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阿魏侧耳胞外多糖生物活性初步研究



全 文 :文章编号:1001 - 4829(2014)04 - 1433 - 05
收稿日期:2014 - 03 - 27
基金项目:河北省高等学校科学技术研究指导项目(Z2014049);廊
坊市科学技术研究与发展计划项目(2011012003);廊坊师范学
院博士基金项目(LSZB201105)
作者简介:王 晶(1983 -),女,山东东平人,博士,讲师,研究
方向为动物细胞工程和生物活性物质,E-mail:oucflora@ 163.
com,电话:15127677708,* 为通讯作者。
阿魏侧耳胞外多糖生物活性初步研究
王 晶,常世民,闫训友* ,张 琨,朱柳杨
(廊坊师范学院生命科学学院,河北 廊坊 065000)
摘 要:本文研究了阿魏侧耳液体发酵胞外多糖的生物活性。液体深层发酵和乙醇萃取法制备阿魏侧耳胞外多糖,小鼠经灌胃给
药,采用血液分析仪、体外孵育等方法,测定血液中白细胞数量、腹腔巨噬细胞吞噬能力和免疫器官指数;利用显微观察、细胞计数
和纸片琼脂法等研究阿魏侧耳胞外多糖对肿瘤细胞、细菌和真菌生长的影响。结果表明:与对照组相比,灌胃 100 和 200 mg /kg的
阿魏侧耳胞外多糖可显著提高小鼠血液白细胞数量(P < 0. 05)、增加免疫器官指数(P < 0. 05)和增强巨噬细胞吞噬能力(P <
0. 05);40 ~ 80 g /L阿魏侧耳胞外多糖对枯草芽孢杆菌的生长有一定的抑制作用;5 ~ 80 mg /L阿魏侧耳胞外多糖对体外培养的人
胃癌细胞和人宫颈癌细胞的存活无明显影响作用。因此,一定浓度阿魏侧耳胞外多糖可提高小鼠的免疫能力,抑制枯草芽孢杆菌
的生长,但对其他供试细菌、真菌和体外培养的肿瘤细胞的生长无明显影响作用。
关键词:阿魏侧耳;胞外多糖;免疫能力;癌细胞;细菌
中图分类号:Q946. 3;Q952. 6 文献标识码:A
Bioactivitiy of Extracellular Polysaccharides Produced by Pleurotus ferulae Lanzi
WANG Jing,CHANG Shi-min,YAN Xun-you* ,ZHANG Kun,ZHU Liu-yang
(College of Life Sciences,Langfang Normal University,Hebei Langfang 065000,China)
Abstract:In this paper,the bioactivity of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi was studied. Extracellular poly-
saccharides,which were ethanolic extracts,were prepared from submerged fermentation culture medium of Pleurotus ferulae Lanzi and intra-
gastrically administered to mice. The number of leukocytes in blood,peritoneal macrophage phagocytic activity and weight index of immune
organ were examined with automatic blood analyzer and incubation in vitro,et al. Effects of extracellular polysaccharides produced by Pleuro-
tus ferulae Lanzi on tumor cells,bacteria and fungi were examined with microscope,cell counting or the agar diffusion method. The results
showed that extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi at the concentration of 100 and 200 mg /kg obviously increased
the number of leukocytes in blood (P < 0. 05)and the weight index of spleen and thymus gland (P < 0. 05)and enhanced the phagocytic
activities of murine peritoneal macrophage(P < 0. 05). Extracellular polysaccharides in concentration range of 40 - 80 g /L could inhibit the
proliferation capacity of Bacillus subtilis,but extracellular polysaccharides in concentration range of 5 - 80 mg /L had no influence on the sur-
vival of MGC80-3 and Hela229. It was concluded that extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi in certain concentra-
tion range could enhance the immune function of mice and inhibit the proliferation capacity of Bacillus subtilis but had no effect on the growth
of the other tested bacteria,fungi or tumor cells cultured in vitro.
