全 文 :蝴蝶兰软腐病研究进展
尤 毅, 肖文芳, 李 佐, 陈和明, 吕复兵
(广东省农科院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室,广东 广州 510640)
摘 要:蝴蝶兰软腐病是蝴蝶兰生产中最常见的细菌病害之一,因其防治难、危害严重,越来越引起人们的关
注。 与粮食作物、蔬菜及果树等经济作物相比,蝴蝶兰软腐病的研究开展较迟,研究的深度及广度远不及前者。 综述
了蝴蝶兰软腐病的病原细菌种类、病原分离鉴定方法、软腐病菌研究进展,以及蝴蝶兰与软腐病菌相互作用等方面
的内容,为今后蝴蝶兰软腐病的研究打下理论基础。
关键词:蝴蝶兰;细菌;软腐病
中图分类号:S436.8+1 文献标识码:A 文章编号:1004-874X(2014)01-0061-06
Research progress on Phalaenopsis soft-rot disease
YOU Yi, XIAO Wen-fang, LI Zuo, CHEN He-ming, LYU Fu-bing
(Floricultural Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Lab of
Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China)
Abstract: Soft-rot is the most common bacterial disease on Phalaenopsis. Because it is hard to control, and does
serious harm to agriculture industry, people pay more attention to this disease. Compare to food crops, vegetable, fruit etc,
research on Phalaenopsis soft-rot disease was much later, shallower and narrower. This article summarized the research
advance on pathogen, pathogenic isolation, characterization, bacterial virulence proteins and secretion systems, response
and resistance of Phalaenopsis against infection, for laying a theoretical foundation of research on Phalaenopsis soft -rot
disease.
Key words: Phalaenopsis; bacterial; soft-rot diseases
收稿日期:2013-05-29
基金项目:广东省现代农业产业技术体系建设专项;广东省
农业攻关项目 (2011B020700003); 广东省科技计划项目
(2013B020500003)
作者简介 :尤毅 (1983-),女 ,硕士 ,助理研究员 ,E-mail:
yoyoyou523@126.com
通讯作者:吕复兵(1971-),男,博士,研究员,E-mail:13660
373325@163.com
蝴蝶兰(Phalaenopsis)原产于亚热带地区,是目前
兰科植物中栽培最广、最为流行的种类之一。 蝴蝶兰花
形似翩翩飞舞的蝴蝶,色泽鲜艳,品种繁多,享有“洋兰
皇后”的美誉,由于其花期长,被广泛用作盆花或鲜切
花,是最具商业价值的兰花之一。
蝴蝶兰软腐病是蝴蝶兰栽培过程中的主要病害之
一。 其典型症状为:初期出现水浸状病斑,随即迅速扩
大,感病部位内部组织被细菌分解成液体状态,叶片失
去支撑力下垂,腐烂处发臭,最后病部组织崩溃,内溶
物流出,叶片呈纸状干枯。 该病可在各种苗龄的植株上
发病,常见于叶片。 蝴蝶兰软腐病四季均可发病,有数
据统计表明, 连栋荫棚栽培, 一般季节日发病株率为
0.01%~0.10%,流行季节日发病株率可达 0.3%~0.8%[1],
由于目前尚未发现对软腐病有较好抗性的蝴蝶兰品
种,该病发病后难治愈,发病后期常出现整株植株腐烂
致死,可对蝴蝶兰生产造成毁灭性危害。
当前, 学界对蝴蝶兰软腐病的研究及其成果主要
集中在蝴蝶兰软腐病的特点、病原、发病原因、防治措
施等几个方面。 现从病原及寄主两个层面对蝴蝶兰软
腐病进行综述, 以期为今后蝴蝶兰软腐病的研究奠定
理论基础。
1 蝴蝶兰软腐病病原研究
1.1 病原
引起植物软腐病的病原来自软腐肠杆菌科(Soft-rot
Enterobacterianceae,SRE), 归 属 于 果 胶 杆 菌 属
Pectobacterium 和 Dickeya 两个属。 SRE 在自然界中广
泛存在,能侵染多种植物寄主,严重威胁农业生产。
关于蝴蝶兰软腐病的病原, 国外是在 20 世纪 80
年代首次报道的,经过鉴定,最终确认引起蝴蝶兰软腐
病的病原为菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)[2]。 除菊
欧氏杆菌外, 目前报道引起蝴蝶兰软腐的病原还有胡
萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora sp.carotovora)[3]以及最
近 在 广 州 地 区 栽 培 的 蝴 蝶 兰 上 发 现 的 Dickeya
dieffenbachiae[4],但相比之下,菊欧文氏菌更为常见 [5-7]。
广东农业科学 2014 年第 1期 61
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.01.022
菊欧氏杆菌和胡萝卜软腐欧文氏菌还可侵染大白菜、
马铃薯、魔芋等农作物[8-10],以及马蹄莲等花卉植物[11-12]。
随着分子生物学的发展与亲源分析技术的进步,
欧文氏杆菌属在近 10 年间分类地位变化较大,Hauben
等利用 16S rDNA 序列分析技术将原属于 Erwinia 属
的软腐细菌,重新归类在 Pectobacterium 属中,原本在
Erwinia中的 5个亚种:E.carotovora subsp.atroseptica、E.
