全 文 ：［收稿日期］ 20101103(005)
［基金项目］ 云南省教育厅科研项目(09Y0361);大理市科技
局项目(2009SF08)
［通讯作者］ * 周浓，讲师，从事药用植物栽培与质量控制研
究，Tel:0872-2257411，E-mail:erhaizn@ 126. com
滇重楼不同生长发育期化学成分的变化规律
周浓 * ，段宝忠，夏从龙，徐萍，杨现好
(大理学院药学院，云南 大理 671000)
［摘要］ 目的:建立滇重楼 HPLC 指纹图谱，考察滇重楼不同生长期主要化学成分的变化。方法:采用高效液相色谱法。
色谱柱为 Agela Venusil XBP-C18柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm);流动相乙腈-水，梯度洗脱;流速 1. 0 mL·min
－ 1;检测波长 210 nm;
柱温 35 ℃。结果:滇重楼中所含成分的各色谱峰均得到了有效的分离，在指纹图谱中共有峰 20 个，并指认了 4 个色谱峰。滇
重楼化学成分随生长期的不同而各异。结论:该方法为滇重楼质量控制以及实现规范化种植提供了参考依据。
［关键词］ 滇重楼;重楼皂苷;HPLC;指纹图谱;质量控制
［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)05-0070-04
Research on Changing Regulation of Ingredients in Paris polyphylla
var. yunnanensis at Different Growth
ZHOU Nong* ，DUAN Bao-zhong，XIA Cong-long，XU Ping，YANG Xian-hao
(College of Pharmacy，Dali University，Dali 671000，China)
［Abstract］ Objective:To establish HPLC chromatographic fingerprint of Paris polyphylla var. yunnanensis
and investigate variation of the main components in samples at various collecting seasons. Method:The main com-
ponents were separated on a Agela Venusil XBP-C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)column and detected at 210 nm by
gradient elution at the flow rate of 1. 0 mL·min － 1 using acetonitrile-water as the mobile phase. Column temperature
was at 35 ℃ . Result:A satisfactory method for HPLC fingerprint determination of P. polyphylla var. yunnanensis was
obtained. The established fingerprint showed that 20 peaks were common and 4 peaks were identified. The main com-
ponents of P. polyphylla var. yunnanensis differed from collecting seasons. Conclusion:The method can be used for
quality control and provide a valuable reference for Good Agriculture Practice of P. polyphylla var. yunnanensis.
［Key words］ Paris polyphylla var. yunnanensis;paridis saponins;HPLC;fingerprint;quality control
滇重楼系百合科植物云南重楼 Paris polyphylla
Smith var. yunnanensis (Franch.)Hand. -Mazz.的干燥
根茎［1］，为《中国药典》收载的常用中药材，具有抗癌、
止血、镇痛、镇静等生物活性，应用广泛［2］。在云南，
重楼又是一些著名中成药云南白药、宫血宁胶囊、楼
莲胶囊等的主要原料之一，每年仅云南省的用量就达
数百吨，市场需求量较大。由于长期掠夺式的采挖，
资源日益减少，重楼的工业药用原料严重紧缺，现已
列为云南省 30 种稀缺濒危天然药物之一［3］。
滇重楼的主要活性成分是甾体皂苷类化合物，
占已分离鉴定的 50 余种化合物的 80%以上，其苷元
主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷
元［2］。众所周知，单一或少数几个指标性成分的含
量测定往往难以反映中药整体质量，而指纹图谱具
有系统性、特征性和重现性等特点，能较全面反映中
药品质，现已成为中药质量评价和控制研究的热点
