全 文 ： 药理药化
收稿日期:2005-10-25;　修订日期:2006-03-30
作者简介:张晓刚(1968-),男(汉族),河北沧州人 ,现任南方医科大学中
医药学院主治中医师 ,博士学位 ,主要从事肝病证的临床和实验研究.
*通讯作者简介:吕志平 (1956-), 男(汉族),广东海丰人 , 现任南方医科
大学中医药学院主任医师 ,硕士学位 ,主要从事学院管理工作.
白背叶根抗乙型肝炎病毒的体外实验研究
张晓刚 , 吕志平* , 谭秦湘 , 钟小兰
(南方医科大学中医药学院 ,广东 广州　510515)
摘要:目的 观察白背叶根体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法 以 H epG2. 2. 15细胞株为模型 ,用微粒酶免疫测定
技术(MEIA)检测细胞培养上清液中 HB sAg、HBeAg含量 , 用 PCR荧光定量技术检测细胞上培养上清液中 HBV DNA的
变化 , 以 MTT比色法观察药物的细胞毒性。 结果 白背叶根对 H epG 2. 2. 15 细胞的 TC50为 48. 25 m g /m l, 对抑制
H epG2. 2. 15细胞分泌 HB sAg和 HBeAg的治疗指数分别为 13. 26和 43. 08。对 HBVDNA仅有微弱抑制作用。 结论 白背
叶根在体外细胞培养中具有直接抗 HBV活性。
关键词:白背叶根;　抗乙型肝炎病毒;　H epG2. 2. 15细胞
中图分类号:R285. 5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2006)08-1437-02
　　白背叶根为大戟科野桐属植物白揪的根 , 在我国分布较广 ,
资源丰富。异名白膜根 、野桐根 ,味微苦 、涩 、性平 ,有清热 、利湿 、
固脱 、消淤等功效。民间常用鲜根水煎服治疗急慢性肝炎。动物
实验证实白背叶根具有较好的抗肝纤维化 、抗肝炎和抗肝伤作
用 [ 1, 2] , 为进一步了解白背叶根对 HBV 复制的影响 , 我们用
H epG2. 2. 15细胞株为模型 , 观察白背叶根体外抗 HBV活性 , 并
对其作用机理初步探讨。
1　材料与方法
1. 1　药物 白背叶根煎煮 , 水浴蒸发浓缩为 2 g /m l, 以 8层细纱
布粗滤后 , 经 1 500 r /m in离心 10 m in,上清液再用定性过滤液纸
粗滤 , 25℃下测 pH值为 5. 09,调节 pH 值为 7. 09, 再经 0. 22 μm
微孔滤膜过滤除菌 , 置于 4℃存放备用。干扰素 α1b(赛若金)由
深圳科兴生物工程股份有限公司提供 , 10万 IU /支(实验用药)。
1. 2　细胞培养 H ep G 2. 2. 15细胞来自南方医科大学(原第一
军医大学)全军病毒性肝炎重点实验室。 将 H epG 2. 2. 15细胞
接种于 DM EM 混合培养液(含 20%胎牛血清 、0. 03%L-谷氨酰
胺 、100 U /m l青霉素 、 100 U /m l链霉素 、 380 μg /m lG418), 置于
37℃、饱和湿度 、5%CO2培养箱中培养。换液 1次 /3 d, 6 ～ 10 d
传代。每次换液留取上清 , 检测 HBV-DNA分泌情况 , 表达稳定
后开始实验。
1. 3　药物对 H epG 2. 2. 15细胞的毒性实验 根据 Sargent JM
等 [ 3]建立的 MTT比色分析法 , 判定各孔中存活细胞增殖代谢情
况及细胞毒性反应。将白背叶根提取液用 DMEM混合培养液分
别稀释成 1 000, 500, 250, 125, 62. 5, 31. 25, 15. 63, 7. 82, 3. 91,
1. 96 mg /m l和 1 000, 500, 250, 125, 62. 5, 31. 25, 15. 63, 7. 82,
3. 91, 1. 96μg /m l等 20个实验浓度 , 培养细胞用胰蛋白酶消化 ,
配制成浓度为 10×104 /m l的细胞悬液接种于 96孔培养板 , 每孔
0. 1 m l, 37℃、饱和湿度 、5%CO2培养 , 于 48 h后换入不同浓度含
药 DM EM混合培养液 , 同时设无药物细胞对照组 , 每浓度 4孔 ,
每 4天换新鲜含药培养液 , 共 2次。第 8天每孔加入 MTT溶液
(1 mg /m l)200μl, 继续在 37℃下孵育 4 h, 终止培养 ,小心吸弃孔
内培养上清 , 然后每孔加入 150μl DMSO,震荡 10 m in, 使结晶物
充分溶解 ,置入酶联检测仪中以 570 nm波长测定各孔光吸收值
(OD值), 重复 3次 , 依照 Reed-M uench法 [ 4]计算药物对 H epG 2.