Key words:Pleurotus ferulae Lanzi;Extracellular polysaccharides;Immune function;Tumor cell;Bacteria
阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lanzi )又称为白灵
菇,隶属于真菌门,担子菌纲,伞菌目,口蘑科,侧耳
属,学名准葛尔阿魏侧耳,是一种珍稀的食药用真
菌,具有抗肿瘤和提高机体免疫力等多种生物学功
能[1]。阿魏侧耳胞外多糖是从阿魏侧耳发酵液中
提取的多糖类型,目前,对于阿魏侧耳胞外多糖的研
究多集中于制备工艺的优化及其化学性质鉴
定[2 ~ 3],未见阿魏侧耳胞外多糖生物活性的相关报
道。本工作利用实验室制备的阿魏侧耳胞外多糖,
测定灌胃给药小鼠的多项免疫功能指标以及受试肿
瘤细胞、细菌和霉菌的生长情况,研究阿魏侧耳胞外
多糖对小鼠免疫能力的调节作用,对体外培养的肿
瘤细胞、细菌和真菌生长的影响作用。
3341
2014 年 27 卷 4 期
Vol. 27 No. 4
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2014.04.078
1 材料与方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 试验材料 阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lan-
zi)菌种由中科院菌种保藏中心提供,本院生物技术
实验室保存。大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆
菌、酿酒酵母、热带假丝酵母和青霉菌均由我院微生
物实验室保藏。BALB /C 小鼠 6 ~ 8 周龄,雄性,体
重 24 ~ 27 g,购自北京维通利华实验动物技术有限
公司。人胃癌细胞 MGC80-3 和人宫颈癌细胞 Hela
229,购自中国科学院细胞库。鸡血红细胞悬液,参
照杨汉民等[4]方法并改进后制备:鸡翅下静脉抽
血,Alsever’s 溶液抗凝,离心,弃上层液体和中层细
胞层(血小板和白细胞),8. 5 g /L NaCl 溶液调节细
胞密度至 1 × 1010个 /L。四季青胎牛血清(FBS),
浙江天杭生物科技有限公司;RPMI 1640,美国 Gib-
co公司;胰蛋白酶,美国 Amresco 公司;0. 22 μm 针
头过滤器,美国Millipore公司;细胞培养瓶和细胞培
养板,美国 Corning公司;实验中所用其他试剂均为
分析纯。
1. 1. 2 仪器 BC-3000Plus 全自动血液分析仪,深
圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;FD-1D-50 真空
冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;ZHJH-
C超净工作台,上海智城分析仪器制造有限公司;
BX50 系统显微镜和 CKX41SF 倒置显微镜,日本 O-
lympus公司;MCO-20AIC 二氧化碳培养箱和 MLS-
3750 高压蒸汽灭菌锅,日本 SONYA 公司;MJ-160B
型,上海跃进医疗器械厂;Milli-Q 超纯水机,美国
Millipore公司。
1. 1. 3 培养基 阿魏侧耳种子培养基 (g /L):马铃
薯 200,葡萄糖 20,蛋白胨 4,KH2HPO4 3,MgSO4 1.
5,琼脂 15,pH自然。阿魏侧耳液体发酵培养基 (g /
L):马铃薯 200,葡萄糖 20,蛋白胨 4,MgSO4 1. 5,
KH2HPO4 3,VB1 0. 05,pH 自然。细菌培养基 (g /
L):牛肉膏 5、蛋白胨 10、NaCl 5、琼脂 20,pH 7. 0。
真菌培养基 (g /L):马铃薯 200、葡萄糖 20(酵母)
或蔗糖 20(霉菌)、琼脂 20,pH 7. 0。
RPMI1640 培养液(g /L):RPMI 1640 10. 4、
NaHCO3 2. 0、青霉素 0. 06(100 U /mL)、链霉素 0. 1
(100 U /mL),pH 7. 2。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 阿魏侧耳胞外多糖和多糖母液的制备 阿
魏侧耳菌种活化、平板扩大培养和摇瓶培养:参照闫
训友等[5]实施。阿魏侧耳胞外多糖的提取:菌种于