c.subsp. betavasculorum、 E.c.subsp.carotovora、 E.c.subsp.
odorifera、 E.c.subsp. wasabia 以 及 E.cacticida、 E.
chrysanthemi 和 E.cypripedii 3 个种,经重新归类后,变
更为 Pectobacterium carotovorum subsp.atrosepticum、P.
c.subsp.betavasculorum、P.c.subsp.carotovorum、P.c.subsp.
odoriferum、P.c.subsp.wasabiae 5 个 亚 种 及 P.
cacticidum、P.chrysanthemi 和 P.cypripedii 3 个 种 [13];
Gardan 等进一步依据 16S rDNA 核酸序列分析与
DNA-DNA 杂交反应的结果 , 再将 Pectobacterium
carotovorum 中 3 个亚种提升至种的地位 , 分别为
Pectobacterium atrosepticum、Pectobacterium betavascu -
lorum和 Pectobacterium wasabiae [14];此外 Samson 等根
据 DNA-DNA 杂交反应、16S rDNA 序列、血清学特性
及表现型相关数据分析等结果, 再将 P. chrysanthemi
归类于新属 Dickeya中[15],命名为 Dickeya chrysanthemi。
除上述两种常见的 SRE 外,2004 年, 我国研究人
员从唐山蝴蝶兰软腐病株上分离得到另外一个属的病
原菌,经鉴定确认为假单胞杆菌属的细菌,由于该病原
仅通过生理生化反应进行鉴定, 故只能鉴定到属 [16]。
2010 年, 在武汉地区栽培的蝴蝶兰软腐病株上也分离
到假单胞杆菌, 经生理生化特征鉴定及 16S rDNA 序
列分析,该病原为 Pseudomonas grimontii[17]。
1.2 病原分离及鉴定
分离病原,一般是把病组织进行表面消毒以后,在
病健交界处取样,经过培养基培养,挑取菌体进行单胞
分离,获得纯化的菌株。 但由于软腐病组织已被细菌分
解,且蝴蝶兰叶片不易切割,故分离蝴蝶兰软腐病菌一
般采用的是病组织液经稀释后,涂布于平板培养基上,
通过单斑分离 [16]。 若针对 D.chrysanthemi 进行分离,可
选用特定的培养基,由于 D.chrysanthemi 是欧文氏杆菌
属中唯一可产生蓝色不溶性色素的成员, 因此可使用
NGM培养基对其进行快速选择性分离[18]。
获得纯化菌株后, 一般是通过对病原细菌的形态
及生理生化指标进行鉴定,即可对病原作出初步判断,
主要包括对细菌进行染色,观察形态,细菌对糖类的利
用能力等,但该方法只能进行粗略的鉴定,一般只能分
类到属,对属以下的分类准确性较差,目前采用较多的
是 Biolog 系统分析、脂肪酸甲酯图谱(FAME)分析方
法、16S rDNA 基因序列分析、 实时荧光 PCR 方法等,
一般对未知病院的鉴定, 可选用两种或以上的分析方
法,最后通过综合数据分析,确定病原菌的分类地位[19]。
吴志毅等除了用常规的细菌学鉴定方法外, 还选择了
病原的 Biolog 鉴定,FAME 鉴定以及 16S 基因序列分
析方法加以辅助, 最终确认引起浙江省蝴蝶兰软腐病
的病原为 E.chrysanthemi[20];诸晓玲等鉴定武汉地区蝴
蝶兰软腐病病原为 Pseudomonas grimontii 时,也使用了
16S 序列分析[17],Zhou等运用相同的方法对广州蝴蝶兰
软腐病原进行鉴定[4]。刘鹏等证明了实时通过荧光 PCR
检测 E.chrysanthemi 的灵敏度要比 PCR 检测法高 100
倍, 检测灵敏度要达到 102 CFU/mL[11]。
2 SRE研究进展
2.1 SRE基因组
许多 SRE植物病原细菌的全基因组或基因组草图
已经完成测定,从基因组序列来看,SRE 在果胶杆菌属
中有 5个成员,在 Dickeya中有 4 个成员[21-23]。SRE具有
