全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2012)05 － 1553 － 05
收稿日期:2012 － 03 － 31
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向(KSCX3-EW-N-
02)
作者简介:兰秋霞(1986 － ) ，女，硕士研究生，从事小麦生化与
分子生物学研究，* 为通讯作者，Tel:028-85253809;E-mail:
wangtao@ cib． ac． cn。
4 个西藏小麦地方品种低分子量麦谷
蛋白亚基基因的克隆及分析
兰秋霞1，2，冯 波1，冬 梅3，徐智斌1，赵国君1，2，王 涛1*
(1．中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041;2．中国科学院研究生院，北京 100049;3．西藏农牧科学院农业研究所，西藏
拉萨 850000)
摘 要:低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)是小麦贮藏蛋白的主要成分，对面团延展性和食品加工品质有重要影响。本研究从西
藏小麦地方品种中分离了 4 个 LMW-GS基因(LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和 LMW-T4)。LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和 LMW-T4 都具
有 LMW-GS基因的典型结构特征，编码区全长分别是 930、930、897 和 915 bp，分别编码 308、308、297 和 303 个氨基酸，其推断氨
基酸的分子量分别为 32938． 40、32978． 42、31624． 88 和 32122． 20 Da。根据推断氨基酸中 8 个半胱氨酸残基的位置，LMW-T1 和
LMW-T2 属于 TypeⅢ类;LMW-T3 和 LMW-T4 属于 TypeⅤ类。系统进化树分析表明这 4 个基因与前人报道的低分子量麦谷蛋白基
因相似性很高，其中 LMW-T2、LMW-T3 和 LMW-T4 与 LMW-m型基因聚为一类。虽然 LMW-T1 的 N －末端的第一个氨基酸是甲硫
氨酸，但是 LMW-T1 与 LMW-s型基因聚为一类。上述四个基因的克隆进一步丰富了小麦 LMW-GS的基因库资源，有助于进一步了
解 LMW-GS基因的系统进化、结构与功能，可作为小麦品质改良的候选基因。
关键词:LMW-GS基因;序列分析;进化分析;西藏小麦地方品种
中图分类号:S512． 1 文献标识码:A
Cloning and Analysis of Low Molecular Weight Glutenin Subunit Genes from
Four Tibet Wheat Landraces(Triticum aestivum L．)
LAN Qiu-xia1，2，FENG Bo1，DONG Mei3，XU Zhi-bin1，ZHAO Guo-jun1，2，WANG Tao1*
(1． Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Sichuan Chengdu 610041，China;2． Graduate University of Chinese A-
cademy of Sciences，Beijing 100049，China;3． Agricultural Institute，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Tibet
Lhasa 850000，China)
Abstract:The low molecular weight glutenin subunits(LMW-GS)were the major components of wheat storage proteins and had great effects
on dough extensibility and food processing quality． Four LMW-GS genes(designated as LMW-T1，LMW-T2，LMW-T3 and LMW-T4)were i-
solated from Tibet wheat landraces． They were typical LMW-GS genes． The coding regions of LMW-T1，LMW-T2，LMW-T3，and LMW-T4
were 930，930，897 and 915 bp in length，which encoded 308，308，297 and 303 amino acid residues，with the predicted molecular