2. 15细胞的抑制百分率(%)=(细胞对照组平均 A组 -实验组
平均 A值) /细胞对照组平均 A值 ×100%;细胞半数有毒浓度
(TC50)=An tilg[ lgB +(50 -B)的抑制百分率 /(A -B)的抑制百
分率)×C] ×100%,治疗指数(TI)=半数有毒浓度(TC50) /半数
有效浓度( IC50)。 TI>2为有效低毒 , 12为低效低毒 , TI<
2为毒性作用。注:A =lg>50%药物浓度 , B =lg<50%药物浓
度 , C=lg稀释倍数。
1. 4　药物应用 培养细胞用胰岛蛋白酶化 , 配制成浓度为 10 ×
104 /m l的细胞悬液接种于 24孔培养孔 , 每孔 1 m l, 37℃、饱和湿
度 、 5%CO2培养 ,根据药物毒性度验结果 , 于 48 h后换入 6种不
同浓度 (31. 25, 15. 63, 7. 82, 3. 91, 1. 96, 0. 98 m g /m l)的细胞全培
养液 ,阳性对照药物为干扰素 α1b(赛若金 100, 200, 400 IU), 同时
设不含药物的细胞对照组。 每 4天换新鲜含药培养液 , 共 2次 ,
于第 4, 8天留取培养液作为检测标本 -20℃保存 , 同批次试剂同
一时间检测。
1. 5　上清液中 HBsAg, HBeAg的检测 采用微粒酶免疫(ME IA)
测定技术(美国 Abbott公司 AXSYM全自动免疫分析系统及试剂
盒)检测 ,结果以 S /CO值表示。抑制率 =(细胞对照组 S /CO值
-药物组 S /CO值) /细胞对照组 /S /CO值 ×100%。
1. 6　上清液中 HBV-DNA的提取及定量检测 采用 PCR荧光定
量技术检测上清液中 HBV DNA定量。每个浓度重复测定 3次 ,
取平均值。HBV DNA抑制百分率(%)=(细胞对照组平均 A值
-实验组平均 A值) /细胞对照组平均 A值 ×100%。
1. 7　统计学分析 结果用 –x±s表示 , 组间比较用方差分析 ,采用
SPSS11. 0完成。
2　结果
2. 1　白背叶根的细胞毒性实验 结果显示 , 不同浓度的白背叶根
对 H epG2 2. 2. 15细胞均有不同程度的毒性作用 , 随着药物浓度
增高 , 毒性作用逐渐增强 , 图 1显示药物作用 8 d后对 H epG
2. 2. 15细胞的生长抑制情况。白背叶对 HepG2. 2. 15细胞的
TC50为 48. 25 mg /m l。
图 1　白背叶根对 2. 2. 15细胞的抑制作用
2. 2　白背叶对 HBsAg, HBeAg的抑制效果 根据药物的细胞毒性
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LISH IZHEN M EDIC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2006 VOL. 17 NO. 8 时珍国医国药 2006年第 17卷第 8期
实验结果初定确定了用药浓度范围。 从表 1可见 , 白背叶根对 H epG2. 2. 15细胞分
泌的 HB sAg、HbeAg均有抑制作用 ,并且随着药物浓度增加 , 抑制率逐渐增高;随着药
物作用时间的延长 , 抑制率也逐渐增高。在同一浓度下 , 都表现为对 HBeAg的抑制
率高于对 HB sAg的抑制率。白背叶根浓度在 31. 25 m g /m l时作用 4 d对 HBsAg、
HBeAg的抑制率分别达到 26. 27%, 58. 63%(P <0. 01), 作用 8 d对 HBsAg、HBeAg
的抑制率分别达到 59. 74%, 78. 29%(P <0. 01),其 IC50分别为 3. 64, 1. 12 m g /m l, 对
抑制 2. 2. 15细胞分泌 HBsAg和 HBeAg的治疗指数分别为 13. 26和 43. 08。