之一［4-6］。植物的不同生长发育阶段，其有效成分积
累有差异［7］。因此，为更科学、合理和有效地利用该
药材，本实验采用 HPLC 梯度洗脱，结合 4 种重楼皂
苷对照品，建立了云南产不同采收期滇重楼的指纹
·07·
第 17 卷第 5 期
2011 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 5
Mar.，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.05.046
图谱，以期为滇重楼药材全面的质量控制、最佳采收
期的确定、资源的合理利用、规范化种植与采收提供
可靠的科学依据。
1 仪器与试药
1100 LC 高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司，
真空在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，DAD
检测器，Agilent chemstation 化学工作站);KQ-250B
型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-
2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZ-Ⅲ
循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);
AE240 天平［梅特勒-托利多仪器(上海)有限公
司］;FZ102 型微型植物试样粉碎机(北京中兴伟业
仪器有限公司)。
重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ对照品(中国药品生物制
品检 定 所，批 号 分 别 为 111590-200402，111591-
200402，111592-200402，111593-200402，供含量测定
用);乙腈为色谱纯(美国 Tedia 试剂公司)，水为娃
哈哈牌纯净水，其他试剂均为国产分析纯。
滇重楼 7 份样品于 2009 年 4 ～ 10 月期间采自
云南省云龙县关坪乡种植基地，并经大理学院药学
院生药学教研室马晓匡教授鉴定为百合科植物云南
重楼 Paris polyphylla var. yunnanensis 的干燥根茎。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Agela Venusil XBP-C18 色谱柱
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm);流动相乙腈(A)-水
(B)，进行梯度洗脱(表 1);检测波长 210 nm;柱温
35 ℃;流速 1. 0 mL·min － 1;进样量 10 μL。
表 1 滇重楼指纹图谱流动相线性梯度
t /min 乙腈 /% t /min 乙腈 /%
0 20 58 52
11 25 73 64
14 28 83 71
24 32 93 76
34 38 100 86
43 42 120 86
52 46
2. 2 溶液的配制
2. 2. 1 对照品溶液的制备 分别精密称取于 40 ℃
减压干燥 2 h 的重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ对照品适量，
加甲醇制成每 1 mL 分别含重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ
0. 236 4，0. 081 0，0. 042 4，0. 040 2 mg 的混合溶液，
即得。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 取滇重楼粉末(过三号
筛)约 2. 0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入
75%乙醇 30 mL，回流提取 2 次(1. 5，1 h)，趁热过
滤，合并提取液，水浴挥干，加水 20 mL 溶解。首先
用石油醚萃取 5 次，每次 20 mL，每次 10 min，石油醚
层弃去，然后用正丁醇萃取 3 次，每次 20 mL，每次
10 min。收集正丁醇层，水浴挥干，用甲醇-乙腈
(1∶ 1)溶解转移至 10 mL 量瓶中，并定容至刻度，即
得供试品溶液。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 参照峰的选择 由于重楼皂苷Ⅰ是滇重楼
中的主要有效成分之一，且 2010 年版《中国药典》规
定其为评价滇重楼质量的指标性成分之一，又鉴于
该色谱峰峰面积较大且较稳定、保留时间适中，故选
择重楼皂苷Ⅰ色谱峰(S)作为参照峰，计算各共有
峰的相对保留时间和相对峰面积。
2. 3. 2 精密度试验 取滇重楼粉末(过三号筛)约
2. 0 g，精密称定，按 2. 2. 2 项下方法制备，连续进样
5 次，记录指纹图谱。利用国家药典委员会颁布的
“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004 年 A 版”
软件进行相似度评价，相似度结果均不小于 0. 980，
RSD 0. 05%。表明仪器精密度良好。
