全 文 : [收稿日期] 2012-03-30;2012-06-07修回
[基金项目] 国家自然科学基金“黔产显齿蛇葡萄的神经保护物质基础及机制研究”(31060056);贵州省中药现代化科技产业研究开发专项
项目“贵州道地药材独蒜兰繁殖特点及繁殖栽培技术研究”[黔科合社字(2009)5036]
[作者简介] 杨占南(1974-),男,副教授,从事分析化学研究。E-mail:yangzhannan@163.com
*通讯作者:朱国胜(1971-),男,博士,副研究员,硕士生导师,从事药用植物伴生菌及食药用真菌研究。E-mail:zgsah@yahoo.com.cn
[文章编号]1001-3601(2012)07-0373-0069-03
不同产地独蒜兰中维生素含量的评价
杨占南1,桂 阳2,罗世琼1,刘作易3,余正文1,朱国胜2*,田跃辉1
(1.贵州师范大学,贵州 贵阳550001;2.贵州省现代中药材研究所,贵州 贵阳550006;
3.贵州省农业科学院,贵州 贵阳550006)
[摘 要]为了探明不同产地独蒜兰维生素的累积状况,采用高效液相色谱法(HPLC)对11个不同产地
独蒜兰样品中的脂溶性和水溶性维生素的含量进行测定。结果表明:HPLC法能够有效测定独蒜兰的维生
素;样品中VB6和VE的含量较为丰富,分别为115.8~857.2mg/100g和13.4~185.7mg/100g;独蒜兰中
维生素的含量与其形状及大小没有直接的相关性,而不同产地来源的独蒜兰,其维生素的含量差异显著。
[关键词]独蒜兰;维生素;含量;评价;产地
[中图分类号]S682.31 [文献标识码]A
Evaluation of the Contents of Vitamins in Pleione yunnanensis
from Diferent Regions
YANG Zhan-nan1,GUI Yang2,LUO Shi-qiong1,LIU Zuo-yi 3,
YU Zheng-wen1,ZHU Guo-sheng2*,TIAN Yue-hui 1
(1.Guizhou Normal University,Guiyang,Guizhou550001;2.Guizhou Institute of Morden Chinese Medicinal Materials,
Guiyang,Guizhou550006;3.Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang,Guizhou550006,China)
Abstract:To evaluate accumulation of vitamins in P.yunnanensis from different regions,HPLC-DAD
methods were developed for determination of fat soluble and water soluble vitamins.The results showed
that the HPLC method was effective for the determination of vitamins in P.yunnanensis.The contents of
vitamin B6and vitamin E in the samples were abundant,115.8~857.2mg/100g and 13.4~185.7mg/100
g,respectively.The accumulation of vitamin in samples had no relativity with forms and sizes of
P.yunnanensis.But the vitamin contents were of significant differences from different regions.
Key words:Pleione yunnanensis;vitamins;content;evaluation;producing area
独蒜兰〔Pleione yunnanensis(Rolfe)Rolfe〕,又
称一叶兰,兰科多年生草本药用植物。地生或附生,
假鳞茎卵圆形或圆锥形,长2~3cm;花后或开花同
时长出一枚叶片。4~6月开花,直立花序高15~
25cm,花通常单朵,淡紫色或粉红色,唇瓣上有许
多暗紫红色的斑点。独蒜兰分布于云南、四川、贵州
等省海拔900~2 800m处的山坡林下或沟谷石壁
上[1],以假鳞茎入药,具有清热解毒、消肿散结、舒筋
活血的功效,可用于痈肿疗毒、治疗淋巴结核、跌打
损伤、蛇虫咬伤等[2]。近年来,由于遭到毁灭性的采
挖,独蒜兰被列入《濒危野生动植物物种国际贸易公
约》的保护范围[3]。独蒜兰无菌播种与组织培养研
究取得的进展为其野生资源的保护以及药用资源的
获得指明了方向[4];同时,有关独蒜兰的化学成分及
药理研究也已有报道[5]。独蒜兰具有丰富的维生素
等营养成分,但相关的研究尚未见文献报道。为了
探明不同产地独蒜兰维生素的累积状况,笔者等采
用高效液相色谱(HPLC)方法,研究了不同产地独
蒜兰中脂溶性和水溶性维生素的含量,以期为进一
步探讨影响维生素生物合成与累积的影响因素,以
及进行独蒜兰的深度研发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料 11个不同产地的独蒜兰样品,
相关的采集信息见表1。
1.1.2 试剂 VB1、VB2、VB6、烟酸、烟酰胺、VC、
VA、VD和VE购于中国药品生物制品检定所,庚烷磺
酸钠和甲醇为色谱纯,盐酸、乙酸乙酯和无水乙醇均
为分析纯。
1.1.3 仪器 日本岛津公司高效液相色谱仪LC-
20AT(日本岛津),冷冻离心机,电子天平(梅特勒),
超声清洗器(山东济宁超声电子仪器厂),旋转蒸发
仪(Buchi)。
1.2 试验方法
1.2.1 试验材料预处理
1)标样的制备。a.分别称取 VB1、VB2、VB6、烟
酸 、烟酰胺、VC各10mg(精密称量)集中放入1个
贵州农业科学 2012,40(7):69~71
Guizhou Agricultural Sciences
表1 不同产地独蒜兰样本的采集信息
Table 1 Information of colected plant samples for different producing areas
编号No.
