全 文 ：2006 年 3 月第 8 卷第 1 期
March.2006 , Vol.8 , No.1 湖北中医学院学报Journal of H ubei Colleg e of TCM
脂含量 ,降低过高血脂对血管内皮所产生的损伤;防止
内皮激活 ,维持血管内皮及内皮细胞的正常形态;阻止
单核细胞激活 ,避免单核细胞向皮下迁移转变为巨噬细
胞。有观点认为 ,正常动脉内膜中会出现巨噬细胞 ,它
可能类似于肺泡巨噬细胞和肝枯否氏细胞等属于“常驻
细胞”[ 8] ,但是本实验没有发现“正常”的巨噬细胞 。此
外 ,固本化痰方能否阻止单核细胞粘附于血管内皮表
面 ,即单核巨噬系统参与疾病发生的最初反应 ,尚有待
进一步证实。
参考文献:
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2002.125.
[ 2] 　青木延雄 ,北辙 ,沼野藤夫.勭衇硬化研究の最近の进步[ J] .日本内
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Springer-Verlag.1989.753.
(收稿日期:2005-11-16　　编辑:林　飞)
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目 , [ 30271590] 。
　　作者简介:田峦鸢(1979-),男 ,湖北中医学院药学院 2003级硕士研究生。
＊通讯作者:陈家春 ,男 ,教授 , T el:027-61033112。
紫红獐牙菜醋酸乙酯部位体外抗乙型肝炎病毒作用的研究
田峦鸢1 , 黄凤娇1 , 张秀桥1 , 赵艳玲2 , 陈家春＊
(1.湖北中医学院 , 湖北 武汉 430061;
2.中国人民解放军 302 医院 , 北京 100039;
3.华中科技大学同济药学院 , 湖北 武汉 430030)
　　摘要:目的　观察紫红獐牙菜醋酸乙酯部位抗乙型肝炎病毒的作用。方法　在对 2215 细胞最大无毒浓度范围内 , 将
含有不同浓度醋酸乙酯提取物的 DMEM 培养液加入 2215 细胞共同培养 8 天。采用固相放免实验方法 , 检测药物对 2215
细胞 HBsAg和 HBeAg 表达的作用。结果　供试品对乙型肝炎病毒转染的 2215 细胞培养液中 HBsAg 、HBeAg 的选择指
数(SI)分别为 5.13 和 4.08。结论　紫红獐牙菜醋酸乙酯部位在体外有抗 HBV 的作用。
　　关键词:紫红獐牙菜;2215 细胞;HBV
中图分类号:R285.5　　　　　文献标识码:A　　　　　　文章编号:1008-987X(2006)01-0005-03
Inhibitory Ethyl Acetate Effect of the Extracts of Swertia Punicea
Hemsl on Hepatitis B Virus in Vitro
T IAN Luan-yuan1 , HUANG Feng-jiao1 , ZHANG Xiu-qiao1 , e t al
(1.Hubei Co llege o f T raditional Chinese Medicine ,Wuhan 430061
2.302 H ospital o f The Chinese Peoples Libe ration A rmy , Peking 100039
3.Schoo l o f Pharmacy , Tong ji Medical College , Huazhong Unive rsity o f Science and Technolo gy ,Wuhan 430032)
　　Abstract:Objectiv e:To estimate the anti-hepa titis o f the Ethyl Ace tate ex tract o f S wertia p unicea Hemsl.Methods:
The 2215 cells we re treated with the varied concentr ation of the Ethyl Ace ta te ex trac t o f S wertia punicea Hemsl below the
maximum nontox ic concentration for 8 day s.Culture fluid w as collected and the contents o f H BsAg and HBeAg w ere
determined by using radioimmunoassay kit respec tively.Results:The Selective Index of the inhibited effect o f S wertia
p unicea H emsl on H BsAg and HBeAg in the cultured hepa to ca rcinoma cell line 2215(H ep G2)which w as gene transfer ed
with Hepatitis B V irus w ere 5.13 and 4.08.Conclusion:The Ethyl Acetate ext ract o f S wertia punicea H emsl is effectiv e in
inhibiting HBV replication in vitr o.
