全 文 ：工 艺 技 术 食品工业科技
Vol.29, No.01, 2008
2008年第 01期 197
乙醇提取阿魏侧耳发酵液多糖的优化设计
闫训友 ,闫春江 ,史振霞 ,刘 畅 ,吴智艳
(廊坊师范学院生命科学学院 ,河北廊坊 065000)
摘 要:采用液体深层发酵培养阿魏侧耳 ,以乙醇为提取剂 ,在不同的浓度 、温度 、时间条件下提取多糖 ,利用正交实验
得到一种优化方案 。实验结果表明:以发酵液多糖提取的最优方案是乙醇浓度 80%、提取温度 80℃、提取时间 2.5h。
关键词:阿魏侧耳 ,液体发酵 ,多糖提取 ,正交实验
Studyonoptimumextractionprocessofpolysaccharidefrom
PleurotusferulaeLanziliquidfermentationbyethanol
YANXun-you, YANChun-jiang, SHIZhen-xia, LIUChang, WUZhi-yan
(CollegeofLifeScience, LangfangTeachersCollege, Langfang065000 , China)
Abstract:UsingsubmergedfermentationcultureofPleurotusferulaeLanzi, thepolysaccharidefrom Pleurotus
ferulaeLanziwasextractedthroughliquidfermentationindiferentconcentration, time, temperatureconditions.The
orthogonalexperimentresultswereasfolows:theoptimumextractingprocessofpolysaccharidefromPleurotus
ferulaeLanziwasconcentration80%, temperature80℃, extractiontime2.5h.
Keywords:PleurotusferulaeLanzi;liquidfermentation;polysaccharideextraction;orthogonaltest
中图分类号:TS201.3 文献标识码:B 文 章 编 号:1002-0306(2008)01-0197-03
收稿日期:2007-07-25
作者简介:闫训友(1978-),男 , 讲师 ,主要从事药用真菌活性物质提
取方面的研究与教学工作。
基金项目:廊坊市 2007年科技研究与发展计划项目(2007010303);廊
坊师范学院科学研究项目(LSZZ200605)资助。
阿魏侧耳 (PleurotusferulaeLanzi)属于真菌门
(Enmycophyta)、担子菌纲 (Basidiomycetes)、伞菌目
(Agaricales)、 侧 耳 科 (Pleurotaceae)、侧 耳 属
(Pleurotus)[ 1] ,又名阿魏蘑 、阿魏菇 、白灵菇 ,原产于
新疆草原戈壁野生植物阿魏上 ,国内仅分布于新疆
塔城 、阿泰勒地区 [ 2 ] ,是干旱草原上具有代表性的珍
贵食药两用真菌。真菌多糖是从真菌子实体 、菌丝
体 、发酵液中分离出的 ,能够控制细胞分裂分化 ,调
节细胞生长衰老的一类活性多糖 [ 3 ] ,具有螺旋状的立
体构型 [ 4] 。现代药理学研究表明 ,阿魏侧耳中所含的
真菌多糖能增强机体免疫功能 ,具有抗病毒 、抗肿瘤
作用 ,且能降低机体胆固醇含量 ,防止动脉硬化 [5 ] 。
阿魏侧耳多糖不仅存在于子实体中 ,经发酵获得的
菌丝体和发酵液也是多糖的主要来源 。液体深层发
酵生产是获得大量高等真菌有用代谢物的一种重要
方法 [ 8 ] 。经液体深层发酵培养获得的阿魏侧耳菌丝
体和发酵液 ,其营养价值和有效成分与子实体相当 。
本文对阿魏侧耳液体发酵多糖提取工艺进行研究 ,
通过正交实验优化出得到最佳提取方案 ,为阿魏侧
耳工业生产提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
阿魏侧耳 由中科院菌种保藏中心提供;种子
培养基 [9 ] 马铃薯 20%、葡萄糖 2%、蛋白胨 0.4%、
