全 文 ：学评分没有组间差异 , 但纯化前后的出膏率相差 8.2%, 可见超
滤工艺在减小服用剂量的同时未对该处方的疗效造成显著影响 ,
可用于补阳还五汤提取液的纯化过程。
参考文献:
[ 1] 　华耀祖.超滤技术与应用 [ M].北京:化学工业出版社 , 2004:184.
[ 2 ] 　魏舒畅 ,余　琰 ,王志旺 ,等.补阳还五汤超滤工艺优选条件的评价
与优化 [ J] .中成药 , 2009, 19(2):104.
[ 3 ] 　魏舒畅 ,程体娟 ,张文斌 ,等.复方沙棘 1号颗粒对大鼠局灶性脑缺
血再灌注损伤的保护作用及机理探讨 [ J] .中药药理与临床 , 2003,
19(2):32.
收稿日期:2009-04-07;　修订日期:2009-08-27
基金项目:广西科学基金(No.0832007)
作者简介:夏　星(1981-),男(汉族),广西桂林人 ,现任广西中医学院药
理教研室讲师 ,博士学位 ,主要从事中药有效成分的药理活性及作用机制
研究工作.
＊通讯作者简介:郑作文(1957-), 男(汉族),山东沂源人 , 现任广西中医
学院药理教研室教授 ,硕士研究生导师 , 硕士学位 ,主要从事药理学教学
与抗病毒药物研究工作.
白背叶提取物 WF对 2215细胞分泌
HBsAg和 HBeAg的影响
夏　星 ,郑作文＊ ,谭　为
(广西中医学院 ,广西 南宁　530001)
摘要:目的 研究白背叶提取物 WF对乙肝病毒的抑制作用。方法 接种 2215细胞 24 h后 ,加入不同浓度的白背叶提取
物 WF培养 8 d,以细胞形态学的变化为指标评价 WF对 2215细胞的毒性。收集最大无毒浓度下的培养液 ,酶联免疫法
(ELISA)检测培养液中 HBsAg和 HBeAg水平。结果 在最大无毒浓度下 , WF对 2215细胞 HBsAg和 HBeAg的分泌有明
显抑制作用。 WF抑制 HBsAg的半数有效量(IC50)为 8.61 μg/ml;抑制 HBeAg的 IC50为 20.87 μg/ml。结论 WF可明显
抑制 2215细胞 HBsAg和 HBeAg的分泌 ,具有显著的抗乙肝病毒作用。
关键词:白背叶提取物;　2215细胞;　HBsAg;　HBeAg
中图分类号:R962　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)03-0631-02
EffectofMalotusapeltaExtractWFonHBsAgandHBeAgSecretionin2215 Cells
XIAXing, ZHENGZuo-wen＊ , TANWei
(GuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Nanning, Guangxi530001, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheanti-HBVeffectofWF.Methods 2215celswereculturedfor24 h, thendiferentconcen-
trationofWFwereaddedandculturedfor8 d, andtheWFstoxicitywasevaluatedaccordingtothemorphologicalalterationof
2215 cells.Thesupernateofculturewascollectedatthenon-toxicconcentrationofWF, enzymelinkedimmunosorbentassay
(ELISA)wasusedtodeterminetheHBsAgandtheHBeAglevelsinthesupernate.ResultsThenon-toxicconcentrationofWF
inhibitedHBsAgandHBeAgsecretionof2215 celssignificantly(P<0.01), andthe50% inhibitingconcentration(IC50)of
WFonHBsAgsecretionwas8.61 μg/ml, whiletheIC50 onHBeAgsecretionwas20.87 μg/ml.ConclusionWFcaninhibit
HBsAgandHBeAgsecretionof2215 cellsefectively, indicatingthatWFmayhaveanti-HBVactivity.
