全 文 ：作者简介:舒孝顺 ,副教授 , 博士　　Tel:(0731)2618130　　E-mail:sxs732@yahoo.com.cn
RP-HPLC同时测定菝葜中山柰酚和槲皮素的含量
舒孝顺1 ,高中洪2 ,杨祥良2(1.长沙理工大学生物与食品工程系 ,长沙 410074;2.华中科技大学药物研究所 ,武汉 430074)
摘要:目的　建立一种 RP-HPLC 测定菝葜山柰酚和槲皮素含量的方法 , 并测定其不同产地的含量。方法　采用 LichrospherC18
柱 ,水-乙腈-磷酸-三乙胺(65∶35∶0.27∶0.45)作流动相 ,流速 0.7 mL·min-1 , 二级管阵列检测器(DVD), 检测波长 365 nm。结果
　槲皮素 ,山柰酚与相邻杂质能很好分离 ,其分离度分别为 1.96 和5.32 ,理论塔板数以槲皮素峰和山柰酚峰计算 ,分别为5 121
和 6 673;在 5 ～ 100 mg·L-1内峰面积与其浓度均呈良好的线性关系(r=0.999 4 , 0.999 6), 样品回收率分别为 97.58%和
105.67%;两成分含量以湖南张家界的最高而湖北赤壁最低。结论　该方法精密度 、重现性和分离效果好 ,分析快速准确 , 适
合于该药材及提取物中山柰酚和槲皮素含量的测定 , 不同产地两成分均存在一定的差别。
关键词:反相高效液相色谱法;菝葜;槲皮素;山柰酚
中图分类号:R931.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2006)06-0454-03
Determination of Kaempferol and Quercetin in Smilax china by RP-HPLC
SHU Xiao-shun1 , GAO Zhong-hong2 , YANG Xiang-liang2(1.Department of Biology &Foodstuff Industry , Changsha University of
Science &Technology , Changsha 410076 , China;2.Institute of Materia Medica , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan
430074 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　 To establish a RP-HPLC method for the determination of kaempferol and quercetin in Smilax china L., and to
investigate their contents in different places.METHODS　The determination was performed on a Lichrospher C18 column (4.6 mm ×250
mm , 5μm).The detection wavelength was at 365 nm , with the mobile phase of Water-Acetonitrile-Phosphoric-Triethylamine(65∶35∶0.27∶
0.45)at the flow rate of 0.7 mL·min-1.RESULTS　Kaempferol , quercetin and impurities were separated.The theoretical plate numbers of
kaempferol and quercetin were 5 121 and 6 673 , the resolution between kaempferol , quercetin and impurities were 1.96 and 5.32 , respectively.
All the parameters were suitable for determination.Both of kaempferol and quercetin showed a good linearity over the range of 5 ～ 100 mg·L-1
(r=0.999 4 , 0.999 6), respectively , the average recoveries of kaempferol and quercetin were 105.67% and 87.58%, respectively.Their
contents were highest in Zhang jia jie , Hunan and lowest in Chibi , Hubei.CONCLUSION　The RP-HPLC method shows a good separation ,
reproducity and accuracy.It will be used for determining kaempferol and quercetin in herbs and extracts.The contents of kaempferol and
quercetin are different in Smilax china L.from different places.