一个典型的特征: 具有一个接近 5Mb大小的环状染色
体,无大质粒 [23]。 在 SRE 基因组中,大多数的变异来自
horizontally acquired islands(HAIs),在此区域,基因以
水平转移的方式插入。 SRE基因组中的 HAIs在近亲种
间的变化很大, 主要是与环境生存能力和植物致病力
相关的基因含量方面存在较大差异。 此外,HAIs 中与
Ⅲ型分泌系统、植物毒素、植物细胞壁降解酶及粘附因
子等先关的基因, 有可能是从其他植物病原中转移而
来[24]。
2.2 致病因子
SRE 主要是靠分泌果胶酶、 纤维素酶及蛋白酶等
多种胞外酶使植株发病。 纤维素酶首先降解纤维素,然
后降解寄主的细胞壁,虽然在病菌的整个致病过程中,
纤维素酶不是最主要的致病因子, 但可起到协同侵染
的作用;蛋白酶可降解与抗性相关的蛋白质,并为细菌
蛋白质的合成提供氨基酸原料, 也不是主要的致病因
子[25]。
果胶酶可分解中间薄层和细胞壁的果胶质,造成
组织瓦解,细胞破坏及细胞质渗漏,并释放有利于细
菌生长的营养物质。 果胶酶有着多种不同的作用形
式,包括果胶盐酸裂解酶(pel)、果胶质裂解酶(pnl)、
果胶甲酰酯酶(pme)、多聚半乳糖醛酸酶(peh),这些
酶都是由不同基因编码的。 果胶酸盐裂解酶是果胶酶
中最重要的酶, 在种、 亚种和株系间有较大差异:D.
chrysanthemi 具有 5 个 pel 基因家族 (pelA、palD、palE
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和 pelB、pelC) 以及至少 4 种次级 pel 基因家族(pelI、
pelL、pelZ、pelX),P.carotovora subsp. carotovora 有 4
种 pel 基因家族 (pelA、pelB、pelC、pelD) 而 P.carotovora
subsp. atrosepticay 则只有 3 种 (pelA、pelB、pelC) [26-27]。
在 SRE 侵染植物寄主的过程中,并非所有的果胶酶都
被需要,以 D.chrysanthemi 为例,其 pelA、D 和 E 家族
比 pelB 和 C 家族在致病过程中更为重要; 在不同寄
主中,作为主要毒性因子的果胶酶也有不同,如一个
pelD 的突变体在菊苣叶片上的毒性减弱,但在马铃薯
块茎中没有影响, 另一个 pelD突变体在这两个寄主中
的毒性都增强[28]。
2.3 分泌系统
对病原物而言, 分泌系统是病原菌发挥毒性作用
的关键, 只有当产生于细胞内的各种致病因子被有效
定位到细胞外,方可发挥其致病能力。 SRE编码 6 种已
知的蛋白分泌系统 [21-23],其中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分泌系
统对大多 Pectobacterium 及 Dickeya 而言是最为重要
的。Ⅳ型分泌系统零星出现在 SRE中,且其具体作用尚
未明确,在 P.atrosepticum 中曾研究过Ⅳ型分泌系统的
功能,但发现其与致病性的关系不大[23]。 Ⅴ型和Ⅵ型分
泌系统主要在病菌的依附能力及/或与其他微生物的竞
争力方面发挥作用。
2.3.1 Ⅰ型分泌系统 该系统又被成为 T1SS, 由 3 个
亚单元组成,由基因组编码。 分泌过程不需要信号肽,
可直接将蛋白质直接从细胞胞浆送至细胞表面。 在
Pectobacterium 中,植物提取物及酰基高酸酸(AHL)对
其起上调作用,并受 GacAS 基因调控 [29-30]。 在 Dickeya
中,T1SS由 PecS和 GacAS调控[31-32]。 T1SS主要分泌与
细菌毒性相关的金属蛋白酶[31],金属蛋白酶一方面可攻
击植物细胞壁上的蛋白质, 另一方面作用于细菌分泌
的酶类,从而影响它们的活性。 植物细胞壁上的目标蛋
白尚未明确,但在 Dickeya 中,金属蛋白酶可断开 PelI
羧基端的残基, 所产生的蛋白质虽然活性上没有太大
的改变,但更小更基础,可在植物内作为防御诱导因