Keywords:Whitebackleafextractants;　2215 cell;　HBsAg;　HBeAg
　　白背叶为大戟科植物 Mallotusapelta(Lour.)MuelL.-
Arg., 具有清热利湿 、解毒止血 、止痛之功 , 常用于治疗肠炎腹
泻 、慢性肝炎 、脾脏肿大及跌打损伤等 [ 1] 。 有研究发现 , 白背
叶根水煎液对体外培养的 2215细胞有显著的抗肝炎病毒作
用 [ 2] , 且该作用在鸭乙肝病毒实验研究中亦得到证实 [ 3] 。 此
外白背叶还具有较好的抗肝纤维化和抗肝损伤作用 [ 4 , 5] 。 本
研究采用白背叶中提取出的有效成分群 WF, 评价其对 2215
细胞分泌 HBsAg和 HBeAg的影响 , 进一步探讨白背叶提取物
WF的抗乙肝病毒作用。
1　材料与仪器
1.1　药物 WF为棕褐色粉末结晶 , 由广西中医学院中药化学教
研室提供。
1.2　试剂 EaglesMEM干粉(美国 GIBCO公司产品);胎牛血清
(美国 HycloneLab公司产品);G-418(Genticin产品);L-谷氨
酰胺(Amresco分装);卡那霉素(Amresco分装);DMSO(博大泰
克公司产品);0.25%胰蛋白酶(美国 HycloneLab公司产品);乙
肝表面抗原测试盒 (上海荣盛生物技术有限公司 , 批号:
20070605);乙肝 e抗原测试盒(上海荣盛生物技术有限公司 , 批
号:20070709)。
1.3 　仪器 DLF560型超净工作台(荷兰 clearAirTechniekbv公
司产品);311二氧化碳培养箱(美国 ThermoForma公司产品);倒
置显微镜(德国 LEICABMIRB产品);酶标仪(奥地利 SUNRISE
产品);培养瓶(加拿大 BIOFIL公司产品);96孔板(美国 Corning
公司产品);微量移液器(法国 Gilson公司产品);十万分之一电
子天平(美国赛多利斯仪器系统有限公司产品)。
1.4　2215细胞 2215细胞由美国 MountSinai医学中心构建 , 中
国医学科学院医药生物技术研究所惠赠。
2　方法
2.1 　细胞培养液配制 MEM培养液 100 ml:含胎牛血清 10%,
谷氨酰胺 300 μg/ml, G-418 380 μg/ml, 卡那霉素 750 μg/ml。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.3 时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期
用 5%NaHCO3调 pH值至 7.2 ～ 7.4。
2.2 　 2215细胞培养 2215细胞于含 10%胎牛血清的 MEM培
养液中 , 置 37℃、5%CO2培养箱培养 , 2 ～ 3d换培养液 1次 , 约 7
～ 10 d长满培养瓶。
2.3　白背叶提取物 WF对 2215细胞的毒性实验 [ 6] 实验设细胞
对照组和 7个用药组 , 药物终浓度分别为 150, 75, 37.5, 18.75,
9.38, 4.69, 2.34 μg/ml, 每组设 3个复孔。 细胞长满后 , 经
0.25%胰酶消化 ,调整细胞浓度至 105 cells/ml, 接种于 96孔板 ,
每孔 0.2 ml。培养 24 h后弃原培养液 , 细胞对照组加正常培养
液 , 用药组加含药培养液 ,培养 3 d。至培养第 4天 , 各组均换正
常培养液 , 继续培养 4 d。至培养第 8天 ,于倒置显微镜下观察细
胞形态学改变并拍照。以细胞形态学病变为指标评价 WF对
2215细胞的毒性 , 按 Reed-Muench法将细胞受损百分率高于
25%的认为药物有细胞毒性 , 低于 25%的即认为细胞未受药源
性损伤 , 由此确定最大无毒浓度。收集最大无毒浓度及低于该浓
度 WF培养的各孔上清 ,供 HBsAg和 HBeAg测定用。
2.4　白背叶提取物 WF对 2215细胞分泌 HBsAg和 HBeAg的抑
制作用 [ 6] 取 “ 2.3”中备用上清 ,按 HBsAg和 HBeAg酶联免疫试
剂盒说明书测定 HBsAg和 HBeAg的 OD值。抗原抑制率 、IC50分
别按下式计算。
抗原抑制百分率(%)=细胞对照 OD值 -给药实验 OD值细胞对照 OD值 ×100%
　　(公式一)
IC50 =
lg-1 [ 50-小于 50%抑制百分率B+(大于 50%抑制百分率 -小于 50%抑制百分率)×(A-B)] 　
(公式二)
其中:A=lg(抑制率大于 50%的药物浓度)
　　 B=lg(抑制率小于 50%的药物浓度)
2.5　统计分析 实验结果均以 x±s表示。采用 t检验分析各组
间差异 , P<0.05即认为差异达到显著。
3 　结果
3.1　白背叶提取物WF对 2215细胞的毒性作用 细胞培养 8d
后 , 倒置显微镜下观察 , 见不同浓度的 WF培养导致细胞出现不
同程度死亡 , 其中 150μg/ml组细胞约 98%死亡;75 μg/ml组细
胞约 40%死亡 , 细胞皱缩;37.5 μg/ml组细胞约 15%死亡 , 细胞
皱缩;18.75 μg/ml组及该浓度以下组细胞生长状态与细胞对照
组比较细胞形态无明显改变 ,细胞数量也没有明显减少。
3.2　白背叶提取物 WF对 2215细胞分泌 HBsAg和 HBeAg的抑
制作用 结果见表 1 ～ 2。 WF对 2215细胞分泌HBsAg、HBeAg有
明显抑制作用 , 其作用与浓度呈明显的正相关。 WF浓度在 37.
