全 文 ：·论著·
收稿日期:2010-09-10;修回日期:2010-12-14
作者简介:邵旭媛(1983 -), 女 , 汉族 , 福建人。 硕士生(导
师:卢友光)
通讯作者:卢友光 , E-mail:fjlyg63@163.com
稻芽粗提物抑制变异链球菌的体外实验研究
邵旭媛 1, 2 , 俞晓峰 1 , 冯 岩 1 , 林 挺 1 , 苏柏华1 , 卢友光 1
(福建 福州 350002:1.福建医科大学附属口腔医院预防科;2.福建卫生职业技术学院附属医院口腔科)
[摘 要 ] 目的:观察稻芽粗提物对变异链球菌的抑制作用。方法:采用醇提法制取稻芽的药物粗提
物 ,并测量其在不同药物浓度下对变异链球菌生长 、黏附 、产酸等作用的抑制效果。结果:稻芽粗提物抑制变异
链球菌(变链菌)体外生长的最低抑菌浓度(MIC)值为 6.25mg/mL, 当稻芽粗提物浓度≥0.78mg/mL时有较明
显的抑制变链菌黏附的作用 ,当稻芽粗提物浓度≥0.39mg/mL即有较明显的抑制变链菌产酸的作用。结论:
稻芽粗提物对变异链球菌有一定的抑制作用。
[关键词 ] 稻芽粗提物;变异链球菌;黏附;产酸
[中图分类号 ] R780.2 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1005-2593(2011)03-0121-04
[牙体牙髓牙周病学杂志 , 2011, 21(3):121]
InhibitoryefectsofFructusoryzaegerminates
crudeextractsonStreptococcusmutans
SHAOXu-yuan＊ , YUXiao-feng, FENGYan, LINTing, SUBo-hua, LUYou-guang
(＊DepartmentofPreventiveDentistry, theAfiliatedStomatological
HospitalofFujianMedicalUniversity, Fuzhou350002, China)
[ Abstract] AIM:ToinvestigatetheeffectofFructusoryzaegerminatescrudeextractsonStreptococcusmu-
tans.METHODS:Fructusoryzaegerminatuswasextractedbytheethanolmethod.TheefectofFructusoryzaegermi-
natescrudeextractsonthegrowth, adherenceandacidgenerationwasassessedonS.mutansATCC25175.
RESULTS:Theminimalinhibitionconcentration(MIC)ofFructusoryzaegerminatuscrudeextractsonS.mutanswas
6.25 mg/mL.AcidgenerationandadherenceofS.mutanscouldbeinhibitedbyaconcentrationof≥0.39 mg/mLor
0.78mg/mLofthecrudeextracts, respectively.CONCLUSION:Fructusoryzaegerminatuscrudeextractsshowedin-
hibitoryeffectonS.mutans, indicatingthatFructusoryzaegerminatusmayhaveanti-carieseffect.
[ Keywords] fructusoryzaegerminatescrudeextracts;streptococcusmutans;adherence;acidgeneration
[ ChineseJournalofConservativeDentistry, 2011, 21(3):121]
龋病是一种细菌感染性疾病 ,主要致龋菌为变