子 [33]。最近 Pérez-Mendoza 发现了第 3 种 T1SS,该 T1SS
受 二 鸟 甘 酸 环 化 酶 调 控 , 并 分 泌 粘 附 素 , 与
Pectobacterium 的毒性密切相关[34]。
2.3.2 Ⅱ型分泌系统 Ⅱ型分泌系统(T2SS)广泛存在
于革兰氏阴性细菌, 大多数植物细胞壁降解酶是通过
Ⅱ型分泌系统分泌至胞外。 虽然Ⅲ型分泌系统对细菌
的致病性贡献最大,当 hrp 基因缺失后,细菌仍可通过
T2SS 分泌各种植物细胞壁降解酶及多种毒性因子,破
坏寄主细胞,导致寄主组织坏死,具有侵染和系统定殖
维管束的能力,因此,T2SS在细菌致病性方便的贡献也
不可忽视[35-36]。
SRE 的Ⅱ型分泌系统主要以分泌途径转膜蛋白
(probable general secretory pathway transmembrane
protein,GSP)基因簇为中心,由 12 个核心蛋白组成:C、
F、L、M 和 N 在内膜形成一个平台,D 是唯一位于外膜
上最大的一个蛋白,起到通道的作用,E 是唯一位于细
胞质中的蛋白,可通过 L蛋白为整个系统提供能量。G、
H、I、J和 K存在于细胞周质,被前菌毛肽酶加工成短菌
毛[37-39]。 T2SS 的表达与酶的分泌受一些列小分子物质
控制, 这些小分子物质包括果胶碎片、 植物有机酸及
AHL等[40]。
T2SS 将蛋白从胞内运输到胞外需要两步转移:蛋
白首先通过 Sec 途径(sec-dependent pathway)或双精
氨酸途径(twin-arginine pathway,Tat)被转移到细胞质
膜上,然后再通过 GSP从外周胞质跨国外膜到胞外[41]。
2.3.3 Ⅲ型分泌系统 Ⅲ型分泌系统(T3SS)与 T1SS 都
是一步性分泌且不被加工, 但Ⅲ型分泌系统需要较多
蛋白参与, 是一类复杂的超分子结构。 SRE 除鞭毛
T3SS外,还有另一个 T3SS。与 Pseudomonas syringae 不
同,SRE的效应蛋白相对较少,包括少数的 harpin、辅助
蛋白以及一个已知的效应因子 DspA/E。 T3SS由 hrp基
因和 hrc基因编码,在植物致病菌中,由 III 型分泌系统
运输的效应蛋白有不同的活性, 依赖于植物是否对细
菌毒力有亲和性。 在非亲和的植物上,通过 III 型分泌
系统运输的效应子激发一种防卫反应称为过敏反应,
它的特征是在接触致病菌后快速诱导植物细胞程序性
死亡。 在亲和植物上,细菌在细胞间的空间持续生长和
传播,产生可见的症状[42]。
自然界中存在这缺少 T3SS 的 Pectobacterium 和
Dickeya株系,表明 T3SS对 SRE的生存并不是必须的。
缺乏 T3SS 的 Pectobacterium 在叶片上不表现毒性,但
可使马铃薯茎杆和块茎产生病斑[43-44]。 对Pectobacterium
和 Dickeya 的 T3SS 的功能研究结果显示,当对 dspA/E
和辅助蛋白 hrpN 进行突变,毒力明显变化:在病原与
寄主建立侵染关系的过程中,dspA/E 起着相当重要的
作用, 并与坏死症状的发展密切相关;HrpN 蛋白可在
非寄主植物上引起 HR 反应, 但在寄主植物上的作用
却不完全相同,如 hrpNEch 在菊苣上表现出弱致病性,
而 hrpNEcc的致病性则不受影响[45]。
细菌的鞭毛,赋予了细菌活动的能力,SRE 具有周
生鞭毛,被认为是 T3SS 的亚型。 与丁香假单胞菌不同
的是,SRE 在侵染过程中是可移动的,但在移动过程中
是否分泌蛋白酶或细胞壁降解酶目前尚未知。 鞭毛分
泌系统还与微生物间的相互作用相关: 分泌系统分泌
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一种微生物毒素——大肠杆菌素, 可杀死周围紧密相
关的细菌[46]。鞭毛及其毒素基因受主要调节因子 FhlDC
的控制。
谈及细菌的活动性, 在此顺带介绍 SRE 对化学物
质的趋向性,其中一种重要的化学物质就是茉莉酸。 由
于植物病原细菌缺乏主动进入植物细胞的特殊结构,
因此只能通过气孔、皮孔或者伤口等进入。 茉莉酸在植