25. 6 ℃震荡培养 7 d 后,4000 r /min,离心 20 min,
取上清液浓缩至原体积的 1 /4,用终浓度为 75 %的
乙醇萃取 2. 5 h,离心后得粗多糖沉淀,所得沉淀经
乙醚洗涤,离心、真空冷冻干燥后得阿魏侧耳胞外粗
多糖制品。收集阿魏侧耳胞外粗多糖,分别用 9 g /L
NaCl溶液和 RPMI 1640 培养液溶解,0. 22 μm 针头
过滤器过滤除菌,冰箱中冷藏备用。
1. 2. 2 细胞培养 人胃癌细胞 MGC80-3 和人宫颈
癌细胞 Hela229 细胞的培养与传代:含 10 %(体积
分数)FBS 的 RPMI 1640 完全培养液,37 ℃,5 %
CO2,贴壁培养,2 ~ 3 d 传代 1 次。传代方法:取对
数生长期的细胞,吸弃旧培养液,磷酸缓冲溶液
(PBS)漂洗,2. 5 g /L 胰蛋白酶溶液处理 1 ~ 2 min,
吸弃胰蛋白酶溶液,含 10 % FBS 的 RPMI 1640 完
全培养液吹打悬浮,以二分之一的细胞密度接种至
新细胞培养瓶中。
细菌和霉菌的活化和菌悬液的制备:挑取保藏
菌种,用划线法接种至斜面培养基上,37 ℃(细菌)
或 28 ℃(霉菌和酵母菌)培养,活化菌种,待斜面长
满菌落,活化结束;挑取活化后的菌株,接种至种子
培养基,细菌置 37 ℃培养 24 h,霉菌和酵母菌置 28
℃培养 48 h后,用接种环挑取受试菌种放入无菌水
中,振荡均匀,制成终浓度约为 1010 ~ 1011 cfu /L 的
供试菌悬液,备用。
1. 2. 3 构建小鼠模型及给药 BALB /C 小鼠 40
只,适应性饲养 3 d,随机分为 4 组:对照组、高剂量
多糖组、中剂量多糖组和低剂量多糖组。各组小鼠
均自由摄食饮水,对照组每天灌胃无菌生理盐水溶
液;多糖组每天分别灌胃 200、100 和 50 mg /kg 的无
菌阿魏侧耳胞外多糖溶液(0. 9 g /L NaCl 溶液配
制),连续 15 d。灌胃第 15 天,准确称量动物体重量
后,腹腔注射 1 mL鸡血红细胞悬液,轻柔小鼠腹部,
30 min后采血,测定血液中白细胞数量,采血后处死
小鼠,取腹腔液、脾脏和胸腺,进行腹腔巨噬细胞吞
噬功能、免疫器官指数测定。
1. 2. 4 白细胞数量测定 眼底取血,肝素钠抗凝,
全自动血液分析仪测定各实验组小鼠血液中白细胞
数量[6 ~ 7]。
1. 2. 5 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 采用鸡血
红细胞吞噬法[4,8]:75 %(体积分数)乙醇浸泡处理
小鼠,收集小鼠腹腔液(含腹腔巨噬细胞)后制备腹
腔液涂片,湿盒中 37 ℃恒温孵育 30 min,PBS 漂洗
去未贴附细胞,Carnoy 固定液(甲醇和冰醋酸的体
积比为 3∶ 1)固定 10 min,Giemsa 染液染色 10 min,
流水冲洗,甘油封片后镜检,统计细胞数量。以吞噬
鸡血红细胞的腹腔巨噬细胞数量和腹腔巨噬细胞总
数的比值表示小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率(%)。
1. 2. 6 免疫器官指数测定 取胸腺和脾脏,去除周
4341 西 南 农 业 学 报 27 卷
围脂肪和结缔组织后,称重(湿重),以胸腺或脾脏
重量(g)和动物体重(g)的比值表示小鼠的胸腺指
数和脾脏指数[9]。
1. 2. 7 肿瘤细胞的接种及多糖处理 取对数生长
期的肿瘤细胞,胰蛋白酶消化,台盼蓝染色,统计活
细胞数量,含 10 % FBS 的 RPMI 1640 完全培养液
调整细胞密度为 1 × 108 个 /L,接种至 24 孔细胞培
养板中,每孔 1 mL,37 ℃,5 % CO2 培养箱中静置培
养 24 h后,弃培养上清,每孔添加不含血清的 RPMI
1640 培养液 1 mL,饥饿培养 12 h(细胞同步化),弃
培养上清,加入含 10 % FBS 的 RPMI 1640 完全培
养液,同时添加终浓度分别为 0、5、10、20、40、80
mg /L的阿魏侧耳胞外多糖(RPMI 1640 培养液配
制),继续培养 72 h。每隔 24 h,收集细胞,台盼蓝
染色,血球计数板统计活细胞数量。
1. 2. 8 阿魏侧耳胞外多糖对细菌和真菌生长的影
响 采用纸片琼脂法:湿热灭菌的培养基倒入平皿,
冷却凝固后备用。6 mm 圆形滤纸片,灭菌烘干后,
分别放入浓度为 10、20、40、80 mg /mL 多糖溶液和
无菌水中充分浸泡约 1 ~ 2 h。取各受试菌悬液于平
板上(每板接种量为 1 × 107 个),无菌涂布棒涂布均