weights of 32 938． 40，32 978． 42，31 624． 88 and 32 122． 20 Da，respectively． According to the position of eight cysteine residues in the
four deduced amino acid sequences，LMW-T1 and LMW-T2 were classified as TypeⅢ，LMW-T3 and LMW-T4 genes were Type Ⅴ． Phylo-
genetic analysis indicated that the four genes had high similarity with other LMW-GS genes reported by previous study and LMW-T2，LMW-T3
and LMW-T4 were designated as LMW-m type genes． Although the first amino acid of N-terminal domains of LMW-T1 was methionine，
LMW-T1 was designated as LMW-s type genes． The four genes might be new candidate LMW-GS genes with potential value for wheat quality
improvement．
Key words:LMW-GS gene;Sequence analysis;Phylogenetic analysis;Tibet wheat landraces
小麦面粉适合制做面包、馒头、面条、糕点等多
种食品，其加工品质主要与胚乳贮藏蛋白所特有的
面筋强度有关［1］。小麦贮藏蛋白分为麦谷蛋白和
麦醇溶蛋白。根据麦谷蛋白亚基在单向十二烷基磺
酸钠 －聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的迁移率
不同，将其分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)
和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)。LMW-GS 是
麦谷蛋白的重要组成部分，约占麦谷蛋白总量的 60
3551
2012 年 25 卷 5 期
Vol. 25 No. 5
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
%左右，占种子贮藏蛋白的 1 /3，对面团延展性和食
品加工品质有重要影响，是小麦品质改良的主要目
标之一［1］。LMW-GS主要由位于第一同源群 1A、1B
和 1D 染色体短臂末端的 Glu-A3、Glu-B3 和 Glu-D3
位点基因编码［2 ～ 3］。根据等电点和分子量的不同，
LMW-GS分为 B、C 和 D 3 种类型，其中 B 和 C 型
亚基的分子量分别为 42 ～ 51 和 31 ～ 36． 5 kDa［4］。
典型的 LMW-GS 包含由 20 个氨基酸组成的信号
肽、13 个氨基酸组成的 N-末端保守区、重复区和 C-
末端区。重复区内富含脯氨酸(P)和谷氨酰胺
(Q)。C-末端区又可分为 3 个亚区，即半胱氨酸富
集区(C-末端Ⅰ)、谷酰胺富集区(C-末端Ⅱ)和最终
保守区(C-末端Ⅲ)［5］。Lew 等［6］根据成熟蛋白 N-
末端第 1 个氨基酸的差异，即甲硫氨酸(M)、丝氨酸
(S)和异亮氨酸(I) ，将 LMW-GS 分为 3 种类型:
LMW-m、LMW-s 和 LMW-i型。LMW-GS一般含有 8
个半胱氨酸残基，第 1 个和第 7 个能形成分子间二
硫键，其它 6 个半胱氨酸残基参与形成分子内二硫
键，将 LMW-GS和 HMW-GS 连接到一起，聚合为麦
谷蛋白大聚体。其中，第 1 个和第 7 个半胱氨酸残
基在位点上存在变异，不能正常形成分子间二硫键
是导致 LMW-GS 结构和功能差异的主要原
因［1，7 ～ 8］。Ikeda 等［9］根据已发表 LMW-GS 基因推
测的氨基酸序列中半胱氨酸残基的相对位置，将
LMW-GS分为 6 类(TypeⅠ-TypeⅥ)。
西藏地区的海拔、气温、气候等自然条件与我国
其它地区差异较大，前人已在形态学、品质、分子标
记等方面开展了对西藏小麦地方品种的研究，发现
西藏地区小麦种质资源的遗传多样性较为丰富，可
作为改良小麦品质的基因库资源［10］。但目前对西
藏小麦地方品种 LMW-GS 基因的研究较少，因此本
研究选取西藏小麦地方品种作为材料克隆 LMW-GS
基因。
1 材料与方法
1． 1 材料
西藏小麦地方品种:安饶白粒麦，藏木春，帮达
冬麦-2 和白卓麦被用于 DNA 的提取及 LMW-GS 基
因的克隆。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA 的提取 取室内培养 3 ～ 5 d
的幼嫩叶片为材料，用 CTAB 法提取基因组
DNA［11］。
1． 2． 2 LMW-GS 基因编码区 PCR 扩增 以西藏小