异链球菌 ,其在菌斑中生长繁殖并最终导致龋病发
生 。多年来人们一直试图采用药物来预防龋病的
发生 ,早期曾使用抗生素类药物 ,虽可达到一定的
防治效果 ,但因长期使用会引起体内菌群失调和诱
发细菌耐药性而不能广泛应用。而天然药物具有
多种生物学功能 ,如抗感染 、抗真菌 、抗病毒和促进
组织再生等 ,且具有相对安全 ,毒副作用小的优点 ,
在龋病防治中的作用日益受到重视 。许多国内外
学者早已开展了天然药物防龋的研究 ,由于具有鲜
明的地域特性 ,各地根据不同的地理环境和国情 ,
发现了不同的具有防龋作用的天然药物 ,如非洲和
中东的榆绿木 、斑鸠菊 、藤黄;拉美国家的血根草 、
可可果;东南亚的槟榔;澳洲的桉叶等;中国和日本
则多集中在中草药 、茶的研究 [ 1] 。在国内 ,乌爱
菊 [ 2] 、黄正蔚 [ 3] 、冯瑾等[ 4]均开展了天然药物防龋
·121·牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2011, 21(3)DOI :10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2011.03.002
的研究 ,表明厚朴 、茶多酚 、五倍子等天然药物对致
龋菌均有一定的抑制作用。本研究在前期对药典
中记载有消炎抗菌作用的 100多种天然药物进行
防龋作用筛选的基础上 ,选取对口腔致龋菌的生长
有较明显抑制功效的稻芽为对象 ,通过细菌体外药
物实验 ,初步探讨稻芽粗提物对变异链球菌生长和
代谢的影响 ,观察其对变异链球菌生长 、黏附 、产酸
作用的抑制效果 ,为进一步研究稻芽在口腔疾病治
疗中的作用奠定基础 。
1 材料和方法
1.1 主要材料和仪器
稻芽(产地福建 ,购自福州市回春参茸行);变
异链球菌国际标准株 ATCC25175(四川大学华西
口腔医学院惠赠);TPY固体 、液体培养基 、蔗糖 、
0.5mol/L磷酸盐缓冲液(福州迈新生物技术开发
有限公司);无水乙醇(分析纯 ,福州伍联科学实验
器材有限公司);天然药物粉碎机(FW135 ,南京菲
奇工贸有限公司);电子天平 (SartoriusBS124S,北
京赛多利斯仪器系统有限公司);电热恒温水浴箱
(HH-S21-8,北京长安科学仪器厂);超净工作台
(SW-CJ-1FD,苏州净化设备有限公司);真空干燥
箱(DZF-6050,上海博讯实业有限公司);旋转蒸发
器 (RE2000,上海亚荣生化仪器厂);厌氧培养箱
(YQX-Ⅱ ,上海新苗医疗器械制造有限公司);酶
联免疫检测仪 (Human,德国);立式压力蒸汽灭菌
器(LDZX-50KBS,上海申安医疗器械厂)。
1.2 方法
1.2.1 稻芽粗提物的制备
原药材烘干后粉碎 ,称取 100g置 1L烧杯中 ,
加入 800mL/L乙醇 500mL,在 55 ～ 60℃水浴中回
流提取 1h后过滤 ,滤渣再用相同的方法提取 ,过
滤 ,合并两次所得滤液 ,回收溶剂 ,负压旋转蒸发至
浸膏状 。
1.2.2 菌悬液制备
将变异链球菌国际标准株 ATCC25175复苏
48h后 ,接种于 TPY液体培养基中 ,于厌氧箱中在
800mL/LN2 、100mL/LCO2、100mL/LH2、37℃条
件下培养 18h,经生化鉴定和涂片检查为纯培养后 ,
将细菌在 TPY固体培养基上传代 ,用无菌棉签取
TPY固体培养基上的二代菌落 ,采用无菌生理盐水 ,
将细菌配制成密度为 0.5号麦氏管浊度的菌悬液 [ 5]
备用 。
1.2.3 稻芽粗提物对变异链球菌生长的影响
将稻芽粗提物以倍比稀释法溶于 TPY液体培
养基中 , 配制成浓度分别为 50、 25、 12.5、 6.25、
3.13、1.56、0.78、0.39mg/mL等 8个浓度的药液 ,
并设置阴性对照管(仅加药液和培养基)和阳性对
照管(仅加菌液和培养基)各一个 。吸取 50μL菌
悬液分别加入实验管和阳性对照管中 ,置于厌氧培
养箱中 ,在 800mL/LN2、100mL/LCO2 、100mL/L
