全 文 ：2008年 12月
第 31卷 第 4期　　　　　　　　 　
湖南师范大学自然科学学报
JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversity　　　　　　　　 　
Vol.31　No.4
Dec., 2008
高效液相色谱法测定刺糖多胞菌发酵液多杀菌素含量＊
易　勇 ,夏立秋＊ ,丁学知 ,杨　尉 ,王海龙 ,罗玉双
(湖南师范大学生命科学学院 ,微生物分子生物学湖南省重点实验室 ,中国 长沙　410081)
摘　要　为了建立刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)发酵液中多杀菌素不同组分的分离与定量分析的高
效液相色谱检测方法.以 AQ12S05-1546WT(150×4.6 mmL.D.S-5 μm, 12 nm)为分析柱 ,以甲醇 -乙腈 -2%醋
酸铵溶液(45∶45∶10, v/v/v)为流动相 ,流速 1.5 mL/min, 检测波长 250 nm.结果表明多杀菌素在 25 ～ 1 000 mg/L
范围内线性关系良好 , 本方法标准偏差为 1.486 9, 变异系数为 0.79%, 相关系数为 0.999 2, 平均回收率为 99.
58%.多杀菌素化合物 A, B, C, D, E, F的保留时间分别为 7.01, 3.59, 3.21, 8.33, 5.72, 4.81 min.本方法能准
确测定刺糖多胞菌发酵液中多杀菌素含量 ,有效分离多杀菌素不同组分.
关键词　刺糖多孢菌;高效液相色谱法;多杀菌素;定量分析
中图分类号　Q93.33　　　　文献标识码　A　　　　文章编号　1000-2537(2008)04-0081-05
DeterminationofSpinosadfromSaccharopolyspora
SpinosaFermentationSolutionbyHPLC
YIYong, XIALi-qiu＊ , DINGXue-zhi, YANGWei, WANGHai-long, LUOYu-shuang
(CollegeoflifeScienceofHunanNormalUniversity, KeyLaboratoryforMolecularBiologyof
MicroorganismofHunanprovince, Changsha410081, China)
Abstract　Toestablishamethodfortheseparationandquantitativedeterminationofdiferentkindsofspi-
nosadsfromfermentationsolutionofSaccharopolysporaspinosabyHPLC.TheAQ12S05-1546WT(150 ×4.6
mmL.D.S-5 μm, 12 nm)columnwasused.Themobilephaseconsistedofmethanol, acetonitrileand2% am-
moniumacetatesolutions(45∶45∶10, v/v/v), andtheflowratewas1.5 mL/min.Detectionwavelengthwas250
nm.Theresultsshowedthatthegoodlinearrelationshipwasobtainedintheconcentrationrangeof25 ～ 1 000mg/
L.Standarddeviationofthemethodwas1.486 9.Coeficientofvariationwas0.79%.Linearcorrelationwas
0.999 2.Averagerecoverywas99.58%.TheretentiontimeforspinosadA, B, C, D, E, Fwere7.01, 3.59,
3.21, 8.33, 5.72, 4.81 min, respectively.Themethodissimple, sensitive, andreproduciblefordeterminationof
spinosadsfromfermentationofSaccharopolysporaspinosa.
Keywords　saccharopolysporaspinosa;HPLC;spinosad;quantitativedetermination
多杀菌素(spinosad)是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)产生的次级代谢产物 ,属于
大环内脂类化合物 ,其主要有效成分是多杀菌素 spinosynA(约占 85% ～ 90%)和 spinosynD[ 1, 2] (约占 10%
＊ 收稿日期:2008-10-09
基金项目:国家 863 计划基金资助项目 (200602Z187, 2006AA10A212);国家自然科学基金资助项目(30670052,
30870064);教育部博士点基金资助项目(20060542006);湖南省自然科学基金优秀面上基金资助项目
(06jj2009)
作者简介:易　勇(1984-), 男 ,湖南湘潭人 , 湖南师范大学硕士研究生.＊通讯作者:夏立秋 , E-mail:xialq@hunnu.edu.