KEY WORDS:RP-HPLC;Smilax china L.;quercetin;kaempferol
　　菝葜为百合科菝葜属植物的根茎 ,又名金刚藤 ,
具有消肿止痛 、祛风利湿 、活血化瘀及抗肿瘤等作
用[ 1-4] ,临床单用或与其他药物配伍用于各种炎症性
疾病 ,如妇科盆腔炎症及炎症性包块 、前列腺炎 、类
风湿性关节炎及各种肿瘤等 ,均取得满意疗效 。金
刚藤药物的质量评价到目前为止还没有建立起较理
想和科学的现代精确定量分析方法和质量评价指
标 ,质量标准有待提高。
金刚藤目前多以薯蓣皂苷元或其皂苷含量作为
控制其制剂质量的指标。黄酮类成分具有明显的抗
菌和抗炎[ 5-10]作用 ,同时又是金刚藤的主要成分(其
中以山柰酚和槲皮素为主),因此补充山柰酚和槲皮
素的高效液相色谱法定量分析[ 11-12] 可以更好地控
制质量 。虽然金刚藤中山柰酚的高效液相色谱法测
定有过报道 ,但同时对金刚藤中槲皮素和山柰酚进
行高效液相色谱法定量分析笔者未见报道 。本实验
建立了金刚藤中槲皮素和山柰酚的 RP-HPLC 同时
测定方法 ,并对不同产地金刚藤生药材中槲皮素和
山柰酚的含量进行了测定。
1　仪器与材料
Agilent 100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司;
乙腈和甲醇均为色谱纯 , 三乙胺和磷酸均为分析
纯;其他试剂均为化学纯 , 山柰酚和槲皮素对照品
(含量99%,中国药品生物制品检定所), 样品由华
中科技大学生科院中药研究室韩定献副教授鉴定为
百合科菝葜属植物 Smilax china L.的根茎 。
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2　实验方法
2.1　菝葜乙酸乙酯提取物的制备
1 kg 菝葜根先粉碎 ,然后于 100 ℃水解 ,水解完
后水洗至中性 ,干燥后以 8倍量的乙酸乙酯回流提
取2 h ,重复回流提取 2次 ,乙酸乙酯提取液真空旋
转蒸发干燥 ,得提取物干重 12 g ,得率为 1.2%。
2.2　色谱条件
色谱柱:LichrospherC18柱(4.6 mm ×250 mm , 5
μm);流动相:水-乙腈-磷酸-三乙胺(65∶35∶0.27∶
0.45);流速:0.7 mL·min-1;柱温:25 ℃;检测波长:
365 nm;进样量:20 μL。
2.3　对照品溶液的配制
精确称取山柰酚 10.8 mg 和槲皮素 10.9 mg ,置
于100 mL 量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,
作为对照品储备液。精确量取对照品储备液 1 mL
置10 mL 量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,
即为对照品液(其浓度分别为 10.8 和 10.9 mg·
L-1)。
2.4　供试品溶液的配制
精确称取干燥的乙酸乙酯提取物 0.5 g(先碾成
细粉),加入甲醇 25 mL ,加热回流 1 h ,滤过 ,残渣用
甲醇少量洗涤 2次 ,洗涤液并入滤液中减压浓缩至
干 ,用热水 25 mL溶解 ,转移至分液漏斗中 ,用乙醚
40 mL萃取 3次(15∶15∶10),合并萃取液 ,蒸干 ,残渣
加甲醇溶解转移至 5 mL 量瓶中并稀释至刻度 ,摇
匀 ,测定时再稀释 4倍 ,微孔滤膜过滤 ,取续滤液作
为供试品溶液 ,续滤液作为供试品溶液。对照品溶
液与供试品溶液均进样 20μL ,记录峰面积 ,按外标
法计算含量。
3　结　果
3.1　系统适应性实验
按“2.2”项下条件分别进样 20 μL 对照品溶液
和供试品溶液 ,在该实验条件下 ,对照品和供试品的
色谱图见图 1 ,山柰酚和槲皮素峰的保留时间分别
约14.09和 24.32 min ,山柰酚和槲皮素峰的拖尾因
子分别为 0.98和 1.02 ,主成分峰山柰酚峰与槲皮素
峰均得到良好分离 ,山柰酚峰与槲皮素峰的分离度
为10.78 ,山柰酚峰及槲皮素峰和杂质峰的分离度
分别为 1.96和5.32 ,理论塔板数以山柰酚峰和槲皮
素峰计算 ,分别为 5 121和 6 673。
3.2　线性关系
分别精确吸取上述对照品溶液 0.25 , 0.50 ,
0.75 ,1.00 ,1.50 ,2.50 mL 置于 5 mL 量瓶中 ,用甲醇
溶解并稀释至刻度 ,摇匀按“2.2”色谱条件进样 ,以
　　
图 1　槲皮素和山柰酚对照品及样品 HPLC色谱图
A-槲皮素和山柰酚对照品;B-样品;a-槲皮素;b-山柰酚对照品;1-槲皮
素;2-山柰酚(样品中)
Fig 1　HPLC chromatograms of quercetin and kaempferol
A-quercetin and kaempferol reference;B-unknown sample;a-quercetin reference;
b-kaempferol reference;1-quercetin;2-kaempferol
对照品质量浓度(mg·L-1)为横坐标(ρ),主峰面积
为纵坐标(Y)作图 ,槲皮素和山柰酚的一元线性回
归方程分别为 y =10.192ρ(r =0.999 4)和 y =
10.232x(r=0.999 6),均过原点 ,线性范围均为 5 ～
100 mg·L-1 。
3.3　精密度实验
分别取上述槲皮素和山柰酚对照品溶液连续进
样 5次 ,每次 20μL ,测得各次峰面积的 RSD分别为
