全 文 ：趋化蛋白。MCP-1主要由单核细胞 、淋巴细胞 、成纤
维细胞 、内皮细胞产生 ,但几乎所有细胞和组织经适
当刺激后都能产生 MCP-1〔5〕。 IL-8是第一个被报道
的引起黑色素瘤细胞系化学趋化和接触趋化的趋化
因子 ,随后发现 IL-8也是某些黑色素瘤细胞的自分
泌生长因子 。 IL-8除了直接刺激黑色素瘤细胞的生
长外 ,还促进血管增生 ,从而间接促进了肿瘤的生
长 〔6〕。 IL-8能通过受体选择性诱导中性粒细胞 、T
淋巴细胞和嗜碱性粒细胞趋化 ,具有一定的免疫增
强作用 。
我们的实验已经证实蛇葡萄素对内皮细胞有良
好的增殖抑制作用(另文发表 ),因此考虑将其作为
血管增生抑制剂在有效浓度范围与趋化因子 IL-8、
MCP-1联用 。本文观察了不同浓度的蛇葡萄素和趋
化因子的化学增活和化学趋化作用 ,结果证明蛇葡
萄素不但对中性粒细胞和单核细胞均有化学增活和
化学趋化效应 ,且在对免疫细胞的化学增活方面 ,蛇
葡萄素与 IL-8及 MCP-1均存在协同作用 (P <
0.05),提示蛇葡萄素用于肿瘤防治 ,不但可以直接
抑制肿瘤血管的增生 ,同时还可协同体内趋化因子
对免疫细胞的趋化 ,间接抑制肿瘤细胞及血管的生
成 ,蛇葡萄素对免疫细胞的趋化作用可能是其抗肿
瘤侵袭和转移作用的重要机制之一。
参 考 文 献
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(2005 - 07 -15收稿)
The Chemotaxis Effect of Ampelopsin on the Immunocytes
ZENG Sa, LUO Gao-qin, L IU De-yu
(Schoo l of Pharm aceu tical S ciences, Sun Ya t-sen University, Guangzhou 510080, China)
Abstrac t　Objective:To study the chemo tax is e ffec t o f ampe lopsin w ith differen t concentra tion on monocy tes and neutroph ilic
g ranu locy te s. M ethods:Chem okinesis and chem o tax is tests we re proceed in aga rose ge l com pa ringw ith chemokine IL-8 o rMCP-1. Re-
su lts:A t 25.6 μg /m l o r 51.2 μg /m l, am pe lopsin could strong ly enhance the m igration o f neu troph ilic granulocy tes and monocy tes.
The chem o tax is effec t induced by 25.6 μg /m l o f ampe lopsin had no sign ificant diffe rences w ith tha t induced by 150 ng /m l o f IL-8 o r50
ng /m l o fMCP-1 (P>0.05). At a concen tra tion of 12. 8μg /m l, the chemokime e ffect of am pelopsin w asm ore potent than tha t o f 150
ng /m l o f IL-8 o r100 ng /m l ofMCP-1 (P<0.05). Am pe lopsin exerted a syne rgistic ac tion w ith IL-8 orMCP-1 on its chem otax is e ffec t
to neutrophilic granulocy tes and monocy tes. Conc lusion:Ampe lopsin can strong ly enhance the chem okinesis and chem o tax is e ffec ts of
neu troph ilic g ranu locy te s and moncy tes and exe rt a synergistic ac tion w ith IL-8 o rMCP-1 on its chem o tax is effect to neutrophilic granu-
locy tes and monocy tes.