5, 18.75, 9.38, 4.69, 2.34 μg/ml时 , 对细胞分泌 HBsAg的抑制
率分别为 86.6%, 70.04%, 51.79%, 37.39%, 21.91%, 与细胞对
照组比较均有显著差异 (P<0.01), IC50为 8.61μg/ml;对
HBeAg,药物浓度在 37.5, 18.75, 9.38, 4.69, 2.34 μg/ml时 , 抑制
率分别为 74.79%, 45.46%, 27.13%, 16.25%, 8.68%, 与细胞对
照组比较有显著差异(P<0.01), IC50为 20.87 μg/ml。
表 1　白背叶提取物 WF对 2215细胞分泌 HBsAg的抑制作用( x±s)
组别 药物浓度C/μg· ml-1 OD值
抑制率
(%)
IC50/
μg· ml-1
对照 - 1.932±0.082 - -
提取物 WF 8.61
37.5 0.180±0.010＊＊ 86.60
18.75 0.501±0.013＊＊ 70.04
9.38 0.898±0.149＊＊ 51.79
4.69 0.939±0.198＊＊ 37.39
2.34 0.957±0.200＊＊ 21.91
　　与细胞对照组比较 , ＊＊P<0.01;n=3
表 2　白背叶提取物WF对 2215细胞分泌 HBeAg的抑制作用( x±s)
组别 药物浓度C/μg· ml-1 OD值
抑制率
(%)
IC50/
μg· ml-1
对照 - 2.716±0.121 - -
提取物 WF 20.87
37.5 0.130±0.009＊＊ 74.79
18.75 1.621±0.209＊＊ 45.46
9.38 1.973±0.078＊＊ 27.13
4.69 1.979±0.157＊＊ 16.25
2.34 1.985±0.161＊＊ 8.68
　　与细胞对照组比较 , ＊＊P<0.01;n=3
4　讨论
2215细胞是转染了 HBV-DNA的肝癌细胞, 该细胞株能长期
稳定地分泌 HBsAg、HBeAg, 是目前抗乙肝病毒药物筛选的常用模
型。国外采用 2215细胞株 ,已筛选出有明显抗乙肝病毒作用的核
苷酸类合成药物。张晓刚等 [ 2]研究发现 , 白背叶根水煎液对 2215
细胞的 TC50为 48.25mg/ml,而在 31.25 mg/ml白背叶根水煎液对
2215细胞分泌 HBsAg及 HBeAg的抑制率分别为 58.63%和 78.
29%。本研究发现白背叶提取物 WF在 37.5 μg/ml浓度下对
2215细胞无明显毒性, 但对 2215细胞分泌 HBsAg及 HBeAg的抑
制率分别达到了 86.6%和 74.79%,提示WF可能是白背叶中抑制
2215细胞分泌 HBsAg及 HBeAg的主要有效成分之一。
本研究结果表明白背叶提取物 WF在无明显细胞毒性浓度
范围内 ,对 2215细胞分泌 HBsAg、HBeAg有明显的抑制作用 , 且
该作用与 WF浓度正相关。 结果提示 WF可能是白背叶抗 HBV
的主要活性成分之一。
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.3