0.56%和 0.53%。结果表明 ,此分析方法精密度良
好 。
3.4　稳定性实验
将同一样品溶液在室温下考察 5 d , 日内 RSD
以每隔 2 h进样 ,每次 20 μL ,连续进样 5次 ,测得日
内 RSD 分别为 0.71%和 0.64%,日间 RSD 分别为
1.62%和 1.38%。结果表明 ,槲皮素和山柰酚的甲
醇溶液在5 d内稳定。
3.5　方法重现性实验
取同一批号样品 5份 ,按“2.1”项下操作方法提
取和“2.4”项下配制样品溶液 ,按“2.2”项下操作测
得其槲皮素和山柰酚的含量分别为 0.002 2%和
0.001 5%,其 RSD 分别为 1.87%(n =5)和 2.69%
(n=5),结果表明 ,该方法对槲皮素和山柰酚的含
量测定具有较好的重现性。
3.6　加样回收率实验
精确称取已测含量的样品粉末 ,分别精确加入
槲皮素和山柰酚对照品 ,按“2.1”项下操作方法提取
和“2.4”项下配制样品溶液 ,按“2.2”项下操作测定
其含量 ,计算加样回收率 ,结果见表 1 , 2。结果表
明 ,本实验的提取与处理方法对槲皮素和山柰酚同
时具有较高的回收率。
3.7　不同产地菝葜样品含量的测定
按“2”项下的有关方法测定不同产地菝葜(同一
产地3批)生药材中槲皮素和山柰酚的平均含量 ,测
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　　表 1　槲皮素加样回收率实验.n=9
Tab 1　Recoveries of quercetin.n=9
Sample
/g
Content
/mg
Added
/mg
Determined
/mg
Recovery
/ %
Average recovery
/ %
RSD
/ %
25 0.60 1.09 1.548 0 86.97
25 0.60 1.09 1.554 5 87.57 97.58 0.71
25 0.60 1.09 1.561 5 88.21
表 2　山柰酚加样回收率实验.n=9
Tab 2　Recoveries of kaempferol.n=9
Sample
/g
Content
/mg
Added
/mg
Determined
/mg
Recovery
/ %
Average recovery
/ %
RSD
/ %
25 0.38 1.08 1.517 2 105.30
25 0.38 1.08 1.521 0 105.65 105.67 0.70
25 0.38 1.08 1.522 8 105.81
定结果见表3。
表3　不同产地菝葜生药材(根)中槲皮素和山柰酚的平均
含量.%, n=3
Tab 3 　Contents of quercetin and kaempferol in Smilax china
L.%, n =3
Sample No Producing area Quercetin Kaempferol
1 Shaoyang ,Hunan 0.002 2 0.001 5
2 Huaihua ,Hunan 0.002 8 0.002 0
3 Jishou , Hunan 0.003 1 0.001 8
4 Zhangjiajie ,Hunan 0.004 0 0.002 6
5 Chibi ,Hubei 0.001 8 0.000 9
6 Shishou ,Hubei 0.002 0 0.001 1
7 Tongren ,Guizhou 0.003 3 0.001 9
8 Kaili ,Guizhou 0.003 8 0.002 1
4　讨　论
4.1　山柰酚和槲皮素是金刚藤中黄酮类化合物的
指标性成分 ,并有较好的紫外吸收 ,文献报道[ 11-12]
选用 365 nm紫外吸收作为检测波长 ,效果良好 ,故
本实验选用 365 nm 为检测波长。刘素香等[ 13]考察
了流动相用水-乙腈-磷酸-三乙胺(71∶29∶0.3∶0.5)
的溶剂系统 ,发现他们可较好分离山柰酚 ,其保留时
间为 23.18 min ,但不能同时分离山柰酚和槲皮素 。
我们比较了不同溶剂系统和不同比例的流动相 ,如
甲醇-水-磷酸 , 水-乙腈-磷酸和水-乙腈-磷酸-三乙
胺 ,最后选用水-乙腈-磷酸-三乙胺(65∶35∶0.27∶
0.45)作为流动相 ,同时使山柰酚和槲皮素与临近杂
质峰获得了良好的分离 ,而该溶剂系统其他比例均
不能获得较满意的分离效果 ,主要是槲皮素不能与
相邻杂质峰分离;不同流速实验结果表明 ,流速小分
离效果好 ,但保留时间长 ,而流速0.7 mL·min-1时山
柰酚和槲皮素的保留时间依次为 24.32 和 14.09
min ,与相邻杂峰均达基线分离 ,其分离度分别为
1.96和 5.32 ,已达到了色谱分离的要求 。
因此我们选用水-乙腈-磷酸-三乙胺(65∶35∶
0.27∶0.45)作为流动相 ,流速 0.7 mL·min-1 ,在该条
件下样品中山柰酚和槲皮素与相邻杂峰都获得了较
满意的分离 ,且保留时间适中;方法学考察也表明 ,
该色谱条件具有简便快速 ,准确 ,灵敏度高 ,重复性
好等特点 ,适合于该药材及提取物中山柰酚和槲皮
素的分析及含量测定。
4.2　对湖南 、湖北和贵州 8个不同产地金刚藤中槲
皮素和山柰酚的含量进行了测定 ,结果发现 ,采自湖
南张家界的样品含量最高 , 依次为 0.004 0%和
0.002 6%;其次是贵州凯理样品 ,分别为 0.003 8%
和 0.002 1%;含量最低的是湖北赤壁样品 ,分别为