表 1　白背叶根对 2. 2. 15细胞(10×104)分泌 HB sA g的抑制效果
药物 浓度 HBsAg抗原(S /CO)值　第 4天　　　　　第 8天　 HBsAg抑制率(%)　第 4天　　　　第 8天　
细胞对照 201. 13±9. 19 133. 19±9. 06 0 0
31. 25mg m l- 1 148. 28±3. 37*▲ 53. 61±8. 58*▲ 26. 27 59. 74
15. 63mg m l- 1 149. 81±5. 03*▲ 62. 38±4. 75*▲ 25. 51 53. 17
7. 82mg m l- 1 160. 19±6. 72* 62. 86±3. 63*▲ 20. 35 52. 81
白背叶根 3. 91mg m l- 1 164. 48±2. 01* 66. 21±3. 47*▲ 18. 22 50. 29
1. 96mg m l- 1 166. 13±8. 85* 68. 62±5. 99*▲ 17. 40 48. 48
0. 98mg m l- 1 167. 33±6. 36* 68. 75±9. 50*▲ 16. 81 48. 38
400IU /m l 159. 37±5. 64* 91. 94±4. 13* 20. 76 30. 97
赛若金 200IU /m l 170. 21±8. 59* 96. 65±7. 88* 15. 37 27. 44
100IU /m l 174. 21±4. 27* 98. 53±6. 49* 13. 38 26. 02
　　与细胞对照组比较 , *P<0. 01;与赛若金(500 IU /m l), ▲P <0. 01
表 2　白背叶根对 2. 2. 15细胞(10×104)分泌 HB eAg的抑制效果
药物 浓度 HBeAg抗原(S /CO)值　第 4天　　　　　第 8天　
HBeAg抑制率(%)
　第 4天　　　　第 8天　
细胞对照 53. 95±9. 46 53. 15±6. 68 0 0
31. 25mg m l- 1 22. 32±3. 01*▲ 11. 54±5. 19*▲ 58. 63 78. 29
15. 63mg m l- 1 23. 99±3. 51*▲ 12. 52±9. 47*▲ 55. 53 76. 44
7. 82mg m l- 1 28. 37±1. 58*▲ 14. 91±9. 75*▲ 47. 42 71. 96
白背叶根 3. 91mg m l- 1 31. 72±2. 79 * 15. 82±8. 43*▲ 41. 22 70. 23
1. 96mg m l- 1 35. 95±8. 53* 18. 92±6. 37*▲ 33. 36 64. 42
0. 98mg m l- 1 38. 10±4. 13* 28. 44±9. 49*▲ 29. 38 46. 49
400IU /m l 38. 68±4. 73 * 32. 13±3. 13* 28. 29 39. 56
赛若金 200IU /m l 44. 43±7. 28** 34. 54±7. 04* 17. 65 35. 03
100IU /m l 48. 01±9. 95 40. 65±7. 20** 11. 02 23. 52
　　与细胞对照组比较 , **P<0. 05, *P <0. 01;与赛若金(500 IU /m l), ▲P<0. 01
2. 3　白背叶根对 HBV DNA的抑制效果 如表 3所示 ,白背叶根对 HepG2. 2. 15细胞
分泌的 HBV DNA仅有轻微抑制作用 , 随着药物浓度增加 , 抑制率逐渐增高;随着药
物作用时间的延长 , 抑制率也逐渐增高 , 但与细胞对照组比较 , 无统计学意义。赛若
金 250 IU /m l组及 500 IU /m l组对 H epG2. 2. 15细胞分泌的 HBV DNA有明显抑制作