cn
～ 15%).多杀菌素作为一种新型的高效广谱大环内酯类杀虫活性物质 ,能有效地控制鳞翅目 、双翅目和缨
翅目害虫 , 很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类 [ 3-5] ,因其独特的杀虫机理而兼具生
物农药的安全性与化学农药的快速性 ,在研发和应用上受到高度重视 ,成为国际最具有发展前景的新型杀虫
生物农药.由于多杀菌素化合物分子结构上的特殊性 ,所以给这类化合物的分离和定量测定带来一定的困
难.目前 ,已有一些国外研究报道采用高效液相色谱法 [ 6, 7] 、液质联用法[ 8] 、生测法 [ 9]进行多杀菌素的分离和
含量的检测 ,但均存在一定的局限性 ,如测定成本很高 ,准确性差 ,设备条件要求苛刻.国内已有聂果 [ 10]等使
用 HP1100高效液相色谱仪进行多杀菌素 A和 D的定量分析 ,但未进行多杀菌素不同组分的分离检测.而张
苑 [ 11]等建立的高效液相色谱法 ,多杀菌素 A和 D的保留峰存在一定的重叠区域 ,未能很好的形成两个完全
独立的峰形.也有采用薄层层析 TLC法 [ 12]对多杀菌素进行定性分析 ,通过硅胶板上面样品斑点颜色的深浅 ,
判定多杀菌素浓度的高低 ,该方法虽然简便 、快速 ,但不能对多杀菌素含量进行精确定量.本研究摸索了利用
AKTApurifier10检测多杀菌素的色谱条件 ,测定了多杀菌素不同组分的保留时间 ,建立了多杀菌素主要组分
的精确定量的分析方法 ,不仅为以后进一步开展多杀菌素发酵条件优化研究工作奠定了基础 ,而且可为刺糖
多胞菌遗传改造中新菌种的高通量筛选及其新衍生物的鉴定和生物合成代谢途径中各组分变化的监测提供
技术支持.
1　实验部分
1.1　仪器
AKTApurifier10高效液相色谱仪(包括 P-900四元泵 , M-925在线混合器 , SV-903转化泵 , UV-900紫外
检测器 , HP/C-900化学工作站), Frac-920自动收集仪.
1.2　试剂
甲醇(色谱纯 ,上海陆都化学试剂厂),乙腈(色谱纯 ,上海陆都化学试剂厂),超纯水(18.2 Ψ,实验室自
制),多杀菌素标准品(含量≥99%).其余试剂(上海陆都化学试剂厂)均为分析纯.
1.3　样品
1.3.1　标准溶液的配制　准确称取 0.025g多杀菌素 A与 D混合标准样品 ,置于 25 mL容量瓶中 ,加入适
量甲醇溶解 ,用超声波处理 10min,静置 ,用甲醇定容 ,配制成 1 000 mg/L的母液 , 0.22μm滤膜过滤后 4 ℃
保存.
1.3.2　试样溶液的配制　准确吸取 2mL发酵液样品 ,置于 5mL离心管内 ,加入 2mL甲醇溶液 ,振荡混匀 ,
30 ℃培养箱浸提过夜.4 000 r/min离心 20min,经 0.22μm微孔滤膜过滤后上 HPLC.
1.4　方法
1.4.1　色谱条件　色谱柱 AQ12S05-1546WT150×4.6 mmL.D.S-5 μm, 12 nm;流动相参考 Sheldon和
Larry[ 13] ,并进行了改动:甲醇 -乙腈 -2%醋酸铵溶液(45∶45∶10);流速:1.5 mL/min;检测波长:250 nm;进样
量:10 μL.
1.4.2　测定　在设定的色谱条件下 ,待仪器基线稳定后 ,连续注入数针标准样品溶液 ,计算各针峰面积的重
复性 ,待相邻两针的峰面积变化 <1.0%时 , 按标样溶液 ,试样溶液 ,标样溶液的顺序进行测定.
1.4.3　计算　采用单点外标法进行计算 ,即分别取测得的两针试样溶液及试样溶液前后两针标样溶液中多
杀菌素的峰面积的平均值.试样中多杀菌素的质量百分含量 X按下式计算:
　　X=A2＊C/A1.
式中:A1———标样溶液中多杀菌素峰面积的平均值;A2———试样溶液中多杀菌素峰面积的平均值;
C———多杀菌素标样的浓度(mg/L);
2　结果与分析
2.1　多杀菌素的色谱行为
在上述色谱条件下 ,多杀菌素标准样品 ,多杀菌素试验样品 HPLC基线走向平稳 ,主要有效成分多杀菌
素 A和 D得到有效的分离 ,保留时间分别为 7.01 min和 8.33 min(图 1 a、b).多杀菌素 A, B, C, D, E, F
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混合标样色谱图峰形良好 ,具有良好的分辨率 ,多杀菌素 B, C, E, F相对应的保留时间为 3.59、3.21、5.72、
4.81min(图 1c).
a:多杀菌素 A和 D混合标样色谱图;b:多杀菌素试样色谱图;c:多杀菌素 A, B, C, D, E, F混合标样色谱图
图 1　多杀菌素标准品与试样高效液相色谱图
2.2　线性关系考察
将多杀菌素标准品配置成 25, 50, 100 , 200, 300, 400, 600, 800, 1 000 mg/L9种不同浓度的标准溶液 ,按
照上述色谱条件 ,进样 10 μL,测定相应的峰面积.以峰面积为横坐标 ,浓度为纵坐标绘制工作曲线(图 2),
回归分析得到线性方程:Y=1.195 647 6+0.227 281 09X,相关系数 R=0.999 2,表明多杀菌素在 25 ～ 1 000
mg/L范围内线性关系良好 ,可精确的计算多多杀菌素的含量.
