全 文 ：蝴蝶兰不同花色遗传多样性的 ISSR分析
张淑红 , 范永山 , 翟凤顺
(唐山师范学院生命科学系 ,河北唐山 063000)
　　摘要:利用 ISSR标记技术对 6种蝴蝶兰样品的花色遗传多样性进行分析。 结果表明 , 从 19条 ISSR引物中筛选
出的 6条引物共扩增出 81条带 , 其中 25条带表现出多态性。 UPGMA聚类分析将供试的 6种蝴蝶兰样品划分为 3
组:第一组为白色唇瓣 、白色花瓣的 P1,第二组包含粉红色唇瓣 、粉红色花瓣的 P3, 第三组为深红色唇瓣的 P2、P4、P5
和 P6。这与花的形态分类结果基本一致。
　　关键词:蝴蝶兰;花色;ISSR;遗传多样性;局类分析
　　中图分类号:S682.31　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)02-0077-02
　　蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科蝴蝶兰属常绿草本植物 ,形
态优美 、花色多样 、花期持久 ,素有 “洋花皇后 ”之称 ,具有很
高的观赏价值和经济价值 [1 ] 。世界各国在进行大规模商品
化生产的同时 ,对蝴蝶兰的快速繁殖和新品种选育技术进行
了广泛深入的研究 [ 2-6 ] ,目前市场上蝴蝶兰的种属关系非常
混乱 ,给杂交育种造成了很大不便 。有关蝴蝶兰不同品种
(品系)之间亲缘关系远近的报道十分稀少 。尽管我国目前
已自行研制出一些蝴蝶兰新品种 ,但奇珍异品极少 [ 7 ] 。
近年来 ,分子生物学的发展特别是 DNA分子标记技术的
应用 ,为深入研究基因多态性提供了实用的方法 。 ISSR是一
种简单序列重复区间扩增多态性分子标记 ,具有 DNA样品用
量少 、操作简单 、不需要预先知道受试基因组 DNA序列 、结果
记录方便 、试验成本低 、能提供丰富的关于基因组的信息等优
点 ,比 RAPD技术更加稳定可靠 ,试验重复性好 。目前 ISSR
标记技术已成功应用于一些花卉 、蔬菜等园艺作物的遗传多
样性研究 [ 8 -10] 。本文通过 ISSR分子标记技术 ,从基因水平
上反映蝴蝶兰不同花色品种间的遗传差异 ,为蝴蝶兰的品种
鉴定及杂交育种提供科学依据 。
1　材料与方法
1.1　供试蝴蝶兰样品
6个不同花色蝴蝶兰样品由唐山师范学院现代化温室提
供 ,花色形态如图 1所示 。
收稿日期:2008-10-28
作者简介:张淑红(1978—),女 ,河北赞皇人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事生
物化学与分子生物学研究。 E-mail:zsh3535@yahoo.com.cn。
通讯作者:范永山。 Tel:(0315)2893265;E-mail:fanyongshan@126.
com。
1.2　试剂
PCR反应试剂均购自宝生物工程大连有限公司 , ISSR引
物购自上海生工生物有限公司 。
1.3　试验方法
利用 CTAB法提取 6种蝴蝶兰基因组 DNA作为模板 ,反
应程序为 95℃预变性 5min后;经如下 35个循环:95 ℃变性
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DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.02.084
45 s, 50 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 1.5 min;最后 72 ℃延伸 7
min。扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 。
1.4　数据分析
将电泳图谱记录后进行人工读带 ,有带记作 1,无带记为
0 ,强带和弱带的赋值均为 1。对于多态位点选择仅在重复试
验中能稳定出现的差异带用于数据分析 [ 11] 。采用 NTSYS软
件 ,按 NEI72方法计算蝴蝶兰遗传距离 , UPGMA方法构建聚
类树状图 。
2　结果与分析
2.1　模板 DNA的提取
图 2显示 ,所提取的蝴蝶兰基因组 DNA适用于 ISSR标
记技术分析 。
2.2　引物的筛选及扩增结果
从 19条 ISSR引物中筛选出重复性好 、条带清楚且多态
性丰富的 6条引物用于蝴蝶兰的 ISSR分析 。表 1列出了筛
选出的 6条引物序列及扩增带数 ,共扩增出 81条带 ,其中表
现多态性的为 25条 。代表性引物的扩增图谱如图 3所示 ,其
中引物 121扩增产物的多态性较大 。
表 1　ISSR引物及扩增带数
引物 序列(5′※ 3′) 记录带数(条)
多态性带
数(条)
105 GGATGGATGGATGGAT 14 2
108 CACACACACACAAC 8 2
118 GTCGTCGTCGTCGTCGTC 12 2
120 GAGGAGGAGGAGGC 20 2
