全 文 ：书蝴蝶兰组培苗生产中褐变现象的发生及其调控
张 和1，2，徐 虹2* ，王 波3
(1．西安职业技术学院，陕西西安 710077;2．西北农林科技大学生命学院，陕西杨凌 712100;3．西安卉杉生态科技有限公司，陕西西安 710309)
摘要 蝴蝶兰是目前兰科植物中栽培最广泛、最普及的种类之一，具有较高的观赏价值和经济价值，市场需求量较大。现阶段，蝴蝶兰
的种苗繁殖多采用组织培养来进行，但由于受褐变、菌类污染和玻璃化现象三大难题的困扰，尤其是褐变现象的发生，严重阻碍蝴蝶兰
的规模化生产。该研究对蝴蝶兰组培苗褐变现象的实质、影响因素及其控制作了有益的探索，以期对蝴蝶兰种苗生产有所帮助。
关键词 蝴蝶兰; 组织培养;褐变;控制
中图分类号 S682． 31 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 35 －13457 －02
Browning and Browning Control of Phalaenopsis amabilis Bl． in Tissue Seedling Production
ZHANG He et al ( Xi’an Vocational and Technical College，Xi’an，Shaanxi 710077)
Abstract Phalaenopsis amabilis Bl． is the most popular variety among the Orchidaceae with high ornamental and economic value，high mar-
ket demand． P． amabilis Bl． propagates by tissue culture and is always influenced by browning，fungi pollution and vitrification． Browning re-
strains the scale production of P． amabilis Bl． seriously． This paper explores the essence and influence factors，and control of browning in tis-
sue seedling production，so as to improve the production of P． amabilis Bl．
Key words P． amabilis Bl． ; Tissue culture; Browning; Control
作者简介 张和( 1972 － ) ，男，陕西咸阳人，副教授，在读硕士，从事园
林植物栽培与养护管理方面的研究。* 通讯作者，副教授，
博士，硕士生导师，从事植物生化与分子生物学、植物细胞
工程育种等领域方面的研究。
收稿日期 2013-11-15
蝴蝶兰是单子叶植物纲天门冬目兰科蝴蝶兰属多年生
附生植物，又称蝶兰，原产于菲律宾、印度尼西亚、泰国、马来
西亚和我国台湾等地，是兰科植物中栽培最广泛、最普及的
种类之一［1］。其株型美观，花形奇特，花朵硕大，色彩艳丽，
花期持久，在热带兰中素有“兰花皇后”之美誉，是国际流行
的名贵花卉，有较高的观赏和经济价值，备受消费者青睐［2］。
近年来，蝴蝶兰产业在我国迅速发展，生产蝴蝶兰的大中型
企业已达 100多家，且数量仍在不断增加［3］。
蝴蝶兰是单茎气生兰，很少发育侧枝，常规无性繁殖系
数很低，速度很慢，远不能满足商品化生产的需求;另外，其
种子极为细小，发育不完全，种子不含为胚萌发提供营养的
胚乳，只有一层极薄的种皮，在自然条件下萌发率极低。同
时，种子萌发而来的实生苗还易于发生基因变异，不能保持
亲本的优良性状，失去商业和观赏价值，因此很难采用常规
分株方式进行无性繁殖和采用播种方式进行有性繁殖［4］。
利用组织培养的方法对蝴蝶兰进行种苗繁殖，具有增殖率
高、繁殖速度快、不受季节变化的限制、可周年生产等特点，
成为蝴蝶兰大量繁殖的最有效手段。这是目前蝴蝶兰大规
模种苗生产的唯一途径［5］。
1 蝴蝶兰组织培养过程中褐变现象的发生
