ( B g禹 ) + r R N A + S笼
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.
5 1 醉用 t 为 10 00 单位 ; 3, 7 . 5 1 阵用 t 为 50 。 单位 ; 4 , 8 · 5 1 曲用 t 为 15 0 单位。
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F r 一 I m e o t 11( P : tE ) + r R N A 一 2一 4 . F r . g . e n t l城p . tE ) + r R N A + 5 1 , , · F r . g口 e n t
111( B g禹 ) + r皿 N为 6一 8 . F r a g m e . t 】】I ( B g : E, ) + r R N A + 5 1 .
2声· 5 1 o u e l e。 一。 , 10 0 0 u 一 3一7 · 5 1 n u c l e二 e , 5 0 o u ; 4 , 8· 5 1 o u c l .一 , 1 5 0`
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18 5 r D N A
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5名 5 18 5 28 5 6 . 8 5 18 5 湘 S 5刀 S
圈 4 18 S r D N A r 幼定位和 r D N A 定位圈
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.
1 8 5 r D N A 犷 末端的定位 ; B . 1 8 5 、 2 8 5 与 5 . 8 5 r D N A 的定位图 .
F i` 。 ` L o e 一t i o n o f s , e n d o f 1 85 r D N A a dn 比 e l o e . t i o n 一 o f r D N A
A
.
T 卜e l o e 一t i o n o f s ’ e n d o f 18 5 r D N A ; .B T 卜e ol c a t i o n 一 o f 1 85 , 2 8 5 a n d , . 8 5 r D N A .
定来说 , 本方法是有明显优点的。 因为它操作简便 ,专一性强 , 结果明确 ;此外只需同时作
两个片段标记与分离。 与以前采用的 r R N A 分离 、标记 、 与 r D N A 限制片段杂交 , 及其
l期 郑仲承等 : 用 s1 核酸酶作图法测定蓖麻蚕 1 85R rNA基因的 5’ 端位 t 心,
分析杂交结果的方法相比 , 在简便性准确性方面是十分明显的。 本文的结果与我们后来
进行的 5 . 8 5 r RN A 基因顺序测定结果阅 完全一致 , 更说明本文基因转录方向的正确性。
因此本文纠正了前文 ls1 中对 , . 8 5定位中的差误。
通过本文的工作 , 确定了蓖麻蚕 18 5 r R N A 基因 5’ 端和 r R N人 基因的转录方向 ,
为进一步确定 E T S 区 、 N T S 区和确定与转录调控有关的顺序 , 从而为研究 r R N A 基
因的调控打下了基础。
参 考 文 献
[ 1 1 郑仲承等 : 1 98 1。 遗传学报 , 8 ( 3 ) : 2 0 3一 2 1 1。
[ 2 ] 吴祥甫等 : 19 8 3 . 遗传学报 , 10 ( 6 ) : 4 2 3一 4 2 8 0
[ 3 ] 郑仲承等 : 19 8 3 . 遗传学报 , l叹 5 ) : 3 3 3一 34 0 0
[ 弓 ] 窦少波等 : 1 9 8 7。 生物化学与生物物理学报 , 19 ( 5 ) : 3 7 3一 3 8 1。
[ 5 ] M
a n n i n g
,
.R F
.
e t a L : 19 7 8
.
G而` . , 4 : 1 5 3一 16` .
[ 6 ] M
a x a m
,
A
.
M二 t a L : 19 8 0 . M` 动 E . 忿 y匆时 . , 6 5 : 4 9 ,一 56氏
[ 7 ] s
o ll n e r
一
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, 几 e t a L : 1 9 7 , · c ` 王, 1. : 一a s一 4 9 , .
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i n g t h e s
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A f et r d i g e s t i n g w iht 5 1 n u e l e a r s e
, t h e r e -
s u lt i n g R N A一 N A d u p l e x w a s a n a lyZ e d b y g e l e l e c t r o ph o r es 姑 a n d a u t o r a d i帷 r a ph y . T h e s ’
t e r m i n a l o f 185 r R N A g e n e w a s l o c a t ed a b o u t 22 0 b P f r o m th e gB l l l
: s it e t o th e E c o R l
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.
K e y w o r d s : A r t a c姚 c y ” 忿h i a r ic i ” i , r R N A g e n e , 5 1 n u e le a s e m a p p i n g , 5 ’ t e r m i n a l o f
185 r k N A
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n e o f th e t r a n s c r i Pt i n g d i r e ct io n
R优亡 i , e d N o v e m阮 r 2 9 . 19 8` .
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