样品名称及存放样本号
Sample name and storage No.
来源地
Origin
形态及生长特征
Form and growth character
采集时间
Colecting time
1 云南独蒜兰DSL001 云南 小、团状 2010年10月
2 云南独蒜兰DSL002 云南 大、团状 2010年10月
3 独蒜兰DSL003 云南 中、长状 2010年10月
4 独蒜兰DSL004 云南 大、长状 2010年10月
5 云南独蒜兰DSL005 云南 中、团状 2010年10月
6 云南独蒜兰DSL006 贵州 中、团状 2010年9月
7 四川独蒜兰DSL007 四川 中、长状 2010年10月
8 四川独蒜兰DSL008 四川 大、团状 2010年10月
9 四川独蒜兰DSL009 四川 小、团状 2010年10月
10 四川独蒜兰DSL010 四川 大、长状 2010年10月
11 四川独蒜兰DSL011 四川 小、团状 2010年10月
注:小的生长年限短,大的生长年限长,独蒜兰和四川独蒜兰关系较近,两者与苔藓附生性强,云南独蒜兰地生性强,在土中能较好地生长。
Note:The smal ones had short growth period,and the big ones had long growth period,P.yunnanensis was closely related with P.yun-
nanensis from Sichuan,they had stronger supervenience with moss,and the P.yunnanensis from Yunnan could grow better in the soil.
10mL容量瓶中,先用4mL乙醇溶解后再用1%的
盐酸定容到10mL刻度即得储备液,然后根据试验
需要分别稀释到所需浓度并于4℃下保存备用。b.
分别称取VA、VD、VE各10mg(精密称量)集中放入
10mL容量瓶中,用4mL甲醇溶解并定容到10
mL刻度,即为储备液,根据试验需要分别稀释到所
需浓度并于4℃下保存备用。
2)水溶性维生素的提取。将新鲜的独蒜兰清
洗干净,沥干表面水分,准确称量后放入研钵中研磨
成匀浆状,加入1%的盐酸10mL超声浸提10min,
将提取出的液体转移到10mL试管中,离心后径微
孔滤膜过滤至2.0mL的离心管中待测。以上操作
均需避光、迅速,样品处理后在4℃下保存以防维生
素分解[6]。
3)脂溶性维生素的提取。将新鲜的独蒜兰清
洗干净,沥干表面水分,准确称量10g左右的样品,
置于研钵中匀浆,先后加入15mL甲醇清洗,再加
入20mL甲醇清洗,将提取出的液体过滤至锥形瓶
或圆底烧瓶中,用旋转蒸发仪将瓶内甲醇蒸干后和
10~20mL纯水,加入10~20mL乙酸乙酯溶解后
转移到分液漏斗中进行多次萃取,取上层有机相乙
酸乙酯,放于圆底烧瓶中,加入无水硫酸钠将其中水
分除净后过滤至新的圆底烧瓶中,用旋转蒸发仪将
瓶内的乙酸乙酯蒸干后,用1mL甲醇溶解,将液体
用微孔滤膜过滤至1.5mL的离心管中,待测。以
上操作应尽量迅速、避光,样品处理后在4℃下保
存,以防维生素分解[3]。
1.2.2 试验设计
1) 色 谱 条 件。 色 谱 柱:Diamonsil C18
(250mm×4.6mm,5μm);柱温:35℃
[7]。水溶性
维生素检测波长为254nm,流动相:0.005mol/L
庚烷磺酸钠(稀磷酸调pH=3.0);甲醇梯度洗脱:
5%的甲醇(0~5min),5%~40%的甲醇(5~25
min);流速:1.0mL/min。脂溶性维生素检测波长
为275nm;流动相:甲醇,流速为1.0mL/min。
2)标准曲线绘制。分别取VB1、VB2、VB6、烟酸、
烟酰胺、VC的混合标样溶液2.0μL、4.0μL、6.0
μL、8.0μL、10.0μL以及VA、VD和VE的混合标样
溶液4.0μL、8.0μL、12.0μL、16.0μL和20.0μL
进样,进行 HPLC分析,以峰面积为纵轴(y),进样
量为横轴(x)绘制标准曲线,并拟合回归方程。
3)仪器进样精密度测定。分别取维生素混合
标样10μL,进行 HPLC分析,重复进样5次,以峰