K ey words　Am pe lopsin;Chem otaxis;Immunocy te; IL-8;MCP-1
楮实子红色素体外抗氧化作用研究
庞素秋 1, 2 ,王国权 2 ,秦路平1* ,黄宝康 1 ,张巧艳 1
(1.中国人民解放军第二军医大学药学院生药教研室 ,上海 200433;2.中国人民解放军第 180医院药械
科 ,福建泉州 362000)
　　摘要　目的:探讨楮实子红色素(F ructus Broussone tiaH aem atochrome, FBH)体外抗氧化作用。方法:采用 H2O2
和 Fe2+系统产生羟基自由基 , NADH-PMS-NBT系统产生超氧阴离子自由基 ,并观察了 FBH对羟基自由基及超氧阴
离子自由基清除效果以及对 H2O2诱导小鼠红细胞溶血的抑制和对肝组织匀浆自氧化终产物 MDA及 VC-Fe2+系
统引起的线粒体的形态改变的抑制作用。结果:FBH能显著清除超氧阴离子及羟基自由基 , 抑制 H2O2诱导小鼠红
细胞溶血和肝匀浆自氧化 ,对肝线粒体也有保护作用。结论:FBH有较强的体外抗氧化作用。
关键词　楮实子红色素;超氧阴离子自由基;羟自由基;丙二醛;体外抗氧化
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)03-0263-04
262 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牪牪
基金项目:国家自然科学基金(No. 30400595);上海市联合利华研究与发展基金(03121)资助项目
　　*通讯作者:秦路平
　　中药楮实子又名榖实 、楮桃 、谷桑 、野杨梅等 ,为
桑科植物构树 Broussonetia papyrifera (L.)Ven t.的
干燥成熟果实。性甘 、味寒 ,无毒。以补肾入药应用
有几千年的历史 , 《神农本草经》、《名医别录》俱将
其列为上品 。刘汉基《药性通考》载 “楮实子 ,能充
肌肤 ,助腰膝 ,益气力 ,补虚劳 ,悦颜色 ,壮筋骨 ,明
目 。补阴妙品 ,益髓神膏 ”〔1〕。含楮实子的经典方
药杨氏还少丹经多年临床验证具有确切的抗衰老 、
促智作用 〔2〕。实际上我国在中医临床上楮实子已
用于治疗老年痴呆症并具有较好效果 ,其水溶性粗
提取物能显著改善衰老模型小鼠的学习记忆能
力 〔3〕。现代医学认为 ,机体内氧化自由基的增加是
导致衰老的主要原因 〔4〕。
为探讨楮实子补肾抗衰老物质基础 ,本文对楮
实子水溶性主成分之一的红色素 (FBH)进行分离
提取并对其体外抗氧化活性进行了研究。
1 　材料
1.1 　药材　楮实子药材购自安徽亳州药材市场 ,
经第二军医大学生药教研室郑汉臣教授鉴定为桑科
构树的成熟果实 。
1.2 　动物　昆明种小鼠 ,雌雄兼用 ,体重 30±3 g,
由第二军医大学实验动物中心提供。
1.3 　仪器　离心机 (Anke TDL-5型离心机 ,上海
安亭科学仪器厂 );紫外分光光度计 (UV-1100,上海
天美科学仪器有限公司);恒温水浴槽 (HWS24型电
热恒温水浴锅 ,上海一恒科技有限公司)。
1.4 　试剂 　还原型辅酶 Ⅰ (NADH-2N a)为 S igma
产品;硫代巴比妥酸 (TBA)及吩嗪硫酸甲酯 (PM S)
为上海生化试剂厂产品 ,氮蓝四唑 (NBT)为上海前
进试剂厂生产;MDA生物试剂盒 ,南京建成生物工
程研究所生产。其余试剂均为分析纯 。
2 　方法与结果
2.1 　楮实子红色素 (FBH)的提取 　楮实子经粉
碎 ,过 60目筛 ,石油醚超声脱脂 ,残渣用 75%酒精
加热回流提取三次 ,合并滤液 ,减压浓缩得流浸膏 ,
继而经大孔吸附树脂柱及反相硅胶柱得红色粉末 ,
即 FBH ,易溶于水 、乙醇 、甲醇等大极性溶剂。
2.2 　统计学处理　实验结果以 ONEWAY ANOVA
进行分析处理 , P <0.05认为有显著性差异 。
2.3　FBH对超氧阴离子自由基的清除作用 〔5〕　在
16 mmo l /L Tris-HC l缓冲液 (pH8.0)中含 NADH 73
μmo l /L, PM S 15 μmo l /L, NBT 50 μmol /L 产生
O
-
2 ,空白管下不加 PM S,对照管不加 FBH , FBH的
终浓度为 20, 40, 80, 160 mg /L,总体积为 3 m l,于
560 nm处测吸收度 ,计算抑制率 。结果显示 , FBH
能明显清除 NADH-PM S-NBT系统产生的超氧阴离
子自由基 ,且呈量效关系 (表 1)。
　Tab le 1　　Scavenging effect of FBH on O - 2 produced
by pyrogallic ac id(n=4, x±s)
Group Conc.(m g /L) Conc. of O
-
2　(A560nm)
C learance
rate(%)
Contro l 0 0. 8846±0.0110
FBH 20 0. 6235±0.0098* 29. 52
40 0. 4874±0.0103** 44. 90
80 0. 3996±0.0091** 54. 83
160 0. 3012±0.0101** 65. 95
　　*P<0. 05, ** P<0. 01 vs contro l group
2.4　FBH对 H2O2系统产生的羟基自由基的清除
作用　以 Sm irnoff等 〔6〕的方法为基础并适当改进 ,
即采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基