KH2HPO4 0.3%、MgSO4 0.15%、琼脂 1.5%, pH自然;
液体发酵培养基 马铃薯 20%、葡萄糖 2%、蛋白胨
0.4%、MgSO4 0.15%、KH2HPO4 0.3%, pH自然。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化 常规方法灭菌 ,放置斜面。无菌
条件下 ,用接种环取少量菌丝接种在活化培养基上 ,
25℃培养 7d。
1.2.2 平板扩大培养 种子培养基灭菌 ,倒平板 ,无
菌操作接种于平板培养基上 , 25℃培养 7d,菌丝布满
平板 。
1.2.3 摇瓶培养 将液体培养基分别装在 250mL三
角瓶中 ,装液量为 100mL,常规方法灭菌后 ,在超净
工作台上接种 ,每瓶等量接入活化的菌种 ,摇床培
养 ,恒温 25.6℃, 120r/min[ 10 ] 。
1.2.4 发酵上清液的制备 振荡培养 7d后 ,从摇床
中取出三角瓶 , 4000r/min离心 20min,取上清液。
1.2.5 多糖的提取工艺 将离心得到的发酵上清液
在不高于 90℃的条件下浓缩至原体积的 1/4[ 11 ] ,将
浓缩液在 4000r/min的条件下离心 20min,取上清
液 ,加入不同体积的乙醇 ,在不同的温度和时间条件
下提取多糖 ,再将提取液 4000r/min离心 20min,所
得沉淀即为粗多糖 。
1.2.6 指标测定
1.2.6.1 发酵液总糖的测定 蒽酮比色法 [ 12] 。
1.2.6.2 发酵液还原糖的测定 3, 5-二硝基水杨
酸法 [ 7] 。
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2008.01.013
食品工业科技 工 艺 技 术
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
198 2008年第 01期
1.2.6.3 发酵液多糖含量的测定 多糖 =总糖-还
原糖 [ 11] 。
2 结果与分析
2.1 总糖 、还原糖的标准曲线
蒽酮比色法得到的总糖回归方程为 y=
-0.00181+6.76143x, r=0.99934;3 , 5-二硝基水杨
酸法得到的还原糖回归方程为 y=-0.02552 +
1.36271x, r=0.99903。
2.2 发酵上清液多糖提取正交实验结果
利用正交实验法 ,选取乙醇浓度 、提取温度 、提
取时间为阿魏侧耳发酵液胞外多糖提取工艺优化实
验的 3个因素 ,因素水平见表 1,结果见表 2。
表 1 正交实验因素水平表
水平 因素A乙醇浓度(%)B提取温度(℃) C提取时间(h)
1 75 4 1
2 80 70 1.5
3 85 80 2
4 90 90 2.5
表 2 乙醇提取阿魏侧耳发酵液多糖含量正交实验结果
实验号 A B C 多糖含量(mg/mL)
1 1 1 1 0.445
2 1 2 2 1.057
3 1 3 3 2.454
4 1 4 4 1.305
5 2 1 2 0.646
6 2 2 1 1.511
7 2 3 4 2.783
8 2 4 3 1.423
9 3 1 3 0.236
10 3 2 4 1.281
11 3 3 1 1.961
12 3 4 2 1.908
13 4 1 4 0.232
14 4 2 3 0.877
15 4 3 2 0.427
16 4 4 1 0.598
K1 5.261 1.559 4.515K2 6.363 4.726 4.039K3 5.386 7.626 4.990K4 2.135 5.234 5.601
T=19.145
k1 1.315 0.390 1.129k2 1.591 1.182 1.010k3 1.347 1.907 1.248k4 0.534 1.309 1.400
R 1.057 1.517 0.391
由表 2可知 ,各因素影响多糖提取率的主次顺
序依次为:温度 >浓度 >时间 。经方差分析可知 ,温
度差异达显著水平 ,而浓度 、时间差异未达到显著水
平 ,说明温度是影响提取效果最关键的因子。对温
度应选择其最优水平 B3 ,而浓度 、时间选择任一水平
都可。综合考虑生产得率 , 最佳水平应为 A2B3C4 。