H2 、37℃条件下培养 48 h, 比较不同浓度组药液
(包括阴性对照组和阳性对照组)培养前后的 OD
值之差值 。OD值重复测定 3次取平均值 ,实验重
复做 3次 。以与阳性对照组相比有统计学差异的
最小浓度为最小抑菌浓度(MIC),用统计学方法通
过 OD值来确定最小抑菌浓度(MIC)值。
1.2.4 稻芽粗提物对变异链球菌黏附作用的影响
根据稻芽粗提物对变异链球菌的 MIC测定结
果 ,采用倍比稀释法 ,用含 50g/L蔗糖的 PBS缓冲
液和 TPY液体培养基将稻芽粗提物配成 MIC及以
下 4个浓度梯度的实验组 ,另设一个不含药液的阳
性对照组 ,每组 3个平行管 ,将菌悬液与药液按
1∶50(V/V)接种。各试管混匀 ,与地平面呈 30°,
厌氧箱中(800mL/LN2 , 100mL/LCO2 , 100mL/L
N2 , 37℃)培养 18 h。然后将试管中溶液轻轻移
去 ,将黏附到试管壁的细菌用 PBS缓冲液洗脱 ,每
次 3mL,共计 3次 ,然后以 3 500r/min离心15min,
收集细菌 ,置于 3mL蒸馏水中混匀。各试管均吸
取 200μL于 96孔板 ,用酶标仪测 630 nm波长处
OD值 ,测定 3次 ,取平均值 ,并按下列公式计算黏
附抑制率 。
黏附抑制率(%)=对照组 OD630 -实验组 OD630对照组 OD630 ×100%
1.2.5 稻芽粗提物对变异链球菌产酸作用的影响
根据稻芽粗提物对变异链球菌的 MIC测定结
果 ,采用倍比稀释法 ,用含 5g/L蔗糖的 PBS缓冲
液和 TPY液体培养基将稻芽粗提物配成 MIC和以
下 5个浓度梯度的实验组 ,另设一个不含药液的阳
性对照组 ,每组 3个平行管。用酸度计调整初始
pH值为 7.4,高压灭菌器中 0.1MPa、121.5℃高压
15min,菌悬液与药液按 1∶50(V/V)接种 ,厌氧箱
中(800 mL/LN2 , 100 mL/LCO2 , 100 mL/LN2 ,
37℃)培养 18 h, 培养物经 3 000 r/min离心
15min,用酸度计测定培养物上清液的 pH值 ,并计
算■pH值(初始 pH-终末 pH),以不含药物的培
·122· 牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2011, 21(3)
养基中 pH值的变化作为空白对照 。
1.3 统计学分析
采用 SPSS11.5统计软件进行统计分析 ,各组
总体均数之间比较采用单因素方差分析 , (ANO-
VA, Analysisofvariance);两两比较用 Dunnett检
验 ,检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 稻芽粗提物对变异链球菌生长的影响
在较高浓度下 ,稻芽有较强的抑制变异链球菌
生长的作用 ,随着药物浓度的降低 , OD值差值增
大(表 1),说明对细菌的生长抑制作用降低 。经统
计学检验 (Dunnett检验 ), 当稻芽药液浓度 >
6.25mg/mL时 ,稻芽粗提物对变异链球菌的生长
具有抑制作用(P<0.05),稻芽粗提物抑制变异链
球菌体外生长的 MIC值为 6.25mg/mL。
表 1 稻芽粗提物对变异链球菌生长的影响 ( x±s)
浓度(mg/mL) OD值差值 P值
50.00 0.32±0.25＊ 0.01＊
25.00 0.31±0.25＊ 0.01＊
12.50 0.39±0.30＊ 0.03＊
6.25 0.40±0.31＊ 0.03＊
3.13 0.64±0.51 0.22
1.56 0.64±0.52 0.22
0.78 0.86±0.10 0.75
0.39 0.91±0.12 0.86
阴性组＊ 0.01±0.02 0.00
阳性组 1.16±0.02 -
＊与阳性对照组相比 P<0.05, OD值差值为厌氧培养 48h后
OD值减去刚加菌时的 OD值
2.2 稻芽粗提物对变异链球菌黏附作用的影响
随着稻芽粗提物浓度的升高 ,黏附抑制率也随