在蝴蝶兰组织培养过程中，褐变现象、菌类污染和玻璃
化现象并称为蝴蝶兰组织培养的三大难题，尤其是褐变，严
重影响外植体的分化。许传俊等［6］认为，通过控制褐变比控
制污染和玻璃化更困难，能否有效地控制褐变是蝴蝶兰组培
能否成功的关键。
褐变现象是指蝴蝶兰在组织培养过程中，自身从表面向
培养基释放褐色物质，使培养基逐渐变成褐色，反过来毒害
自身，导致褐变死亡的现象。通常，有非酶促褐变和酶促褐
变 2种。非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影
响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡、坏死形
成的褐变现象，不涉及酚类物质的产生。酶促褐变是由多酚
氧化酶(PPO)作用于天然底物酚类物质而引起的，又称酚污
染。周俊辉等［7］认为，酶促褐变如同一般的酶促反应，引起
褐变的 3 个基本条件是酶、底物和氧气。印芳等［8］研究认
为，酚类化合物是酶促褐变的天然底物。蝴蝶兰品种不同，
导致其褐变的酚类物质的种类和含量不同。引起褐变的酶
有多酚氧化酶、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)
等。3种酶对蝴蝶兰组织褐变都有重要的影响。
2 褐变现象的生化机理
褐变现象是由于建立外植体无菌系时，切口附近的细胞
受伤害，细胞膜的结构被破坏，改变酚类化合物和多酚氧化
酶的分隔状态，使得正常条件下原本较稳定的被质膜分隔在
完整组织以及细胞中的酚类化合物外溢(酚类化合物分布在
细胞的液泡内，酚酶分布在各种质体活细胞质内)［9］。在溢
出过程中，在有氧条件下，与释放或合成的多酚氧化酶相遇，
在组织切口表面发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水，醌类
物质又在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织蛋白中的蛋白
质发生聚合，形成黑褐色物质(羟醌与黑色素等)。这些褐色
或黑色物质逐渐扩散到整个培养基中，抑制其他酶的活性，
毒害整个外植体组织，从而引起组织代谢活动紊乱，导致组
织生长停滞，引起褐变发生，最终死亡［10］。
酚类物质由苯丙烷代谢途径合成。苯丙氨酸解氨酶是
催化苯丙烷代谢的关键酶和限速酶。酚类物质的合成与积
累与苯丙氨酸解氨酶活性密切相关。印芳等［11］研究指出，
蝴蝶兰组织褐变与外植体总酚含量正相关或与褐变前后总
酚含量的变化相关。引起不同蝴蝶兰品种褐变的酚类物质
不同。酚类物质的种类可能与蝴蝶兰组织褐变的关系更为
密切。赵滢等［12］研究认为，蝴蝶兰组培褐变程度随苯丙氨
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(35):13457 － 13458，13463 责任编辑 刘月娟 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.35.090
酸解氨酶活性增加而增强，通过干扰苯丙氨酸解氨酶活性，
抑制酚类化合物的合成与积累，有效地减少褐变。印芳
等［8］研究认为，多酚氧化酶是一类催化氧化酚类物质的酶，
位于细胞的质体内。当植物体受到机械损伤时，膜结构瓦
解，多酚氧化酶活性增加，促进褐变反应。过氧化物酶可利
用切割时释放的 H2O2 来催化酚类物质的氧化，引起褐变
发生。
3 引起蝴蝶兰组培苗褐变的因素
蝴蝶兰组织培养过程中的褐变现象是因多种因素综合
作用的结果。这些因素包括蝴蝶兰品种及其基因型、外植体
来源、年龄、生长部位和生理状况以及大小和取材时间、外植
体消毒方式、培养基配方、光照强度、培养温度等。
3． 1 品种差异 不同品种蝴蝶兰褐化难易不同，因其总酚
含量、多酚氧化酶活性的关系而异。马莉贞［10］研究发现，有
些品种和多酚氧化酶活性相关，有些与总酚含量相关，而有
些与两者均相关。
3． 2 外植体年龄、大小及受伤害程度 在蝴蝶兰组织培养
中，幼龄材料褐变一般比成龄材料轻。杨海芸等［13］以不同
叶龄的叶片为外植体接种后发现，以 45 d试管苗为外植体，