面积计算其相对标准偏差(RSD)。
4)样品稳定性测定。分别取 DSL003样品的
水溶性维生素和脂溶性维生素各20μL,放置0h、2
h、4h、6h和8h后,进样测定其VC、烟酸、烟酰胺、
VB2、VB6、VB1、VA、VD和VE的含量,计算其RSD。
5)维生素含量测定。水溶性及脂溶性测定,按
1.2.2的色谱条件进样,按峰面积外标法计算。
1.3 数据统计与分析
采用Excel和SPSS 13.0软件对数据进行统计
和分析。
2 结果与分析
2.1 回归方程拟合
由表2可见,经拟合获得的回归方程,其线性关
系较好。
2.2 仪器的精密度
试验测得维生素混合标样的VC、烟酸、烟酰胺、
VB2、VB6、VB1、VA、VD和VE的RSD分别为3.40%、
3.93%、2.52%、2.53%、1.87%、2.47%、1.06%、
1.36%和3.36%。表明,仪器的精密度良好。
2.3 样品的稳定性
试验测得 DSL003的 VC、烟酸、烟酰胺、VB2、
VB6、VB1、VA、VD和 VE的 RSD 分别为 4.83%、
2.55%、1.39%、4.85%、4.91%、3.16%、4.43%、
4.12%和4.34%。表明,样品在8h内有良好的稳
定性。
·07·
贵 州 农 业 科 学
Guizhou Agricultural Sciences
表2 不同产地独蒜兰各种维生素标样的拟合回归方程
Table 2 Fitted regression equations of guide samples of various vitamins
编号
No.
名称
Name
回归方程
Regression equation
线性相关系数(R2)
Linear correlation coefficient
线性范围(μg)
Range of linearity
1 VC y=2.4E+5 x-202 415 0.999 1 0.200~1.000
2 烟酸 y=2.1E+5 x-4 532.9 0.999 2 0.200~1.000
3 烟酰胺 y=1.8E+5 x-46 647 0.999 4 0.200~1.000
4 VB2 y=9.1E+4 x-37 827 0.999 9 0.060~0.300
5 VB6 y=1.5E+5 x-15 865 0.999 5 0.600~3.000
6 VB1 y=2.1E+5 x-61 532 0.999 3 0.200~1.000
7 VA y=4.9E+4 x+37 103 0.999 0 0.227~1.134
8 VD y=1.1E+5 x+129 751 0.999 0 0.213~1.066
9 VE y=1.4 E+3 x-62.5 0.999 2 1.243~6.214
表3 不同产地独蒜兰样品中水溶性维生素含量的测定结果
Table 3 Determination results of the contents of water soluble vitamins in 11samples mg/100g
样本
Sample
VC
烟酸
Nicotinic acid
烟酰胺
Nicotinamide
VB2 VB6 VB1 VA VD VE
DSL001 5.1 64.5 10.4 42.8 857.2 20.0 未检出 0.4 13.4
DSL002 69.3 126.4 5.4 48.5 115.8 11.2 未检出 0.6 50.8
DSL003 56.3 86.5 6.2 44.9 801.3 17.0 未检出 0.6 117.2
DSL004 70.5 45.1 8.6 19.4 528.2 7.4 1.4 1.7 94.6
DSL005 40.1 62.4 4.6 24.7 473.1 4.9 0.2 0.7 18.1
DSL006 395.2 61.2 12.3 46.5 416.8 64.7 未检出 0.4 185.7
DSL007 60.7 73.8 1.1 44.8 588.7 46.9 未检出 0.8 20.6
DSL008 29.2 89.6 1.7 27.1 534.9 7.9 未检出 0.5 70.6
DSL009 27.4 66.3 23.4 39.3 540.7 40.7 0.1 0.7 143.4