物损伤部位产生, 是诱导植物防御机制的重要信号物
质, 在病原细菌侵染过程中, 茉莉酸扮演了双重的角
色:一方面是诱导植物防御机制的信号物质,另一方面
是病原细菌的引诱剂[47]。
2.4 致病因子的调控
SRE 的致病因子被复杂的调控网络控制着, 其中
对降解中间产物的调控与细菌群体感应系统的研究较
多。 当果胶酶降解植物细胞壁中的果胶质和果胶酸盐
时,会产生一系列的降解产物(5-酮基 4-脱氧核糖、2,5-
二酮醇脱氧核糖和 2-酮基 3-脱氧核糖), 当中间产物
逐渐增多,便与转录抑制子 KdgR 相互作用,使得原本
结合在不同基因操纵子保守结合位点的 KdgR 从结合
位点上解离从而诱导致病因子的产生[48]。另一种调控方
式是通过病菌的数量实现的。 当病原菌数量在植物体
内增加到一定程度(约为 106个/mL),由病原菌基因编
码的一种小分子可信号物质 N-高丝氨酸内酯(AHLs)
的量在细菌群体中达到一个值,便可诱导 expR 和 carR
基因表达, 产生 AHLs,AHLs 起到转录启动子的作用,
诱导细胞壁降解酶以及其他致病因子的产生, 同时又
以反馈调节的方式诱导 expI和 carI基因的表达, 加速
致病因子的产生[49]。
3 蝴蝶兰软腐病发病早期响应机制研究
用 E.chrysanthemi 接种蝴蝶兰,3 h 后,ROS 的含
量明显增加,但 POX 活性在接种 3 h 后下降,到接种
12 h后才恢复至基础水平。 用抑制差减杂交技术对接
种前后蝴蝶兰 EST 变化的研究结果表明, 大部分的
cDNA群体与编码维持氧化反应内稳态、响应病原菌入
侵以及新陈代谢相关蛋白的基因高度一致。 其中有相
当一部分是编码 WRKY、MYB 以及 bZIP 转录因子,表
明病原侵染刺激了胞内的信号转导。在 EST文库中,蝴
蝶兰的一个编码反式烯脂酰-CoA 还原酶(ECR)的基
因值得关注,该基因与超长链脂肪酸(VLCFAs)的生物
合成密切相关。 将该基因转入蝴蝶兰,再通过病毒引起
基因沉默研究该基因的功能,结果表明,缺乏该基因的
植株对 E.chrysanthemi 更加敏感,说明 VLCFAs 在蝴蝶
兰抗病过程中有着重要的作用[50]。
4 蝴蝶兰抗软腐病研究
由于蝴蝶兰及其近亲种属缺乏有效对抗软腐病的
抗性基因, 因此通过常规育种来改变蝴蝶兰的抗性变
得非常困难。 近年来,从芥末中分离得到的抗菌蛋白基
因 WjAMP-1,命名为芥末防卫素基因,其编码的抗菌
蛋白在转基因本生烟中有很强的表达, 并对真菌和细
菌的生长有强烈的抑制作用[51-52]。 于是日本人将此基因
通过农杆菌导入到蝴蝶兰腋芽诱导的胚性悬浮系中,
并成功获得转基因植株。 经 E.carotovora 人工针刺接种
证明,该转基因蝴蝶兰植株对 E.carotovora 有明显的抑
制作用[8]。
5 结语
由于 SRE在自然界中分布广泛,可侵染多种寄主,
给农业生产带来严重的影响。 对于病原的研究,热点主
要集中在一些小分子物质在致病性方面的作用, 目前
已基本了解病原与寄主和介体昆虫的相互关系, 如植
物可检测到病菌分子如 AHL, 而病菌也对植物产生的
生长素、水杨酸、茉莉酸等作出相应的应答。 但仍有许
多问题需要解答: 植物的一些表型是否由于细菌与植
物之间(互作)调节蛋白的直接结果,除Ⅰ、Ⅲ型分泌系
统以外的 4 个分泌系统的作用原理及信号传递等相关
问题。
寄主方面,相对于其他经济作物来说,蝴蝶兰在抗
病方面的研究相对要少得多, 相关的研究尚未引起人
们的足够重视。 从马铃薯对 Pca 抗性遗传研究的结果
来看,其块茎对 Pca的抗性至少由 13 个位点所控制[53],
蝴蝶兰能否借鉴马铃薯, 开展抗软腐病主效 QTL 位点
基因功能研究, 挖掘出重要的与软腐病抗性有关的基
因,并运用晕蝴蝶兰抗病育种,对蝴蝶兰产业具有重要
意义。
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(责任编辑 杨贤智)
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