( OH)方法。 3m l反应液中含 0.15mo l /L FeSO 4 ,
6mmol /L H 2O 2 , 2mmol /L水杨酸钠和不同质量浓
度的 FBH ,最后加 H2O2启动反应 , 37℃反应 1 h,在
510 nm处测定吸收度 ,吸收度值越小 ,清除效果越
好。按照下式计算清除率:
　　清除率 =[ A 0-(A i-A i0)] /A0 ×100%(A 0 为对照 , 不加 FBH的
吸收度;A i为某质量浓度的 FBH 时的吸收度 , A i0为无水杨酸时的
FBH 吸收度值)
　　结果表明 , FBH能显著清除 H 2O 2系统产生的
羟基自由基 ,且呈量效关系(见表 2)。
　Tab le 2　　Scavenging ac tivities of FBH for OH
produced byH 2O 2 system(n=4, x±s)
Group Conc.(m g /L) Conc. of OH　(A510 nm ) C learancerate(%)
Contro l 0 0. 9146±0.0110
FBH 20 0. 8135±0.0098* 20. 46
40 0. 6874±0.0103* 30. 12
80 0. 5962±0.0091** 37. 13
160 0. 5611±0.0108** 39. 28
　　*P<0. 05, ** P<0. 01 vs contro l group
2.5　FBH对诱导的 H2O2小鼠红细胞溶血作用的
影响 〔7〕　小鼠经眼球取血 ,肝素抗凝 , 4℃离心 3000
r /m in, 10m in,得红细胞 ,用冰冷生理盐水溶液洗 3
次 ,制成 0.5%悬浮液。取红细胞悬液 1 m l,模型管
加 H2O2(使终浓度为 100 mmo l /L),受试物管中加
入 H2O2(终浓度为 100 mmol /L)以及不同浓度的
FBH(终浓度分别为 20, 40、80, 160 mg /L),同时设
263 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
未诱导溶血的空白对照管 。上述各管混匀后 37℃
水浴中温育 1 h,以生理盐水稀释 5倍 ,离心 3000 r /
m in, 10 m in ,上清液在 415 nm波长处测吸收度 。计
算溶血率及抑制率:
　　溶血率 =A受试物 /A模型组 ×100%
抑制率 =(模型组溶血率 -受试物溶血率) /(模型组溶血率 -
空白组溶血率)×100%
　　与对照组比 , H2O 2明显诱导了红细胞溶血的发
生 ,模型组的吸收度值明显升高 (P <0.01);同时
FBH对由 H2O2引起的该效应均有抑制作用 ,并表
现出一定的量效关系 (表 3)。
　Tab le 3　　E ffect of FBH on the hem olysis ofm ouse
RBC induced H2O2(n=4, x±s)
G roup Conc.(m g /L) A415 nm H em o lysisrate(%) C learancerate(%)
Con tro l - 0.058±0. 021 13.65
M odel - 0.425±0. 085△△ 100
FBH 20 0.361±0. 024* 84.94 17. 44
40 0.314±0. 038** 73.88 30. 25
80 0.302±0. 043** 71.06 33. 51
160 0.288±0. 025** 67.76 37. 34
　　△△P<0. 01 vs con trol g roup;* P<0.05, ** P <0. 01 vs m odel
group
2.6　FBH对肝组织匀浆脂质过氧化的作用 〔8〕　小
鼠脱颈椎处死 ,迅速取肝 ,置于 4℃PBS中洗净表面
残血 ,用滤纸吸干 ,制成 10%的匀浆备用。取上述
组织匀浆 1 m l,加入不同浓度的 FBH溶液 0.5 m l,
(终浓度分别为 20, 40, 80, 160 mg /L),以 DMSO为
阳性对照药 (终浓度为 1.5μmo l /L),终反应体积为
1.5m l。 37℃水浴中温育 ,且于不同时间点吸取 0.1
m l混悬液 ,按丙二醛测定试剂盒操作测定 MDA的
生成量 (见图 1)。由图 1可见 ,肝匀浆在自氧化的
过程中 ,氧化产物 MDA生成量是随时间的延长而
增加的 ,在 0 ～ 1h间 , MDA的含量增长最快 ,之后
a. contro l;b. m odel;c. 20mg /L;d. 40m g /L;c. 80m g /L;.f 160m g /L
F ig l　Effect of FBH on MDA production of liver ho-
mogenate induced by au to-ox idation ( x ± s,
n=4, *P<0. 05, **P<0. 01 vs con trol group)
增长较缓慢 。在各个时间段中 , FBH和 DMSO对肝
匀浆的自氧化有显著的抑制作用 ,且 FBH呈现良好
的量效关系。
2.7　FBH对 V it C-Fe2+系统诱导肝线粒体氧化损
伤的影响 〔9〕
2.7.1 　线粒体的制备:昆明种小鼠 ,脱颈椎致死 ,
取肝脏置于预冷至 0 ～ 4℃的 0.25 mo l /L, pH 7.4
的蔗糖溶液中洗涤 ,洗净血液 ,用滤纸吸去肝组织表
面的溶液 ,称重 ,以 1∶8的比例加入预冷的蔗糖溶