之增高(表 2),经统计学检验 ,各浓度组黏附的 OD
值总体均数不全相等 (F=140.09, P=0.00),经
Dunnett检验 ,当稻芽粗提物浓度≥0.78 mg/mL
时 ,与对照组相比具有明显的抑制变异链球菌黏附
的作用(P<0.05)。
表 2 不同浓度稻芽粗提物对变异链球菌黏附作用的影响( x±s)
浓度(mg/mL) OD值 黏附抑制率(%)
6.25 0.30±0.03＊ 51
3.13 0.33±0.01＊ 46
1.56 0.39±0.01＊ 37
0.78 0.55±0.03＊ 12
0.39 0.58±0.03 6
对照组 0.62±0.02 -
＊与对照组相比P<0.05
2.3 稻芽粗提物对变异链球菌产酸作用的影响
随着稻芽粗提物浓度的升高 , ■pH越来越小
(表 3),经统计学检验 ,各浓度组产酸的 OD值总
体均数不全相等 (F=81233.55, P=0.00), 经
Dunnett检验 ,当稻芽粗提物浓度 ≥0.39mg/mL
时 ,与对照组相比具有明显的抑制变异链球菌产酸
的作用(P<0.05)。
表 3 不同浓度稻芽粗提物对变异
链球菌产酸作用的影响 ( x±s)
浓度(mg/mL) ■pH P
3.13 0.11±0.01＊ 0.00＊
1.56 0.13±0.01＊ 0.00＊
0.78 0.13±0.01＊ 0.00＊
0.39 3.33±0.01＊ 0.01＊
0.18 3.36±0.01 0.77
阳性对照组 3.36±0.01 -
＊与阳性对照组相比P<0.05, ■pH=初始 pH值 -培养 18h后
pH值
3 讨论
变异链球菌具有多种菌体表面黏附物质 ,包括
有脂磷壁酸 、葡聚糖连接蛋白 、葡糖基转移酶等 ,以
黏附素形式与获得膜表面有机受体结合 ,定植在牙
表面 ,同时也与其他菌种共聚 ,促使菌斑形成 。其
中葡糖基转移酶能利用口腔内的碳水化合物 ,特别
是蔗糖 ,合成可溶性与不可溶性葡聚糖 ,构成菌斑
基质 ,同时可吸附更多细菌 ,促使菌斑形成 。而且 ,
变异链球菌具有磷酸转移系统 ,可快速运输糖 ,进
入胞内 ,一部分快速代谢产酸 ,另一部分合成细胞
内多糖 ,作为糖原储备 ,待胞外缺糖的情况下 ,可继
续产酸 ,这样使口内局部环境的 pH值持续低于脱
矿与再矿化之间的临界 pH值(pH5.0 ～ 5.5),龋
损开始产生 [ 6] 。在我国 ,中草药资源丰富 、分布广
泛 、毒副作用低 ,引起了龋病预防工作者的重视 ,并
已对厚朴酚 [ 4] 、五倍子 、蜂房 [ 7]等进行了深入研
究 ,结果表明:多种药物可通过抑制致龋菌的生长 、
产酸能力 、在牙面的黏附和聚集 、抑制细菌胞内外
多糖的产生等机制来预防龋病的发生。本研究通
过对变异链球菌的生长 、黏附 、产酸等特性来研究
稻芽粗提物对变异链球菌是否有抑制作用 ,从而探
讨稻芽作为防龋天然药物的可能性。
天然药物稻芽(FructusOryzaeGerminates)为
禾本科植物稻的成熟果实经发芽干燥而得 ,因其和
中消食 、健脾开胃的药理作用 ,被广泛的应用于中
·123·牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2011, 21(3)
草药临床 [ 8] 。其性温味甘 ,其所含的淀粉酶能起
到帮助消化的药理作用 ,常用于食积不消 ,腹胀口
臭 ,脾胃虚弱的治疗。近年来 ,有研究表明中药材
稻芽中含有一定量的 γ-氨基丁酸 ,其作为一种抑
制性神经递质 ,对高血压等疾病的防治具有一定的
作用[ 9] 。
本研究采用 800mL/L乙醇进行稻芽有效成分
的粗提 ,以期在获得 γ-氨基丁酸等有效成分的同
时 ,并获得一些其他的水溶性药物成分 ,并通过对
变异链球菌的生长 、产酸 、黏附等特性来研究稻芽
粗提物对变异链球菌是否有抑制作用 ,结果表明:
当稻芽药液浓度 >6.25mg/mL时 ,稻芽粗提物对
变异链球菌的生长具有抑制作用(P<0.05),抑制
变异链球菌体外生长的 MIC值为6.25mg/mL。如