用 , 并且随着药物作用时间的延长 , 抑制率逐渐增高(作用 4 d时 P <0. 05, 作用 8 d
时 P <0. 01)。
表 3　白背叶根对 2. 2. 15细胞(10×104)分泌 HBV-DNA的抑制效果
药物 浓度 HBV-DNA抗原(×106 /copy m l- 1)第 4天　　　　　　第 8天
HBV-DNA抑制率(%)
第 4天　　　　　第 8天
细胞对照 6. 88±0. 12 7. 29±0. 28 0 0
31. 25mg m l- 1 6. 62±0. 19 6. 91±0. 28 3. 85 5. 13
15. 63mg m l- 1 6. 71±0. 21 7. 02±0. 23 2. 46 3. 58
7. 82mg m l- 1 6. 72±0. 22 7. 06±0. 30 2. 32 3. 53
白背叶根 3. 91mg m l- 1 6. 76±0. 29 7. 10±0. 24 1. 74 2. 52
1. 96mg m l- 1 6. 77±0. 96 7. 13±0. 20 1. 56 2. 14
0. 98mg m l- 1 6. 84±0. 14 7. 21±0. 14 0. 65 1. 08
400IU /m l 4. 58±0. 22* 3. 87±0. 15** 33. 37 46. 96
赛若金 200IU /m l 5. 28±0. 24* 4. 67±0. 19** 23. 26 35. 97
100IU /m l 5. 67±0. 42 5. 50±0. 17 17. 56 24. 55
　　与细胞对照组比较 , *P<0. 05, **P <0. 01
3　讨论
H epG2. 2. 15细胞株是共转染法将克隆的 HBV DNA及抗 G418质粒转染人肝癌
细胞株 H epG细胞所建立的 ,能转录 、翻译 HBV基因 ,并能长期稳定地向培养上清液
中分泌 HB sAg, HBeAg 和完整的 Dane 颗
粒 [ 5] ,是目前国内外公认和常用的体外评价
HBV药物的细胞模型。对 H epG2. 2. 15细胞
培养中 HBV DNA及其抗原的动态分析表
明 [ 6]:细胞外 HBV DNA水平与病毒抗原具
有显著相关性 , 而细胞内 HBVDNA水平与病
毒抗原的相关性无统计学意义。为此 , 我们
选择 H epG2. 2. 15细胞分泌至培养上清液中
HBV DNA及其抗原的变化作为观察指标 , 以
判断白背叶根的抗 HBV疗效。
以往应用 H ep G2. 2. 15筛选抗 HBV药
物的实验多采用 Sou thren杂交 、斑点杂交等
方法测定 HBV DNA, 采用 ELISA方法测定
HBsAg和 HBeAg, 但这些方法存在敏感性
低 、重复性较差等缺点 , 影响了结果的可信
性。本实验采用 PCR方法荧光定量检测
HBV DNA ,采用微粒酶免疫测定技术半定量
检测 HB sAg和 HBeAg, 明显提高了实验结果
的可信度。
本实验结果表明:白背叶根在 48. 25
mg /m l浓度以下 , 对 Hep G2. 2. 15细胞毒性
较低;在浓度为 31. 25, 15. 63, 7. 82, 3. 91,
1. 96、0. 98 m g /m l时对 H ep G2. 2. 15细胞分
泌的 HBV DNA仅有微弱抑制作用 , 而对分
泌的 HBsAg、HBeAg均有明显抑制作用 , 并
随时间和浓度增强 , T I远大于是 2, 表明背叶
根属有效低毒药物 , 是具有潜在的抗 HBV开
发前景的药物。
应用 H ep G2. 2. 15细胞模型进行的药理
学实验只能反映药物对 H ep G2. 2. 15细胞
HBV标志物的抑制作用 ,不能反应体内免疫
系统的调节 , 若再结合体内抗 HBV实验 , 将
更有助于白背叶根抗 HBV的药效评价。
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