麦地方品种基因组 DNA 为模板，用 LMW-GS 特异
引物 P1: 5’-ATGAAGACCTTCCTCGTCTTTG-3’，
P2:5’-TTATCAGTAGGCACCAACTCC-3’(Sangong
公司合成)扩增目的基因［12］。该对引物分别位于
LMW-GS基因编码区的信号肽和 C-末端，扩增片段
包含 LMW-GS 基因的启动子和终止子，大约 900
bp。PCR 体系为 20 μl，包含 100 ng DNA，25 μl 2
× GC buffer II(含有 MgCl2) ，0． 5 mM dNTP，0． 5 μM
正反向引物和 2． 0 U 高保真 Taq 酶(TransGen)。
PCR 程序为 95 ℃ 预变性 4 min;94 ℃ 30 s，57 ℃
30 s，72 ℃ 50s，35 个循环;72 ℃延伸 10 min。
1． 2． 3 PCR 扩增产物回收及克隆测序 用 1． 0 %
琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增产物，用 DNA 回收
试剂盒(BIOMIGA)进行目的片段的回收与纯化。
DNA纯化产物连接 PGM-T 载体(Tiangen) ，并将其
转化感受态细胞 TOP10(Tiangen)进行蓝白斑筛选。
挑选白斑进行菌落 PCR 检测，筛选阳性克隆，反应
引物、体系和条件与目的基因扩增时一致。随机挑
选至少 3 个以上阳性克隆送测序公司(SINOGENO-
MAX)测序。
1． 2． 4 序列分析和系统进化树分析 用 DNA-
MAN5． 2． 2 和 Bioedit7． 0 两个软件分析 LMW-GS基
因的核苷酸序列和 LMW-GS 的氨基酸序列。推断
的氨基酸序列分子量在 Expasy(http:/ /www． ex-
pasy． ch / tools /pi _ tool． html)上预测。用 DNAMAN
5． 2． 2 构建系统进化树。
2 结果与分析
2． 1 PCR扩增和 LMW-GS基因的克隆
用引物组合 P1 和 P2 对西藏小麦地方品种的
基因组 DNA进行 PCR 扩增，扩增产物在 1． 0 %的
琼脂糖凝胶上电泳分离，分别可见 1 条约 900 bp 的
4551 西 南 农 业 学 报 25 卷
DNA 片段(图 1) ，这些片段的大小与小麦 LMW-GS
基因编码区的长度接近。经回收、纯化、连接到
PGM-T载体上并转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞，
挑取多个单克隆进行菌落 PCR检测，选取阳性克隆
送测序公司测序。序列分析后得到 4 个 LMW-GS
基因，将其命名为 LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和
LMW-T4，其相应的 GenBank 登录号为 JQ796685、
JQ796686、JQ796687 和 JQ796689，4 个基因的结构
特征如表 1 所示。
2． 2 LMW-GS基因的核苷酸序列和 LMW-GS 的氨
基酸序列分析
LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和 LMW-T4 都具有
完整的编码区，编码区内无内含子，包括起始密码子
ATG和典型的双终止密码子序列 TGATAA。表1可
知，LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和 LMW-T4 编码区全
长分别是 930、930、897 和 915 bp，其分别编码 308、
308、297 和 303 个氨基酸。根据氨基酸序列预测的
蛋白质分子量为 32938． 40、32978． 42、31624． 88 和
32122． 20 Da，都属于 C 型亚基。
将 LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和 LMW-T4 与
已发表的其它 LMW-GS 的氨基酸序列用 Bioedit7． 0
进行序列比对分析，结果如图 2 所示。LMW-T1、
LMW-T2、LMW-T3 和 LMW-T4 具有典型的 LMW-GS
的结构特征，包含信号肽、N-末端、重复区、C-末端
Ⅰ、C-末端Ⅱ、和 C-末端Ⅲ，这 4 个 LMW-GS的 N-末
端的第1个氨基酸为甲硫氨酸，因此，它们属于 LMW-m
信号肽，N-末端，重复区，C-末端 I，C-末端 II和 C-末端 III分别用箭头表示，半胱氨酸用方框表示，与 LMW-1 氨基酸相同的用点表示，插入与
删除用短线表示
Signal peptide，N-terminal domain，repetitive domain and C-terminal I，II，III domain were indicated by black arrows． Cysteine residues were boxed by