果一种药物能在某个浓度下明显抑制变异链球菌
的生长 ,说明在这个浓度以上的药液对变链菌生长
的抑制能力比较强 ,为了排除药物本身因抑制变链
菌细胞生长而产生的对产酸 、黏附 、产胞外多糖等
的抑制表现 ,采用了在 MIC浓度以下的浓度梯度 ,
即在药物未对变链菌细胞生长发生明显抑制时观
察其抑制变链菌黏附 、产酸等致龋特性的情况 。结
果显示当稻芽粗提物浓度≥0.78mg/mL时 ,与对
照组相比具有明显的抑制变异链球菌黏附的作用
(P<0.05);当稻芽粗提物浓度≥0.39mg/mL时 ,
与对照组相比具有明显的抑制变异链球菌产酸的
作用(P<0.05);且随着药物浓度的增加 ,抑菌作
用更加明显。推测其原因 ,可能是淀粉酶 、γ-氨
基丁酸药物成分作用于菌体表面的黏附物质 ,干扰
其无法与获得膜表面受体的结合 ,减少其在牙面的
定植 ,并且对变异链球菌的磷酸转移系统产生影
响 ,使其无法将糖类运输至胞内产酸 ,进而起到抑
制致龋毒力的作用。本研究为稻芽在口腔防龋方
面的应用做出初步探索 ,而其药物有效成分 、防龋
具体机制的研究还有待于进一步深入 。
参考文献:
[ 1] 周学东 ,刘天佳 ,黄正蔚.天然植物防龋的研究 [ J] .牙体牙髓
牙周病学杂志 , 2003, 13(12):665-667.
[ 2] 翁方敏 ,乌爱菊 ,邵家珏 ,等.中药厚朴的防龋研究 [ J] .口腔
医学, 1983, 3(3):115-116.
[ 3] 黄正蔚 ,周学东 ,肖悦 ,等.11种天然药物对乳酸杆菌生长与
产酸影响的体外研究 [ J].上海口腔医学 , 2005, 14(1):67-
70.
[ 4] 冯瑾 ,李继遥 ,周学东.厚朴活性成分对致龋菌生长和产酸
影响的体外研究 [ J] .四川大学学报(医学版), 2007, 38(3):
456-458.
[ 5] 叶应妩 ,王毓三 ,申子谕.全国临床检验操作规程 [ P] .3版.
南京:东南大学出版社 , 2006:905.
[ 6] 卞金有.预防口腔医学 [ M] .5版 .北京:人民卫生出版社 ,
2008:103-104.
[ 7] 赵今 ,李继遥,朱昞 , 等.中药对口腔细菌生物膜作用的实验
研究[ J] .中华口腔医学杂志 , 2007, 42(10):585-588.
[ 8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 [ S] .北京:化学工
业出版社 , 2005:125.
[ 9] 陈体强 ,吴锦忠 , 徐洁.几种中药材中 γ-氨基丁酸的测定
[ J] .海峡药学 , 2005, 17(5):75-77.
第四军医大学口腔医学院牙体牙髓科国家级继续教育学习班通知
为规范牙科诊疗行为 , 提高牙体 、牙髓和根尖周疾病的治疗水平 ,经卫生部 、中华口腔医学会批准 , 第四军医大学口腔医
院牙体牙髓科将举办系列国家级继续教育学习班 ,对牙科临床的规范化操作以及牙体修复技术 、根管治疗技术 、显微根管外
科技术进行系统培训 ,具体安排如下。
时间:2010年 5月 21 ～ 30日
学习班项目及时间安排:
1.牙科规范化诊疗技术(国 2011-08-01-022):2011年 5月 21 ～ 22日
2.牙体美容修复规范和技巧(口继教字 2011-08):2011年 5月 23 ～ 24日
3.牙体缺损间接修复技术后牙美学修复(国 2011-08-01-23)、嵌体修复技术(口继教字 2011-09):2011年 5月 25 ～
26日
4.疑难根管治疗中的关键技术(国 2011-08-01-25):2011年 5月 27 ～ 28日
5.显微根管外科操作技术(口继教字 2011-10):2011年 5月 29 ～ 30日
联系人:郝秀瑞 , 电话:029-84776080 E-mail:chinaendo@yahoo.cn
·124· 牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2011, 21(3)