即最佳提取方案:温度 80℃,浓度 80%,时间 2.5h。
3 讨论
3.1 提取温度对多糖提取量的影响
温度对胞外多糖沉淀的影响 ,主要表现在两个
方面 ,一方面是当乙醇与水混合时 ,会放出大量的稀
释热 ,使溶液的温度显著升高 ,对不耐热的多糖的影
响较大 ,本实验采用少量多次加入的办法 ,以避免温
度骤然升高 ,造成多糖的活性损失;另一方面 ,温度
还会影响乙醇对多糖的沉淀能力 ,多糖提取时 ,如果
温度过低 ,溶剂的渗透能力和溶解能力降低 ,多糖不
能有效溶出。温度未超过 80℃时 ,随着温度的升高 ,
多糖提取量也随之增长;当温度过高(超过 80℃)时 ,
导致多糖裂解 ,使多糖提取量大幅度下降。
3.2 提取时间对多糖提取量的影响
多糖的提取得率随着时间的延长而增加 ,但如
果时间过长 , 会导致多糖裂解 , 而使多糖提取得率
下降 。
3.3 提取剂浓度对多糖提取量的影响
用乙醇沉淀多糖时 ,乙醇的浓度直接影响溶液
的介电常数 ,从而影响胞外多糖的沉淀 。通常多糖
的溶解度会随着乙醇浓度的上升而下降 ,不同浓度
的乙醇可沉淀出不同组分的多糖:一般情况下 ,乙醇
浓度越小 ,沉淀出的多糖分子量越大 , 多糖得率越
低;乙醇浓度越大 ,沉淀出的多糖分子量越小 ,多糖
得率越高 [ 6] ;但浓度过高 ,多糖得率反而会下降。
4 结论
通过对阿魏侧耳发酵液多糖进行提取 ,利用摇
床培养 ,离心获得发酵液 ,利用正交实验对多糖提取
工艺进行优化 ,为阿魏侧耳多糖发酵 、提取和工业化
生产奠定了基础。实验结果表明 ,温度是影响多糖
提取得率的最主要因素 ,用乙醇作为提取剂时 ,最佳
提取工艺条件组合为:浓度为 80%,提取温度 80℃,
提取时间 2.5h,此时多糖提取量最高。
参考文献:
[ 1] OhnoN, AdachiY, SuzukiI, etal.Characterizationofthe
antitumorglucanobtainedfromliquid-culturedGrifolafrondosa
[ J] .ChemPharmBul, 1986, 34(4):1709～ 1715.
[ 2] WangRui, HuangYaoge, ZhaoWeimin.Pleurotusextract
and use in treating hypertension [ P] . United States
Patent, 20030161842.
[ 3] 曾凯宏 .真菌多糖的结构与功能 [ J] .食品科技 , 2001
(4):65～ 68.
[ 4] 赵付安 , 朱崇梅 .食(药)用菌多糖的研究及开发利用
[ J] .高新技术 , 2001(6):20～ 21.
[ 5] 胡清秀 ,邓华平 .白灵侧耳栽培技术的研究 [ J] .食用菌
学报 , 2001, 8(4):38～ 42.
[ 6] 张惟杰 .糖复合物生化研究技术 [ M] .杭州:浙江大学
出版社 , 1994.
[ 7] 俞明义 , 龚建锋 .DNS法对金耳注射液多糖含量的测定
[ J] .浙江中医杂志 , 2006, 41(4):235～ 237.
[ 8] 汤亚杰 ,钟建 .高等真菌深层发酵生产有用生物活性物
质 [ J] .华东理工大学学报 , 2001, 27(6):704～ 711.
[ 9] KuboK, AokiH, NanbaH.Anti-diabeticactivitypresenting
thefruitbodyofGrifolafrondosa(Maitake)[ J] .BioPharmBull,
1994, 17:1106～ 1110.
工 艺 技 术 食品工业科技
Vol.29, No.01, 2008
2008年第 01期 199
笃斯越橘叶中黄酮类化合物提取技术的
实 验 研 究
孟宪军 ,王晓川 ,李颖畅
(沈阳农业大学食品学院 ,辽宁沈阳 110161)
[ 10] 江艳华 ,江晓路 .白灵菇液体培养条件的研究及栽培试
验 [ J] .食用菌学报 , 2005, 12(1):37～ 41.
[ 11] 张桂春 ,辛晓林 , 梁建光 ,等 .金顶侧耳胞外多糖测定方
法的选择及提取工艺的优化 [ J] .江苏农业学报 , 2005, 21
(3):230～ 233.