solid lines． Common sequences with LMW-1 and deletions in all sequences were indicated by dots and dashes，respectively
图 2 小麦低分子量麦谷蛋白氨基酸序列比对
Fig． 2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of glutenin subunits from wheat
55515 期 兰秋霞等:4 个西藏小麦地方品种低分子量麦谷蛋白亚基基因的克隆及分析
图 3 低分子量麦谷蛋白基因系统进化树
Fig． 3 The phylogenetic tree of LMW-GS genes
型。含有 8 个半胱氨酸残基，且 LMW-T1、LMW-T2
和 LMW-T3、LMW-T4 的第 7 个半胱氨酸残基的位
置不同。根据 Ikeda 等［9］的分类方式，LMW-T1 和
LMW-T2 属于 TypeⅢ类型，LMW-T3 和 LMW-T4 属
于 TypeⅤ类型。LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和
LMW-T4 相对于其它 LMW-GS存在许多的氨基酸插
入、缺失和替换。LMW-T1 和 LMW-T2 在重复区插
入了一段 SPFPQQQ。LMW-T1 和 LMW-T2 在 C-末端
Ⅱ区缺失一段 QLGQCSFFQQPQQ。 LMW-T1 和
LMW-T2 的第 49 位由 P 替换成 L;LMW-T3 的 192
位和 LMW-T4 的 56 位都由 Q替换成了 R。
2． 3 LMW-GS基因的进化树分析
将本研究获得的 4 个 LMW-GS 基因与 9 个
LMW-m基因，5 个 LMW-s 基因和 6 个 LMW-i 基因
一起构建系统进化树(图 3)。所有的 LMW-GS基因
的相似性均很高，达到 62 %，可知这些 LMW-GS 基
因可能起源于同一个祖先。LMW-GS基因很明显的
聚成 3 类:LMW-m、LMW-s 和 LMW-i 基因类，这与
Lew 等［6］的分类结果一致。 LMW-T2、LMW-T3、
LMW-T4 和 LMW-m 型基因聚在一类，这与之前由
N-末端的第一个氨基酸为甲硫氨酸而推断其属于
LMW-m类的结果一致。但是 LMW-T1 虽然 N-末端
的第 1 个氨基酸为甲硫氨酸，但 LMW-T1 和 LMW-s
型基因聚为一类，推断 LMW-m和 LMW-s比 LMW-m
和 LMW-i的亲缘关系近。基因结构分析和进化树
分析可知 LMW-m 为最古老的类型，由于基因突变
和 DNA 片段删除等原因，LMW-s 和 LMW-i 为
LMW-m的变异类型，这与前人研究得出的与 LMW-
s是由 LMW-m 演化而来，LMW-i 是由二倍体 A 基
因组的某一类 LMW-m 演化而来的进化关系相
符［13 ～ 15］。
3 讨 论
本研究从西藏小麦地方品种中克隆到了 4 个
LMW-GS基因，获得了他们的全长序列，对其核苷酸
序列和相应的氨基酸序列进行了分析，并且构建了
进化树分析了这 4 个基因与其它 LMW-GS 基因的
进化关系，研究发现相应的 4 个西藏小麦地方品种
LMW-GS中有 3 个与 LMW-m 聚在一类，这表明西
藏小麦地方品种具备古老 LMW-GS 基因的特征。
这 4 个 LMW-GS基因的克隆不仅丰富了小麦 LMW-
GS的基因库资源，而且对进一步了解 LMW-GS 基
因的系统进化、结构与功能具有重要意义。
在小麦基因组进化过程中，单核苷酸多态性
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(SNP)和插入 /缺失变异(In /Del)是重要的遗传变
异标记，可为分子标记辅助选择提供新的基因标
记［13］。近年来许多科学家已根据单个基因的等位
变异开发出了一系列等位基因的分子标记。
Campenhout等［16］开发了 5 个特异的 Glu-3 位点分
子标记，其中 2 个定位在 1A 染色体上，2 个定位在
1B 染色体上，1 个定位在 1D染色体上。Zhao 等［17］
从粗山羊草 BAC文库中分离了 7 个 LMW-GS基因，
并开发了 2 个 Glu-D3 基因的分子标记。赵永涛
等［13］利用 LMWLDN-M 与 Langdon其它类型的小麦
低分子量谷蛋白基因之间的 SNP，开发了该类型基
因特异的分子标记。LMW-T1、LMW-T2、LMW-T3 和
LMW-T4 相对于其它已发表的 LMW-GS 基因存在许
多的单核苷酸多态性、插入 /缺失，这些单核苷酸多
态性、插入 /缺失可以作为 LMW-GS 基因的特异分
子标记。本研究中克隆的 4 个 LMW-GS 基因可为
小麦品质改良提供新的候选基因。
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(责任编辑 李 洁)
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