Key words:S wertia punicea Hemsl;2215 cell;Hepatitis B V irus
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湖北中医学院学报 2006 年第 8 卷第 1 期
　　紫红獐牙菜(Swertia puricea Hemsl)来源于龙胆
科獐牙菜属植物 ,在我国民间长期用于治疗肝炎 ,同时
对胆囊炎也有较显著疗效 。为确定该药抗乙肝病毒的
有效成分 ,笔者对其进行了系统分离 ,观察了醋酸乙酯
部位对 2215细胞 HBsAg 、HBeAg 表达的抑制作用。
1　材料
1.1　供试品的制备
将紫红獐牙菜全草适当粉碎后 ,用乙醇渗漏提取 。
再将乙醇提取液浓缩至适量后分散于水中 ,依次用石油
醚 、乙醚 、醋酸乙酯萃取后浓缩 。将醋酸乙酯萃取液浓
缩干燥后制得供试品 。
1.2　2215细胞
乙型肝炎病毒(HBV)基因转染人肝癌细胞(Hep
G 2)的 2215 细胞系 ,美国 Mount Sinai医学中心构建 ,
解放军 302医院病毒室引进后自行传代培养 。
1.3　试剂及仪器
DMEM 干粉 、G-418(Gene ticin)、胎牛血清 ,美国
Hyclone Lab 公司产品;HBsAg 、HBeAg 固相放免测
定盒 ,中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品;卡那
霉素 ,华北制药厂产品;二甲基亚砜 , SIGMA 公司产
品;二氧化碳孵箱 ,美国 Shel—Lab产品;γ-计数仪 ,德
国 BECKMAN公司产品。
2　方法
2.1　药物对细胞的毒性试验
试验分无药物细胞对照组和不同浓度药物组 。
2215细胞按 2×105 接种于 96 孔培养板 ,每孔 100μl ,
37℃、5% CO 2 培养 24h ,细胞长成单层后进行实验 。
供试品用培养液配制成 2000μg/ml溶液 ,2倍稀释加入
96孔细胞培养板 ,共 8 个梯度 ,每梯度 3个复孔 。第 4
天换原浓度含药培养液 ,第 8 天显微镜下观察细胞病
变 ,完全破坏为 4;75%破坏为 3;50%破坏为 2;25%
破坏为 l;无病变为 0[ 1] 。计算各梯度药液平均细胞病
变程度和半数细胞毒性浓度 。
2.2　药物毒性结果计算
计算每浓度药液 3孔平均细胞病变程度和抑制百
分率 。按 Reed-Meuench法计算 TC50(半数毒性浓度)。
TC50=Ant i lo g B+ 50-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C
A=log>50%药物浓度;B=log <50%药物浓度;C=A-B
2.3　供试品对 HBsAg 、HBeAg 的抑制试验
试验设 HBsAg 、HBeAg 阳性对照组 ,阴性对照组 ,
细胞对照组及不同浓度药物组。2215细胞每毫升 100
万个接种于 24 孔细胞培养板 , 每孔 1 ml , 37℃、 5%
CO 2 培养 24h后 ,供试药液无毒浓度下 2 倍稀释 ,醋酸
乙酯提取物 4 个稀释度分别为 250 、 125 、 62.5 、
31.2μg/ml ,每浓度 3复孔 ,37℃、 5%CO 2 培养 4d后 。
收取 4d培养液 ,并换以原浓度含药培养液继续培养 ,第
8 d时收取培养液 ,用固相放射免疫法测定盒测定 ,方法
见说明书 ,用γ-计数仪测定每孔 cpm 值 。
2.4　药物效果计算
计算细胞对照及供试品每浓度 cpm 均值及标准
差 ,抑制百分率(%),半数有效浓度(IC50)及选择指数
(SI)。
　　①抗原抑制百分率(%)=细胞对照组 cpm-给药组 cpm细胞对照组 cpm ×100%
②计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50):
IC50=Anti lo g B+ 50-<50%抑制百分率>50%抑制百分率— <50%抑制百分率×C
A=log>50%药物浓度　B=log <50%药物浓度　C=A-B
　　③供试品在 2215细胞培养内对 HBsAg 和 HBeAg 的选择指数(SI)。
SI=细胞病变毒性 TC50半数有效浓度 IC50
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2006 年 3 月第 8 卷第 1 期