匀,晾干备用。无菌操作放置浸有供试液和无菌水
滤纸片于各含菌平板上,每板贴 5 片,每个浓度设 3
次重复,细菌于 37 ℃恒温培养箱中培养 24 h,霉菌
和酵母菌于 28 ℃恒温培养箱中培养 48 h,取出,观
察有无抑菌圈产生,并测量抑菌圈直径,计算其平均
值。
1. 2. 9 统计方法 数据以平均数 ±标准差表示(珋x
± s),用软件 SPSS20. 0 进行 t检验。P < 0. 05,表示
差异性显著。
2 结果与分析
2. 1 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠部分免疫功能指标
的影响
白细胞是一类无色有核的血细胞,包括粒细胞、
单核细胞和淋巴细胞,在机体的防御反应中发挥重
要作用[10]。研究结果显示,中剂量多糖组和高剂量
多糖组小鼠血液中白细胞数量和淋巴细胞数量均明
显增加(P < 0. 05)。
巨噬细胞通过吞噬作用和分泌多种生物活性物
质,在机体的免疫防御过程中发挥细胞免疫功能,活
化后的巨噬细胞吞噬功能显著增强[11]。研究结果
显示,高剂量和中剂量多糖可明显增强小鼠腹腔巨
噬细胞的吞噬能力(P < 0. 05)(表 1) ,低剂量多糖
对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力无明显影响,表明
高剂量和中剂量的阿魏侧耳胞外多糖可显著活化小
鼠腹腔巨噬细胞,增强其吞噬细胞或异物的能力,提
高机体的细胞免疫能力。
脾脏和胸腺是机体重要的淋巴器官,其中的淋
巴细胞在获得性免疫应答中发挥重要作用。由表 1
可知,与对照组组相比,中剂量多糖和高剂量多糖均
可不同程度的促进小鼠胸腺和脾脏 2 种免疫器官的
增重,提高小鼠的胸腺指数(P < 0. 05)和脾脏指数
(P < 0. 05),低剂量多糖对小鼠的免疫器官指数无
显著影响(P > 0. 05),表明一定剂量的阿魏侧耳胞
外多糖可增加胸腺和脾脏的质量以及淋巴细胞数
量,进而增强机体获得性免疫能力。
2. 2 阿魏侧耳胞外多糖对体外培养的肿瘤细胞生
长影响
结果显示,与对照组相比,终浓度为 5 ~ 80 mg /
L阿魏侧耳胞外多糖处理 24 ~ 72 h,对体外培养的
人宫颈癌细胞 Hela229 和人胃癌细胞 MGC80-3 的
形态(图 1)和生长(图 2)无明显影响作用。
2. 3 阿魏侧耳胞外多糖对细菌和真菌生长的影响
采用纸片琼脂片法研究阿魏侧耳胞外多糖对大
肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、热
带假丝酵母和青霉等多种细菌和真菌生长的影响,
结果显示,40 ~ 80 g /L 阿魏侧耳胞外多糖对枯草芽
孢杆菌的生长具有一定的抑制作用,而对上述其他
5 种细菌和真菌的生长无明显抑制作用。
表 1 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠免疫功能指标的影响(珋x ± s,n =10)
Table 1 Effects of modulation of EPP on immune function of mice
测定指标
Measuring indexes
对照组
Control
低剂量多糖组
50 mg /kg of EPP
中剂量多糖组
100 mg /kg of EPP
高剂量多糖组
200 mg /kg of EPP
白细胞数量(1 × 109 个 /mL)
Number of leukocytes in blood 3. 17 ± 0. 21 3. 33 ± 0. 15 4. 93 ± 0. 06
* 4. 70 ± 0. 08*
腹腔巨噬细胞吞噬百分率(%)
Phagocytic activities of murine peritoneal macrophage 33. 07 ± 1. 47 34. 40 ± 1. 51 37. 53 ± 1. 43
* 45. 20 ± 1. 46*
胸腺指数(1 × 10 -3)
Weight index of thymus gland 1. 76 ± 0. 41 1. 80 ± 0. 31 2. 20 ± 0. 38
* 2. 44 ± 0. 33*
脾脏指数(1 × 10 -3)
Weight index of spleen 8. 05 ± 0. 55 8. 08 ± 0. 47 8. 72 ± 0. 37
* 9. 12 ± 0. 52*
注:“* ”表示与对照组相比 P < 0. 05。
Note:‘* ’:Compared with control,P < 0. 05.