121 GTGCGTGCGTGCGTGC 16 12
841 GTGCGTGCGTGCGTGC 11 5
总数 81 25
2.3　数据处理与统计分析
2.3.1　遗传距离的计算　如表 2所示 , 6种蝴蝶兰样品间的
遗传距离从 0.034 5 ～ 0.314 3不等 。其中 ,白色唇瓣的 P1与
深红色唇瓣的 P4之间遗传距离最大 ,为 0.314 3;唇瓣均为深
红色 ,而花瓣分别为粉红色和深红色的 P2与 P5之间遗传距
离最小 ,为 0.034 5。
表 2　蝴蝶兰样品之间的遗传距离
样品 P1 P2 P3 P4 P5
P2 0.234 3
P3 0.259 4 0.168 2
P4 0.314 3 0.143 1 0.311 3
P5 0.279 6 0.034 5 0.202 7 0.108 6
P6 0.279 6 0.188 6 0.276 8 0.275 7 0.154 2
2.3.2　蝴蝶兰的 ISSR聚类分析　聚类树状图(图 4)表明 ,
遗传系数为 0.21时 ,可把蝴蝶兰样品分为 3组 ,第一组为白
色唇瓣的样品 P1,第二组为粉红色唇瓣的样品 P3 ,第三组为
深红色唇瓣的样品 P2、P4、P5和 P6。
3　讨论
本试验供试的蝴蝶兰样品中花瓣和唇瓣颜色均可分为白
色 、粉红色和深红色 3种 。试验结果表明唇瓣颜色相近的样
品之间遗传距离较小 ,白色与深红色唇瓣的样品之间遗传距
离最大;聚类分析结果显示 6种蝴蝶兰材料可划分为 3组 ,第
一组为唇瓣白色 、花瓣白色的 P1,第二组为唇瓣粉红色 、花瓣
粉红色的 P3 ,第三组包含唇瓣为深红色的 P2、P4、P5和 P6。
这与花的形态分类结果基本一致 ,说明 ISSR标记技术能够用
于蝴蝶兰花色的多态性研究 。
在蝴蝶兰花瓣颜色的进化过程中 ,植物自身的查尔酮基
因发生突变或增强表达而转变成白色或红色等色阶颜色的花
瓣 ,但是花瓣颜色具体变化的遗传本质 , 仍需要进一步研
究 [ 12] ,同时有待于结合其他标记技术进一步分析 ,以确定不
同花色蝴蝶兰间的遗传关系 ,为进行蝴蝶兰花色遗传改良提
供理论依据 。
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(下转第 106页)
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2.4　不同处理天数对 Snef69杀线活性的影响
从图 5可以看出 ,不同发酵天数对菌株 Snef69的杀线活
性影响不大 。当发酵天数为 6 ～ 7d时 ,菌株 Snef69的代谢产
物杀线活性最强 ,校正死亡率为 100%。当发酵天数为 11 ～
12 d时 ,校正死亡率下降至 85.04%和 84.03%。
2.5　不同 pH值对菌株 Snef69杀线活性的影响
从图 6可以看出 , 在 pH值 =3 ～ 9的发酵条件下菌株
Snef69代谢产物杀线活性均在 90%以上 ,其中当 pH值 =6时
活性最强 ,校正死亡率为 99%。当 pH值为 7、8、5、4、3、9时 ,
校正死亡率依 次为 96.4%、 95.2%、 94.2%、 92.3%、
92.07%、91.3%。当 pH值 =10、11、12时活性下降 ,校正死
亡率分别为 89.06%、88.05%、80.89%。
3　讨论
20世纪 80年代 ,蜡蚧轮枝菌率先在英国用于防治温室
白粉虱和蚜虫 ,并商品化 。此后 ,西欧一些国家大力开发此
菌 [ 10] 。国内外在用这种真菌防治温室病虫害上已有很多成
功的报道 。 Verhaar等报道 ,此菌对黄瓜一个抗性品种的白粉
病病菌有极好的控制作用 ,在接种蜡蚧轮枝菌 9周后 ,仍能保
持黄瓜叶面的受害程度在 15%以下;配合具有一定抗性的黄
瓜品种 ,此菌能有效地控制白粉病的发生 [ 11] 。 Meyer等报道 ,
胞囊线虫的性激素与此菌的联合使用 ,降低了大豆田间胞囊
线虫的数量 ,获得较高的大豆产量 [ 12 ] 。据俄罗斯相关报道 ,
在黄瓜和番茄温室里 ,应用蜡蚧轮枝菌 (AFX-7菌株)防治
根结线虫的效果显著 [ 13 ] 。
本试验筛选得到的生防菌株 Snef69(蜡蚧轮枝菌 Verticil-
liumlecanii)的代谢产物对南方根结线虫具有较强的杀线活
性 ,研究得到该菌株最优发酵条件的碳源为麦芽糖 、氮源为
NaNO3 、发酵天数为 6 ～ 7d、pH值 =6,随着发酵液浓度的增
加 ,菌株 Snef69的杀线活性增强。该菌株发酵液的 60%稀释
液对南方根结线虫校正死亡率仍可达 91.6%,是一种具有防
治温室黄瓜根结线虫病潜力的生防资源;但其作用机制 、代谢
产物中杀线活性物质的分离纯化及制剂产业化生产过程中 ,
如何提高真菌类制剂在常温条件下的储藏期即货架寿命及产
品的标准化问题 ,有待于进一步研究 。
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