DSL010 65.9 99.7 32.8 32.4 280.3 4.2 0.1 4.9 81.7
DSL011 7.5 75.5 2.1 2.8 514.4 8.1 0.7 未检出 96.6
图示 维生素标样和典型独蒜兰样品的HPLC色谱图
Fig. HPLC chromatogram of standard vitamin sample and typical P.yunnanensis sample
2.4 不同产地独蒜兰的维生素含量
由表3和图示可见:1)VB6,各样品中 VB6的含
量均较其他维生素高。2)VC,云南独蒜兰DSL006
的含量最高,达 395.2 mg/100g;云南独蒜兰
DSL001的最低,仅为5.1mg/100g。3)烟酸,各
样品烟酸的含量差异显著,其中,云南独蒜兰
DSL002的含量最高,为126.4mg/100g;独蒜兰
DSL004的含量最低,为45.1mg/100g。4)烟酰
胺,四川独蒜兰DSL010的含量最高,为32.8mg/
100g;四川独蒜兰 DSL007的含量最低,仅为1.1
mg/100g。5)VB2,云南独蒜兰DSL002的含量最
高,为48.5mg/100g;四川独蒜兰DSL011的含量
最低,仅 2.8 mg/100g。6)VB1,云南独蒜兰
DSL006的含量最高,为64.7mg/100g;四川独蒜
兰DSL010的含量最低,仅为4.2mg/100g。7)
VA,所有样品中VA的含量 (下转第76页)
·17·
杨占南 等 不同产地独蒜兰中维生素含量的评价
YANG Zhan-nan et al Evaluation of the Contents of Vitamins in Pleione yunnanensis from Different Regions
现为未分解状态小于半分解状态。革质和无表皮毛
的枯落叶未分解与半分解之间的最大持水率差异显
著,纸质和有表皮毛的枯落叶未分解与半分解之间
的最大持水率差异不显著。
3)特水量与分解状态关系的研究结果表明,各
特征枯落叶各时段的持水量均为半分解状态大于未
分解状态,且两者各时段持水量的差异为1~1.4
倍。其中,纸质和有表皮毛枯落叶未分解状态与半
分解状态各时段的持水量差异不显著,革质和无表
皮毛枯落叶的差异显著。枯落叶持水量在前期迅速
增加,然后逐渐降低,最后趋于稳定,在0.5h时持
水量达70%以上,吸水速率为3.30~5.09,高于整
个枯枝落叶层。说明,枯落叶的持水量高于枯枝落
叶层的其他组分。
4)50种阔叶树种枯落叶的最大持水率大于
300%的多为纸质和具有柔毛的枯落叶,小于200%
的为革质枯落叶。因此,在喀斯特石漠化地区植被
恢复过程中,可以优先选择叶片为纸质和具有柔毛
的树种进行种植,以充分发挥其持水功能。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:陈 静
櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁
)
(上接第71页)
均相对较少,其中,云南独蒜兰 DSL001的含量最
高,为 1.4 mg/100g。8)VD,除 四 川 独 蒜 兰
DSL011未检出外,其余均可不同程度的检测出,其
中,四川独蒜兰DSL010的含量最高,为4.955mg/
100g。9)VE,云南独蒜兰DSL006的含量最高,为
185.7mg/100g。
3 结论与讨论
1)利用HPLC同时测定独蒜兰中VC、烟酸、烟
酰胺、VB2、VB6和VB1以及同时测定VA、VD和VE,方
法稳定性好,可作为测定维生素的有效方法。
2)试验结果表明:采用1%HCl浸提对VC具有
较好保护作用,能在一定程度上避免 VC被氧化;维
生素在独蒜兰中的含量与其形状及大小没有直接的
相关性,而不同产地来源的独蒜兰,其维生素的含量
差异显著;这种差异性可能源于环境条件(气候,水
分,施肥等)和基因等因素共同作用,影响了维生素
生物合成酶的活性及其表达所致。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:王 海)
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