53414 期 王 晶等:阿魏侧耳胞外多糖生物活性初步研究
A.对照组 Hela229;B. 80 mg /L阿魏侧耳胞外多糖处理组 Hela229;C.对照组 MGC80-3;D. 80 mg /L阿魏侧耳胞外多糖处理组 MGC80-3
A,Hela229,control;B. Hela229 treated by EPP at the concentration of 80 mg /L;C. MGC80-3,control;D. MGC80-3 treated by EPP at the concen-
tration of 80 mg /L
图 1 阿魏侧耳胞外多糖处理 24 h后 Hela229 和MGC80-3 细胞形态
Fig. 1 Morphology of Hela229 and MGC80-3 after treatment of EPP for 24 h
60
45
30
15




( ×
10
7

/L

24 48 72
培养时间(h)
24 48 72
培养时间(h)
40
30
20
10




( ×
10
7

/L

对照
20 mg/L
5 mg/L
40 mg/L
10 mg/L
80 mg/L
对照
20 mg/L
5 mg/L
40 mg/L
10 mg/L
80 mg/L
A B
图 2 阿魏侧耳胞外多糖对 Hela229 (A)和MGC80 (B)生长的影响
Fig. 2 Effect of EPP on the growth of Hela229 and MGC80-3
表 2 阿魏侧耳胞外多糖抑菌圈直径(珋x ± s)
Table 2 Antimicrobial ring diameter of EPP(珋x ± s)
供试菌种
多糖浓度(g /L)
0 10 20 40 80
大肠杆菌 Escherichia coli - - - - -
金黄葡萄球菌 Staphylococcus aureus - - - - -
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis - - - 8. 3 ± 0. 58 12. 5 ± 0. 50
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae - - - - -
热带假丝酵母 Candida tropicalis - - - - -
青霉 Penicillium glaucum - - - - -
注:“ -”表示抑菌环不明显或无抑菌环。
Note:‘ -’:Antibiotic cyclome diameter was insignificant or did not exist.
6341 西 南 农 业 学 报 27 卷
0.空白对照组;1. 10 g /L阿魏侧耳胞外多糖组;2. 20 g /L阿魏侧
耳胞外多糖组;3. 40 g /L阿魏侧耳胞外多糖组;4. 80 g /L阿魏侧
耳胞外多糖组
0. control;1. EPP at the concentration of 10 g /L ;2. EPP at the con-
centration of 20 g /L;3. EPP at the concentration of 40 g /L;4. EPP
at the concentration of 80 g /L
图 3 阿魏侧耳胞外多糖对枯草芽孢杆菌的抑菌圈
Fig. 3 Antibacterial effect of EPP against Bacillus subtilis
3 讨论与结论
多糖是自然界中含量最丰富的大分子聚合物之
一,广泛分布于动植物和微生物中;根据在细胞中存
在部位不同,多糖分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外多
糖 3 种。研究发现,真菌多糖具有免疫调节、抗肿
瘤、抗氧化以及抑菌(真菌或细菌)活性[12 ~ 17],与胞
内多糖不同,真菌胞外多糖易与菌体分离,可通过深
层发酵获得[18 ~ 20],利用液体深层发酵技术,经提取,
浓缩、透析及冷冻干燥后获得的阿魏侧耳胞外多糖,
进行了体内动物试验和体外试验,研究结果发现,中
剂量(100 mg /kg)和高剂量(200 mg /kg)阿魏侧耳
胞外多糖对小鼠的血液白细胞数量、腹腔巨噬细胞
吞噬能力和免疫器官指数都具有显著的提高或增强
作用(P < 0. 05),而低剂量胞外多糖对实验测定的
各种免疫功能指标无明显影响作用,这与邓春生等
人的研究结论相似[21];5 ~ 80 mg /L 阿魏侧耳胞外
多糖对体外培养的 Hela229 和 MGC80 的生长无明
显影响作用(P > 0. 05),这与王金辉等人的研究结
果一致[22],而阿魏侧耳胞外多糖抗肿瘤活性可能是
通过提高机体免疫力实现的[21 ~ 22]。40 ~ 80 g /L 阿
魏侧耳胞外多糖对枯草芽孢杆菌的生长具有一定的
抑制作用,但 10 ~ 80 g /L阿魏侧耳胞外多糖对大肠
杆菌、金黄葡萄球菌、酿酒酵母、热带假丝酵母和青
霉等多种细菌和真菌生长的无明显抑制作用。
因此,从阿魏侧耳液体发酵培养液中获得的胞
外多糖在一定的浓度范围内具有增强小鼠免疫能
力、抑制枯草芽孢杆菌生长的功效,但对体外培养的
Hela229、MGC80 以及多种细菌和真菌的生长无明
显影响作用。
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( 责任编辑 陈 虹)
73414 期 王 晶等:阿魏侧耳胞外多糖生物活性初步研究