2. 3. 3 重复性试验 取滇重楼粉末(过三号筛)约
2. 0 g，共 5 份，精密称定，按 2. 2. 2 项下方法制备，分
别进样，记录指纹图谱。利用国家药典委员会颁布
的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004 年 A
版”软件进行相似度评价，相似度结果均不小于
0. 960，RSD 0. 18%。表明实验重复性良好。
2. 3. 4 稳定性试验 取滇重楼粉末(过三号筛)约
2. 0 g，精密称定，按 2. 2. 2 项下供试品溶液的制备方
法制备，分别在 0，4，8，16，24 h 检测，记录指纹图
谱。利用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图
谱相似度评价系统 2004 年 A 版”软件进行相似度评
价，相似度结果均不小于 0. 960，RSD 0. 32%。表明
供试品溶液在室温下 24 h 内稳定性良好。
2. 4 滇重楼指纹图谱的建立 分别取不同采收期
的 7 批滇重楼药材，按 2. 2. 2 项方法制备，按 2. 1 项
下的色谱条件操作，进样，记录 120 min 色谱图。
2. 5 指纹图谱分析与评价
2. 5. 1 共有峰的标定和确认 将 7 批不同采收期
滇重楼药材的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相
似度评价系统 2004 年 A 版”软件，设定匹配模板，进
行谱峰多点校正，并生成对照指纹图谱，见图 1 ～ 3。
在测定的 7 批药材中，图谱显示约有 50 个色谱峰，
·17·
周浓，等:滇重楼不同生长发育期化学成分的变化规律
其中 20 个共有峰为 7 批样品共有，确定为特征指纹
峰，依次编号。为了尽可能了解滇重楼指纹图谱中
各成分的结构信息，根据同一化合物相同色谱分离
条件下保留时间相同，紫外光谱图一致的原则，共指
认出 4 个化合物的色谱峰，分别是重楼皂苷Ⅶ(峰号
11，保留时间 46. 164 min)、重楼皂苷Ⅵ(峰号 12，保
留时间 48. 494 min)、重楼皂苷Ⅱ(峰号 14，保留时
间 61. 777 min)和重楼皂苷Ⅰ(峰号 16，保留时间
65. 087 min)。为了用数字统一标定不同采收期滇
重楼的指纹图谱特征，选定供试品溶液指纹图谱中
的重楼皂苷Ⅰ(S)为参照峰，计算各共有色谱峰的
相对峰面积，结果见表 2。
图 1 重楼皂苷对照品 HPLC
1.重楼皂苷Ⅶ;2.重楼皂苷Ⅵ;3.重楼皂苷Ⅱ;4.重楼皂苷Ⅰ
图 2 滇重楼的 HPLC 指纹图谱
图 3 不同采收期滇重楼 HPLC 对照
由图 3 可知，不同采收期的滇重楼在 33 min 以
后色谱峰数目基本一致，而在 10 ～ 33 min 峰数有明
显变化，营养生长期(4 月份)滇重楼的峰数比授粉
期(5 ～ 6 月)、果熟期(7 ～ 9 月)和衰老期(9 ～ 10
月)少，这显示了滇重楼不同采收期成分的差异。在
保留时间 47 min 左右，4 月份出现一个峰面积为 1
491 的峰，而 7，8 月份未出现任何峰，5 月份(1 个)、
6 月份(2 个)、10 月份(3 个)且峰面积很低，这可能
表 2 不同采收期滇重楼 HPLC 指纹图谱分析
No. tR
共有峰相对峰面积
4 月 5 月 6 月 7 月 8 月 9 月 10 月
RSD /%
1 0. 055 0. 490 0. 051 0. 227 0. 184 0. 932 0. 089 0. 199 99. 36
2 0. 106 2. 927 1. 092 0. 743 0. 665 2. 072 0. 577 1. 020 67. 39
3 0. 208 0. 353 0. 106 0. 270 0. 068 1. 283 0. 458 0. 556 92. 86
4 0. 232 0. 256 0. 172 0. 096 0. 093 0. 690 2. 040 0. 259 136. 35
5 0. 271 0. 552 0. 044 0. 072 0. 246 1. 774 0. 143 0. 091 149. 24
6 0. 289 0. 564 0. 106 0. 119 1. 540 11. 430 1. 175 0. 783 181. 88
7 0. 301 0. 493 0. 182 0. 194 1. 006 15. 680 0. 886 6. 033 164. 64
8 0. 384 0. 652 0. 122 0. 183 0. 103 0. 856 0. 574 0. 300 74. 16
9 0. 451 0. 688 0. 079 0. 070 0. 076 0. 671 0. 193 0. 078 108. 09
10 0. 520 5. 811 0. 438 0. 505 0. 394 3. 881 0. 615 0. 617 124. 90
11 0. 709 7. 174 0. 161 0. 363 0. 173 0. 294 0. 112 0. 285 214. 66
12 0. 745 15. 893 0. 117 0. 227 0. 104 0. 113 0. 061 0. 179 249. 78
13 0. 914 0. 543 0. 023 0. 041 0. 042 0. 126 0. 069 0. 082 139. 28