0.001 8%和 0.000 9%,不同产地金刚藤中槲皮素和
山柰酚的含量存在较大的差异。这为金刚藤制剂的
药材选择以及在镇痛 、抗炎等方面的进一步深度开
发利用提供了可靠的科学依据。
REFERENCES
[ 1] 　 WANG X J ,WEN Z Y ,FENG P , et al.Mechanism of anti-cancer for
compound Smilax china L[ J] .Chin Pathophy J(中国病理生理学
杂志),1996 , 12(4):614-616.
[ 2] 　 ZHANG Y L , CHEN H T ,WONG F L.Compare of three extracts for
Smilax china L on anti— inf lammatory effects for arthritis in mice
[ J] .Xinxing Med(新兴医药), 1996 ,(6):242-244.
[ 3] 　 LV Y N , CHEN D S , FU L.Study on the pharmacological action of
the extracts f rom Smi lax china L.on promoting blood circulation to
remove blood stasis [ J] .Acta Pharm Univ Chin(中国药科大学学
报),2001 , 32(6):448-450.
[ 4] 　 LV Y N ,CHEN D S , XU C H.Study on the pharmacological action of
smi lax china L.on promoting blood circulation to remove blood stasis
[ J] .ChinHospPharm J(中国医院药学杂志), 2002 , 22(9):538.
[ 5] 　 WS-612(Z-123)-98 , China minist ry of health issue cri terion (trying
out)(中华人民共和国卫生部部颁标准(试行)[ S] .WS-612(Z-
123)-98.
[ 6] 　 WONG L H , CHAO Z C.Anti-inf lammatory activities of the ext ract
and f lavonoid glycoside form cassia alata [ J] .Foreign Med(Chin
Tradit Med Fascicule)(国外医学·中医中药分册), 2004 , 26(4):
236-236.
[ 7] 　 MA L ,WU F ,CHEN R Y.Research progress on chemistry and biolo-
gy active ingredient form Saururaceae plants [ J] .J China Mater Med
(中国中药杂志), 2003 , 28(3):196-198.
[ 8] 　 XIE J B, LI P.Advances in research of chemist ry and pharmacology of
llex L[ J] .Chin Tradit Herb Drugs(中草药), 2002, 33(1):85-88.
[ 9] 　 HUANG Y , QING M J , YU G M.Isoflavones pharmacologyical effects
and its distributing in vegetable kingdom[ J] .Chin Wild Plant Res
(中国野生植物资源), 2001 ,20(1):5-7.
[ 10] 　LI Z Q , LIN R C ,WANG Z G.Studies on chemistry ingredient and
pharmacologyical effects for Costus(Zingiberaceae)Plants[ J] .Med
Materials(中药材), 2001 ,24(2):148-150.
[ 11] 　DU H Y , ZHEN Z G , LI T.RP-HPLC determination of kaempferol
and quercetin in propolis[ J] .Chin Tradit Herb Drugs(中草药),
2002 , 33(11):997-999.
[ 12] 　SUI C H ,WANG C K.Determination of kaempferol in Equisetum
hiemale L.[ J] .Acta PharmUniv Shenyang(沈阳药科大学学报),
1996 , 13(2):121-124.
[ 13] 　LIU S X.HPLC determination of kaempferol in Smilax china L.
[ J] .Chin Tradit HerbDrugs(中草药), 2004 , 35(3):284-2885.
(收稿日期:2005-07-07)
·456· Chin Pharm J , 2006 March , Vol.41 No.6　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2006年 3月第 41卷第 6期