图 2　多杀菌素标准曲线
2.3　精密度和准确度试验
同一试样在上述色谱条件下 ,进行 6次平行测定 ,测得其标准偏差为 1.486 9 ,变异系数为 0.79%(表
1).在已知含量的试剂溶液中 ,加入不等量的浓度的多杀菌素标准溶液 ,按上述色谱条件测定 ,测得多杀菌
素的回收率为 99.58%(表 2),说明该方法的精密度和准确度良好.
表 1　分析方法的精密度
序号 测定值 /mg· L-1
平均值 /
mg· L-1 标准偏差
变异系数 /
%
1 189.4 188.35 1.486 9 0.79
2 188.7
3 186.7
4 187.2
5 190.6
6 187.5
表 2　分析方法的准确度
序号 加入量 /mg· L-1
实测值 /
mg· L-1 回收率 /%
平均回收率 /
%
1 20.32 20.13 99.06
2 50.67 50.32 99.31
3 100.43 100.02 99.59
4 167.89 167.27 99.63 99.58
5 200.76 200.19 99.72
6 300.58 301.09 100.17
83第 4期　　　　　　　　　　易　勇等:高效液相色谱法测定刺糖多胞菌发酵液多杀菌素含量　　　　　　　
2.4　刺糖多孢菌发酵液多杀菌素含量的测定
在上述色谱条件下 ,进行刺糖多孢菌发酵液多杀菌素 A与 D含量的测定(图 3).同一试样平行测定 4
次(表 3),测得刺糖多孢菌株 S08-4标准差为 1.862 8;刺糖多孢菌株 S08-1标准差为 2.104 8.说明实验所确
定的 HPLC法能有效的测定不同刺糖多孢菌株发酵液中多杀菌素的含量.
图 3　刺糖多孢菌发酵样品色谱图(a.刺糖多孢菌株 S08-4, b.刺糖多孢菌株 S08-1)
表 3　刺糖多孢菌 S08-4和 S08-1发酵液中多杀菌素含量的测定
序号 测定值 /mg· L-1 平均值 /mg· L-1 标准差
S08-4
326.9
327.4
329.8
325.3
327.35 1.862 8
S08-1
705.9
710.7
708.4
706.8
707.95 2.104 8
3　讨论
以绿色环保的新型生物农药取代目前大量使用的毒性较高的化学农药 ,已越来越受到重视 ,成为研究开
发的热点.多杀菌素作为利用天然产物保护作物的新产品 ,以其独特的化学结构和作用机制 ,成为杀虫剂研
究开发中最为成功的范例之一 [ 14-15] .
多杀菌素 spinosynA和 spinosynD是刺糖多胞菌发酵过程中产生的主要有效成分 ,已有研究表明其含量
与发酵液生物杀虫活性检测结果一致.因此 ,选用 spinosynA和 spinosynD进行多杀菌素含量与 HPLC峰面
积标准曲线的绘制 ,建立线性回归模型 ,为以后开展刺糖多孢菌发酵条件优化工作奠定了基础.
迄今为止 ,已从 S.spinosa培养液中分离出了 20多种多杀菌素组分 spinosyns(A-Y)[ 16] ,有研究表明 ,
对刺糖多胞菌进行定向的遗传改造 ,不仅能产生新的具有活性的多杀菌素衍生物 ,而且其发酵液中多杀菌素
各组分比列也会发生相应改变 [ 17] .我们用建立的 HPLC检测方法对多杀菌素其他成分 spinosynB, C, E, F
进行分离纯化 ,同样得到了满意的分辨率 ,这可为以后刺糖多孢菌诱变育种 、多杀菌素基因簇克隆 、基因簇模
块结构域替换和异源表达等分子生物学研究 ,多杀菌素衍生物的鉴定提供技术支持.同时可以通过新的工程
菌株中不同多杀菌素组分的变化 ,从侧面了解工程菌多杀菌素生物代谢途径发生的改变.
利用本研究建立的方法进行多杀菌素不同组分的分离和含量的测定时 ,多杀菌素不同组分的出峰时间
短(<15min),峰形良好 , 多杀菌素与杂质分离完全 ,样品处理操作简单.该方法灵敏 , 操作简便 ,准确性好 ,
精密度高 ,是多杀菌素理想的定量分析方法.
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