14 0. 949 1. 227 0. 606 0. 977 1. 152 0. 736 0. 821 0. 878 24. 27
15 0. 978 2. 471 0. 287 0. 578 0. 348 0. 564 0. 598 0. 924 91. 55
16(S)1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 0. 00
17 1. 271 0. 903 0. 032 0. 073 0. 135 0. 202 0. 168 0. 165 124. 45
18 1. 368 9. 577 0. 396 0. 603 1. 026 2. 871 1. 045 1. 893 130. 18
19 1. 608 1. 230 0. 228 0. 376 1. 261 2. 336 0. 905 1. 405 63. 79
20 1. 622 1. 604 0. 077 0. 118 0. 184 0. 476 0. 312 0. 301 121. 04
是鉴别不同采收期的依据之一。
由表 2 可知，7 批次不同采收期滇重楼相对保
留时间的 RSD 较小(0. 00% ～ 0. 71%)，而相对峰面
积的 RSD 较大，说明滇重楼药材指纹图谱中主要峰
群的整体面貌基本一致，但各成分含量有较大差别。
2. 5. 2 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似
度评价系统 2004 年 A 版”软件进行数据处理:以相
关系数(中位数)代表其相似度，与各月份代表性滇
重楼样品生成的对照指纹图谱(共有模式)比较，
4 ～ 10月份 7 批滇重楼药材的相似度分别为 0. 533，
0. 797，0. 798，0. 788，0. 787，0. 795，0. 716。可知滇
重楼不同采收期的对照图谱之间相似度较差，但5 ～
10 月的相似度基本一致，4 月份与其他 6 个不同月
份之间的差别较大，说明不同采收期的滇重楼药材
所含化学成分的组成和比例有不同程度变化。
2. 5. 3 主成分分析 无论是采用相关系数还是矢
量夹角余弦来计算相似度，它们比较的只是色谱指
纹图谱的整体相似，并没有考虑提取物的“量”的不
同［8］。因此采用化学模式识别(主成分分析)的方
法，以滇重楼 HPLC 指纹图谱其中的 20 个共有峰峰
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第 17 卷第 5 期
2011 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 5
Mar.，2011
面积与称样量比值(简称峰质比)的总和为指标，我
们考察了滇重楼中 20 个主要化学成分含量在不同
采收期的变化，见图 4。
图 4 不同采收期滇重楼图谱总峰质比的变化
由图 4 可知，一年内各成分及含量较为稳定，但
是各样品共有峰面积有所不同。通过比较可以看
出，滇重楼在 8 月份成分含量较高，4 月份成分含量
较低。不同采收期滇重楼样品虽然成分含量有差
异，但其色谱概貌基本一致，符合滇重楼药材的指纹
特征。
3 讨论
对不同流动相体系、检测波长和供试品溶液的
制备方法［9］进行了考察，结果显示乙腈-水流动相体
系梯度洗脱所得到色谱图基线较平稳且分离效果
好;检测波长在 210 nm 处测定峰数多且响应灵敏度
高;以 75%乙醇为提取溶剂，回流提取 2 次，石油醚
萃取 5 次，正丁醇萃取 3 次即可将滇重楼中的被测
成分基本提取完全。
滇重楼的生长发育分为营养生长期(4 月)、授
粉期 (5 ～ 6 月)、果 熟 期 (7 ～ 9 月)、衰 老 期
(9 ～ 10 月)等 4 个物候期［10］。不同生长发育期其
化学成分积累处于一个动态的过程中，随时间的变
化而变化，含量差异较大。由实验可知，营养生长期
(4 月)明显比其他采收期的低，其原因可能是由于
滇重楼地上部分开始生长，根茎部分营养物质转移
到地上部分，使其根茎化学成分发生较大变化所
致［11］。
采收期是影响中药材产量和质量的重要环节之
一，确定最佳采收期需要从药材的产量和质量 2 个
方面进行综合考虑［12］。虽然授粉期(5 ～ 6 月)和果
熟期(7 ～ 9 月)整体较高，可能与光合作用后根茎大
量合成自身营养物质有关，但其药用部位根茎进入
旺盛生长期、影响产量，所以不经济［13］。兼顾产
量和含量因素，笔者认为应以 9 ～ 10 月份(衰老期)
为宜，这与实际生产中传统采收期基本一致。
药材质量的优劣与药用植物在生长发育过程中
药效物质的形成和积累密切相关。滇重楼中生物活
性成分的形成和积累，同样受植物内部自身生长发
育规律的制约，亦即与生物环境有关。
由于本次采集样品均为野生变家种的种植药
材，很难确定其准确的生长年限，可考虑规范化种植
后再用本方法对滇重楼的最佳采收期进行进一步研
究，并得出更为准确、可靠的结论。
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［责任编辑 邹晓翠］
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周浓，等:滇重楼不同生长发育期化学成分的变化规律