组培褐变最轻。外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害、
褐变的程度也越大。刘真华等［14］以蝴蝶兰叶片 1． 0 cm ×
1． 0 cm大小的叶块作为外植体进行组织培养，褐变较轻。外
植体消毒时间越长，消毒效果越好，但褐变越严重，因此应尽
量在满足消毒效果的前提下减少消毒时间。
3． 3 取材部位及时期 林宗铿等［15］用幼嫩器官或组织进
行培养褐变较轻，用高度分化的叶片作外植体则褐变较重。
植物在生长季节含有较多的酚类化合物，多酚氧化酶活性较
强，故夏季取材褐变较重。
3． 4 光照强度 光能提高多酚氧化酶活性，促进组织培养
中酚类物质的氧化，加重外植体的褐变程度。
3． 5 温度 低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧
化酶活性，减轻酚类氧化，减少褐变。
3． 6 pH 酸性环境不利于褐变过程的发生。培养基低 pH
可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，有效地抑制褐变。
3． 7 培养基的选择 蝴蝶兰组织培养采用的基本培养基
有 MS、1 /2MS、VW、B5、KC、花宝及其改良型等［16］。不同的
蝴蝶兰品种和外植体对培养基的选择不同，其中以 MS基本
培养基最常用。适当减少培养基中大量元素和部分微量元
素有利于控制褐变，增加分化。培养基中外源激素、矿质元
素及蔗糖的浓度也会对蝴蝶兰的褐变产生影响。
3． 8 转瓶周期 缩短转瓶周期可减轻褐变。但是，蝴蝶兰
的群体效应很明显，单芽易褐化死亡;刚诱导出的原球茎状
体不能过早切割转移;接种时，还要避免切成单芽，切块也不
宜过小，否则易褐变［17］。
4 控制蝴蝶兰组织培养褐变的措施
目前，控制蝴蝶兰组培过程中褐变的措施主要有选取幼
龄外植体，对外植体材料预处理，培养基中添加吸附剂和抗
氧化剂，连续转移外植体等方面。而选择适当的外植体并建
立最佳的培养条件是抑制蝴蝶兰褐变的最重要手段［18］。
4． 1 选择适宜的外植体 在蝴蝶兰组织培养中，外植体应
选择具有优良基因品种的生长旺盛的组织或器官。蝴蝶兰
组培中以根尖、茎尖、叶片、花梗芽、花梗节间等器官为外植
体，其中幼叶或花梗腋芽更为普遍［16］。取叶片培养，对蝴蝶
兰母株伤害不大，也不受植株开花与否的限制［19］。组织培
养中切割越小，褐变越重，切块 8 ～ 15 mm 时较适宜。切割
中，尽量减小伤口面积，缩短在空气中暴露的时间［10］。在最
适宜时期取材，夏季材料比冬季、早春和秋季材料的褐变严
重，而冬季的芽不易生长，所以要避免在夏季和冬季采芽，最
好选用早春和秋季的材料。
4． 2 外植体材料预处理 外植体的预处理主要包括暗培
养、流水冲洗和低温处理、抗氧化剂预处理、热激处理等。
4． 2． 1 暗培养。将外植体材料放在黑暗条件下培养一段时
间，可以有效减轻褐变。赵伶俐等［20］发现，以黑暗预处理 10
d的组培苗褐变最轻。
4． 2． 2 流水冲洗和低温处理。对外植体进行流水冲洗等预
处理，然后进行低温(2 ～5 ℃)处理 12 ～ 24 h，可有效地控制
褐变。
4． 2． 3 抗氧化剂预处理。用抗氧化剂溶液进行预处理能起
到减轻褐变的作用。如，将外植体在半胱氨酸(100 mg /L)
溶液中浸泡 2 ～4 h有利于控制褐变。
4． 2． 4 热激处理。杨玲等［21］将蝴蝶兰组培苗在 45 ℃条件
下热激处理10 min，处理后48 h接种的褐变最轻，处理后24、
72 h接种的褐变程度稍轻，热激处理后立即进行接种的褐变
程度反而最重。
4． 3 选择适宜的培养基 不同的外植体适用于不同的基
础培养基，茎尖使用 1 /2MS和 MS，根尖使用 MS和 B5，叶片
采用改良 KC，褐化较轻，分化较好。叶片最好采用液体培养
基，从而加快有毒物质扩散，减轻褐变。另外，培养基的状
态、组成、生长调节物质及组合等均要适宜。
4． 3． 1 无机盐。在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高
会引起酚类物质外溢，加剧褐变。降低盐的浓度，尤其是降