液 ,将肝组织用剪刀剪碎 ,置于匀浆器中打成匀浆 ,
以低温离心 10m in,取上清液低温离心 10m in,分离
沉淀 ,用预冷的 0.25 mo l /L的蔗糖溶液洗涤两次 ,
每次离心 10m in,即得到纯化的线粒体 ,沉淀物用缓
冲液 (Tris-HC l 20 mmo l /L, pH7.0, KC l 175 mmo l /
L)混悬 ,取线粒体混悬液涂片 ,用 1%的詹纳斯绿 B
液染色 20 m in,覆上盖玻片 ,显微镜鉴定 ,线粒体蓝
绿色 ,呈小棒状或者哑铃状。用双缩脲法测定线粒
体蛋白含量。
2.7.2 　FBH对 V it C-Fe2+系统诱导肝线粒体形态
改变的影响:反应体系为:反应体积 3m l, 0.1 mmo l /
L V itC , 5 μmo l /L FeSO4 ,含有 1.0 mg线粒体蛋白
质 ,加入各种浓度的 FBH或者缓冲液 , 37℃水浴中
温育 30m in。于 520 nm处测线粒体悬液的吸收度
变化 。吸收度的下降表示线粒体膨胀度增加 (图
2)。结果表明 FBH能明显抑制由 FeSO 4 /V itC所引
起的线粒体的形态改变效应 。与对照组比较差异具
有统计学意义 。
a. m oldel;b. 20mg /L;c. 40mg /L;d. 80m g /L
F ig 2　E ffect of FBH on the d ilata ltion of liverm itochon-
dr ia induced by V it C-Fe2+ system ( x±s, n=6,
*P<0. 05, **P<0. 01 vsm odel group)
3　讨论
超氧阴离子自由基 、羟基自由基等活性氧自由
基是在机体代谢过程中产生的 。在生理状态下 ,活
性氧自由基处于较低的水平 ,其产生和与清除处于
264 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
动态平衡 ,但在某些病理情况下 ,这种平衡被打破 ,
将导致机体损伤 。其中羟基自由基的危害最大 ,可
导致多种疾病的发生 ,许多病理生理现象如衰老 、肿
瘤 、炎症 、脑缺血等均与氧自由基有密切联系。本研
究采用 H2O2 和 Fe2 +系统产生羟基自由基 , 利用
NADH-PMS-NBT系统产生超氧阴离子自由基 ,来研
究 FBH的清除自由基活性 ,结果表明 FBH于体外
可清除 O- 2 、 OH。
另一方面活性氧可促发多不饱和脂肪酸的脂质
过氧化 (LPO),反应中产生的各种中间过氧化产物
也具有损伤作用 , LPO反应的终产物丙二醛 (MDA)
可使含氨基的蛋白质 、核酸 、脑磷脂发生交联并丧失
其活性 。本研究结果显示 FBH能显著地抑制 H2O2
诱导的小鼠红细胞溶血和降低肝匀浆自氧化产物
MDA的含量。
线粒体是细胞内能量代谢的主要场所 ,参与包
括自由基生成 、脂质代谢等在内的许多生理和生化
过程。近年来的研究还表明 ,线粒体是多类药物的
细胞内靶点 。因此维持其结构和功能正常对生物体
的正常活动有着至关重要的意义。本研究证实
FBH可降低 V it C-Fe2 +系统诱导肝线粒体的肿胀 ,
表明可对自由基过度生成而引起的线粒体功能损伤
有一定的保护作用。
以上结果说明 FHB有明显的体外抗氧化作用 ,
又是一种天然水溶性色素 ,对于进一步开发成抗衰
老药物或保健食品辅料有较大的参考价值 。
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Abstrac t　Ob jec tive:To investigate the antiox ida tive effec ts of F ruc tus Broussonetia H aem atochrome. Methods:NADH-PMS-
NBT system w as used to produce supetox ide free radica l(O - 2 ), Fe2+-H2O2 sy stem to genera te hyd roxy l free radica l( OH), H2O2
to stimu la te ox ida tive hemo lysis o f ery th rocy tes o f m ice. MDA production in liver homogena te induced by auto-oxida tion w as m easu red
byMDA kits m ethod. Results:FBH no t on ly scavenged O - 2 and OH produced by the expe rim ental system s direc tly, but a lso inhib-
ited H2O2 stim ulated oxidative hemo ly sis o f e ry th rocy tes ofm ice, depressed MDA produc tion in m ice live rhom ogena te by auto-oxida tion
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K ey words　FBH;F ree rad ica l;Hydroxy l free radical;MDA;An tioxidation
265 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月