[ 12] 王香祖 , 吴建平 ,韩学平 , 等 .苜蓿芽多糖含量不同测量
方法比较 [ J] .甘肃科技 , 2006, 22(1):174～ 175.
摘 要:采用对比分析的方法 ,研究了影响笃斯越橘叶中黄酮类化合物提取量的多种因素 ,并通过 L16(45 )正交实验设
计优化出超声波法提取笃斯越橘叶中黄酮类化合物的最佳工艺条件:提取时间为 45min,乙醇用量为 130mL,提取温度
为 55℃,乙醇浓度为 40%。
关键词:笃斯越橘 ,黄酮 ,超声波 ,正交实验设计
StudyonextractionofflavanoidsfromleavesofVacciniumuliginosumL.
MENGXian-jun, WANGXiao-chuan, LIYing-chang
(FoodScienceCollege, ShenyangAgriculturalUniversity, Shenyang110161 , China)
Abstract:Basedoncontrastanalysis, somefactorsthatafecttheextractingrateofflavaoidsfrom leavesof
Vacciniumuliginosum L.werestudied.TheorthogonaldesignofL16 (45 )wasusedtoselecttheoptimal
technologicalconditionswithsupersonicmethod, andtheoptimalparameterswereasfolows:time45min, quantity
ofalcohol130mL, temperature55℃, concentrationofalcohol40%.
Keywords:VacciniumuliginosumL.;flavonoids;supersonic;orthogonaltestdesign
中图分类号:TS255.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002-0306(2008)01-0199-03
笃斯越橘在我国又称蓝莓 、蓝浆果 ,系杜鹃花科
(Ericaceae)越橘属(VacciniumL.)多年生落叶或常
绿灌木 ,广泛分布于北半球 , 全世界有 400多个品
种 。我国主要分布在华东 、华中 、华南 、西南及东北
地区 ,在大兴安岭地区多采其叶 ,蒸后晒干 ,代茶饮
用 。越橘作为一种药用植物 ,以叶入药 ,性温 、味苦 ,
有利尿 、消炎 、解毒之功效 ,可作尿路消毒剂治疗尿
道炎 ,并可用于治疗风湿 、痛风 [1 ] ;其中含有的 VMA
(花色苷色素)对眼睛有良好的保健作用 [ 2 ];其提取
物具有很强的清除自由基和抗氧化的作用 [ 3] ,具有抗
衰老 、协调平衡和增强记忆力作用 [ 4 ] ,并能够治疗糖
尿病和白内障 [ 5 ] ,预防动脉硬化 ,抑制血小板凝集 [6 ] ,
增强关节及软组织功能 [ 7 , 8]以及抗癌的作用 [ 9] 。本文
重点研究了笃斯越橘叶中黄酮类化合物的提取技
术 ,优化最佳技术参数 ,以获得高提取量 ,为笃斯越
橘叶在食品领域和药品领域的进一步研究奠定了
收稿日期:2007-06-22
作者简介:孟宪军(1960-),男 ,教授 ,博士生导师 ,从事果蔬加工方面
的教学与研究。
基础 。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
笃斯越橘叶片 采集于沈阳农业科技开发院;
无水乙醇 、甲醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、石油
醚 均为分析纯;纤维素酶 上海东风生化技术有
限公司;芦丁标准品 国药集团化学试剂有限公司。
DFT-100型手提式高速中药粉碎机 温岭市大
德中药机械有限公司;RE-52型旋转蒸发仪 上海
博通;SHI-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市英峪予
华仪器厂;千分之一电子天平 北京赛多利斯仪器
系统有限公司;HZQ-F全温振荡培养箱 哈尔滨市
东联电子技术开发有限公司;101-1A型电热鼓风干
燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;UV-1600紫外
可见分光光度计 , LG10-2.4A高速离心机。
1.2 实验方法
1.2.1 笃斯越橘总黄酮含量的测定方法 精密称取
芦丁标准品 20mg,置于 100mL容量瓶中 ,加 50%乙
醇水溶液定容 ,摇匀 ,准确配制成 0.2mg/mL的 50%
乙醇芦丁标准溶液 。分别精确吸取 0、1、2、3、4、5、6、