低 Mn2 +、Cu2 +和 Fe3 +浓度，可减少酚类物质外溢，降低酶活
性，抑制氧化，从而减轻褐变。
4． 3． 2 植物激素。在基本培养基中添加适量激素或其他添
加物可显著改变褐化。目前，在蝴蝶兰组织培养中常用的激
素有 GA3、6-BA、NAA、2，4-D和 IAA等。蝴蝶兰组织培养中
常用的细胞分裂素为 6-BA，较高浓度(1 ～ 8 mg /L)能促进蝴
蝶兰增殖，但易引起褐化，所以在满足促进蝴蝶兰分化生长
的同时，应尽可能采用较小浓度(2． 0 mg /L)［17］。
4． 3． 3 其他成分。应减少培养基中蔗糖浓度。有研究表
明，使用 30 g /L蔗糖的MS培养基褐变要比使用 15 g /L蔗糖
的 MS培养基时严重得多;培养基中加入浓度 10% ～ 15%椰
乳能减少褐变，还能促进生长［12］。培养基中，应尽量使用硬
度低的水质，减少对培养基中无机盐浓度的影响，间接地减
少外植体的褐变。
(下转第 13463页)
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1444 －1447．
( 上接第 13458页)
4． 4 选择适宜的培养条件 较强的光照和较高的温度，可
以提高多酚氧化酶活性，从而使酶促褐变加强。接种后在培
养初期保持较低的温度(0 ～ 15 ℃) ，黑暗或弱光下预处理可
有效减轻褐变。培养基低 pH可有效地减少褐变。生产中，
pH最好保持在 5． 4 ～5． 5。
4． 5 使用抑制剂和吸附剂 在对蝴蝶兰进行组培时，在培
养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂可抑制外植体的酶促褐
变。这是防止褐变的有效措施。刘真华等［14］认为，常用的
抗氧化剂有抗坏血酸(VC)、柠檬酸、半胱氨酸及其盐酸盐、
谷胱甘肽、硫代硫酸钠、二硫苏糖醇等，吸附剂主要有活性炭
(AC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。
用过滤灭菌后的抗氧化剂溶液预先处理外植体，用它洗
涤刚切割的外植体伤口表面，或直接在抗氧化剂溶液中切割
和剥离外植体，也可以将几种抗氧化剂结合使用，还可以将
抗氧化剂加入到培养基中，一般采用浓度为 50 ～200 mg /L。
在培养基中加入 0． 5% ～ 1． 0%的吸附性较强的无机吸
附剂活性炭，能吸附培养基中的有害物质，防止褐变，有利于
生长。但是，活性炭吸附的选择性很差，同时能吸附培养基
中的激素。在使用过程中，应尽可能使用最小浓度，同时适
当提高培养基中激素的浓度。粉末状的活性炭与颗粒状的
活性炭相比吸附性更强，使用中应更加注意。活性炭温度低
时吸附力增强，温度高时吸附力减弱，甚至会解吸附，由于培
养温度的不同，活性炭使用的量也不同［22］。
聚乙烯吡咯烷酮是酚类物质的专一吸附剂。生产中，为
防褐变常采用，使用浓度一般在 0． 3%(0． 7 g /L)左右［23］。
4． 6 进行筛选和多次连续转移 在组织培养过程中，常进
行筛选。适时切除培养物的褐化部分并及时更换新鲜培养
基，能有效抑制外植体褐变死亡。尤其在使用液体培养基的
情况下，这种方法相当有效。但是，应注意不能影响企业生
产，否则加大生产成本，生产中，一般没有实验室中那么严
格，只要能把褐变控制在一定范围即可。只要褐变没有转移
到外植体上，就可以不进行转移，哪怕培养基已经出现褐变。
要有利于企业生产安排，又不致外植体发生褐变，选择合适
的周转周期很重要，目前控制在 45 ～60 d。
5 结语
在蝴蝶兰组织培养过程中，褐变是不可避免的问题。蝴
蝶兰组培褐变是一个非常复杂的生理代谢过程。它的发生
往往是多种因素共同作用的结果。搞清楚蝴蝶兰组培中褐
变的机理，明确蝴蝶兰褐变的成因，才能对其进行有效的调
控。对蝴蝶兰褐变的调控涉及多个方面。蝴蝶兰不同的品
种，基因型不同，褐变中所产生的酚类物质种类和量都会不
同，在培养过程中解决褐变办法也就不同。蝴蝶兰组培生产
中，应结合生产实际，采取相应的控制蝴蝶兰的适合方法，做
到切实有效，降低蝴蝶兰种苗生产中的经济损失。
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