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3　结果
3.1　供试品在 2215细胞培养中的细胞毒性[ 1 ～ 3]
为观察供试品对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌
2215细胞的毒性 ,在接种2215细胞后24h ,加 2倍稀释
药液 。试验自 2000μg/ml开始 , 1000 、500 、 250 、125 、
62.5 、31.2μg/ml 、0(即细胞对照), 4 d换一次药液 ,维
持 8 d ,第八天用显微镜观察细胞病变(CPE)。醋酸乙
酯提取物对 2215细胞最大无毒浓度(TC50)为:250μg/
ml ,半数毒性浓度(TC0)为:841μg/ml。见表 1 。
表 1　药物在 2215细胞培养中对细胞的毒性作用
实验
方法
药物浓度(μg/ml)
2000 1000 500 250 125 62.5 31.2
TC0
μg/ml
TC50
μg/ml
CPE 4 2 1 0 0 0 0 250 841
4 2 1 0 0 0 0
4 2 1 0 0 0 0
破坏率(%)100 50 25 0 0 0 0
3.2　供试品 2215细胞 HBsAg 和 HBeAg 表达的作用
无毒浓度供试品加入 2215 细胞中 ,分别观察第 4 、
第 8天其对 HBsAg 和 HBeAg 表达的抑制作用。实验
结果表明:供试品31.2 、 62.5 、125 、250μg/ml各浓度
组对 2215细胞 HBsAg 表达第 4天的平均抑制率分别
为 6.88%、 2.78%、 -12.52%、 10.25%;第 8天平均
抑制率为 6.50%、 23.83%、 38.00%、 48.49%;对
2215细胞 HBeAg 表达第 4天的平均抑制率为0.87%、
4.22%、 5.52%、 27.05%, 第 8 天平均抑制率为
16.03%、21.18%、25.88%、43.24%。见表 2。
3.3　结论
通过计算可知半数有效浓度 TC50=841μg/ml。培
养 8天时:对 HBsAg 的 IC50 =164μg/ml;HBeAg 的
IC50 =206μg/m;对 HBsAg :SI=TC50/ IC50=5.13>
2:对 HBeAg:SI=TC50/ IC50=4.08>2。由以上计算
结果说明紫红獐牙菜醋酸乙酯部位对乙型肝炎病毒细
胞转染的 2215细胞培养液中 HBsAg 、HBeAg 的抑制
作用为有效。判断标准:SI>2 时为有效 ,SI =1 时为
有毒有效 ,SI<1时为毒性作用强。
表 2　药物对 2215细胞 HBsAg 、HBeAg表达的抑制作用
HBsAg HBeAg
4d 8d 4d 8d
药物浓度
(μg/ml)
cpm
(x±s)
抑制率
(%)
cpm
(x±s)
抑制率
(%)
cpm
(x±s)
抑制率
(%)
cpm
(x±s)
抑制率
(%)
250 10751±748 10.25 9630±609＊＊ 48.49 4404±439＊ 27.05 5790±1154＊ 43.24
125 13479±840 -12.52 11592±579＊ 38.00 5703±709 5.52 7561±1536 25.88
62.5 11646±964 2.78 14240±625 23.83 5782±149 4.22 8040±359 21.18
31.2 11155±504 6.88 17481±720 6.50 5984±773 0.87 8565±882 16.03
细胞对照组 11979±697 ——— 18696±2655 ——— 6037±484 ——— 10201±2068
　　与细胞对照组比较 , ＊＊P<0.01;＊P<0.05。
4　讨论
本研究结果表明 ,紫红獐牙菜醋酸乙酯部位有一定
的体外抗 HBV活性 ,对乙型肝炎病素细胞转染的 2215
细胞培养溶剂化物中 HBsAg 、HBeA g 有抑制作用 。然
而在该供试品的多种复杂成分中 ,要确定其具体有抗
HBV 活性的有效单体还有待进一步研究。
参考文献:
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(收稿日期:2005-10-28　　编辑:郑晓屏)
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