全 文 ：2种 CTAB法对干燥方法不同的平邑甜茶叶片 DNA的提取
赵海山 ,刘连芬 , 李超 , 李晓伟 ,钱关泽＊　(聊城大学生命科学学院 ,山东聊城 252059)
摘要　分别采用 S.Wilkie的 CTAB提取方法及在此基础上进行了改良的 CTAB法 ,以硅胶干燥、标本干燥和新鲜的平邑甜茶叶片为材
料 ,提取出平邑甜茶基因组DNA,并进行DNA质量的检测。结果表明 ,利用改良的CTAB法能够获得较高质量的 DNA,新鲜叶片中提取
的DNA量最多 ,经过硅胶干燥的叶片提取的DNA比标本干燥的叶片多。
关键词　平邑甜茶;改良CTAB法;基因组DNA;硅胶干燥法
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)05-02244-02
IsolatingDNAfromMalushupehensisRehd.var.mengshanensisLeaveswithDifferentDryMethodsby2KindsofCTABMethods
ZHAOHai-shanetal　 (LifeScienceColegeofLiaochengUniversity, Liaocheng,Shandong252059)
Abstract　TwodiferentCTABmethodswereusedtoisolatetheDNAofMalushupehensis(Pamp.)Rehdvar.mengshanensisY.N.LiexG.Z.
Qian.OneisthemethodreportedbyS.Wilkieandtheotherwasmodifiedbasedontheformerone.Thematerialsinvolvedinthisexperimentwere
driedwiththreedifferentmethods:silicageldriedleaves, freshleaveswithoutdryingandleavesfromherbariumspecimens.ThegenomicDNAwas
isolatedbyusingtwomethodsanditsqualitywasexamined.TheresultsshowedthatthemodifiedCTABmethodwasbeterthanthemethodrepor-
tedbyS.WilkieandtheamountofDNAisolatedfromfreshleaveswasbiggest, andthatfromSilicadriedleaveswerebiggerthanfromthoseof
specimens.
Keywords　MalushupehensisRehd.var.mengshanensis;ModifiedCTAB;GenegroupsDNA;Silicageldriedleaves.
基金项目　山东省自然科学基金项目(Y2006D04)。
作者简介　赵海山(1983-),男 ,山东聊城人 ,硕士研究生 , 研究方向:
植物分类学。 ＊通讯作者 ,博士 , 教授 , E-mail:qianguanze@
lcu.edu.cn。
收稿日期　 2009-11-17
　　平邑甜茶(MalushupenensisRehd.var.mengshanensisY.
N.LiexG.Z.Qian.)是蔷薇科苹果属湖北海棠(M.hupenensis
Rehd.)产于山东省蒙山的一个变种 [ 1] ,为乔木植物 ,具有较
强的抗性 ,嫁接苹果时表现为乔化 ,生长旺盛 ,是我国北方普
遍使用的苹果砧木 [ 2] 。但平邑甜茶与其他湖北海棠类型形
态上有明显不同 ,它们的亲缘关系尚不清楚 ,平邑甜茶的系
统发育也不清楚。DNA分子标记技术是解决植物遗传多样
性与系统发育最重要的研究手段。目前已经有多篇利用分
子标记如 ITS[ 3 -4] 、AFLP[ 5] 、SSR[ 6 -7] 、RAPD等进行苹果属植
物种质资源研究和 DNA研究体系建立的报道 [ 8 -9] ,但要彻
底解决苹果属植物的分类问题及其亲缘关系 ,还需要做更多
的分子生物学研究。因此 ,获得高质量的基因组 DNA具有
十分重要的意义。然而 ,苹果属野生植物多生于较高的山
地 ,取材不便 ,且含有较多的蛋白质 、糖类和多酚类等次生代
谢物质 ,影响 DNA的提取 。因此有必要对苹果属植物的取
材方式和提取方式进行比较。为此 ,笔者通过 2种 CTAB法
提取经过不同方法干燥的平邑甜茶基因组 DNA,以筛选出能
获取较高质量的 DNA的方法。
1　材料与方法
1.1　材料　平邑甜茶新鲜叶片取自聊城大学生命科学学院
资源圃 ,种苗购自蒙山;硅胶干燥叶片取自山东蒙山;腊叶标
本材料保存于聊城大学生命科学学院植物标本室。
1.2　仪器及试剂
1.2.1　S.Wilkie提出的 DNA提取方法 [ 10]的主要仪器及试
剂 。主要试剂:液氮 、CTAB提取液(1% CTAB, 100 mmol/L
Tris-HCl, pH值 8.0, 10 mmol/LEDTA, 2%β-巯基乙醇)、70%
乙醇 、乙酸钠等;氯仿 /异戊醇(24∶1)、异丙醇 、无水乙醇 、
RNA酶。
主要仪器:天平 、离心机 、冰箱 、高速低温离心机 、稳压稳
流电泳仪 、紫外分光光度计 、凝胶自动成像系统等。
1.2.2　改良 CTAB提取方法的主要仪器及试剂 。与 S.Wilk-
ie方法不同的试剂:CTAB提取液(2%CTAB, 100 mmol/L
Tris-HCl, pH值 8.0, 0.5 mol/LEDTA, 1.4 mol/LNaCl, 2%β-
巯基乙醇 , 3%PVP)、Tris平衡酚。
主要仪器与方法 “1.2.1”基本相同。
1.3　方法
1.3.1　S.Wilkie的 CTAB提取法对 DNA的提取。取适量平
邑甜茶叶片于研钵中研磨成粉末状 ,加入 65 ℃预热的 1%
CTAB提取液混匀 , 65 ℃水浴 90 min。冷至室温后加入等体
积的氯仿 /异戊醇(24∶1)混匀后于室温下 5 000 r/min离心
10 min,重复抽提 1次 ,取上清液 ,加入 1/100体积的 RNA酶
混匀 , 37 ℃保温 1 h后 ,加入 2/3体积的异丙醇 ,仔细混匀 ,
室温放置 15 min,沉淀 DNA,用玻璃棒将 DNA钩出 ,用 70%
乙醇清洗后加入乙酸钠 ,冰上放置 20 min沉淀 DNA,加入适
量 TE溶解 , -20℃贮存备用 。
1.3.2　改良 CTAB法提取 DNA。取适量平邑甜茶叶片 ,加
入液氮研磨成细粉状 ,分装到 1.5 mleppendorf管中 ,加 600
μl65 ℃预热的 CTAB提取液混匀 , 65 ℃水浴 1 h,期间不时
晃动。 5 000r/min离心 10 min,取上清液 ,加 600 μlTris平
衡酚混匀 , 10 000r/min离心 10 min,取上清液 ,加 600 μl氯
仿 /异戊醇(24∶1)混匀 , 10 000r/min离心 10 min,重复抽提 1
次。加 1/5体积的浓度 5 mol/LNaCl混匀后再加 2/3体积
的(-20 ℃预冷)异丙醇混匀 ,静置 30 min沉淀 DNA。
10 000 r/min离心 5 min,弃上清液 ,用 70%乙醇清洗 2次 ,加
适量 TE溶解后 ,加 RNA酶至终浓度为 10 μg/ml, 37 ℃保温
1h后加等体积的 Tris平衡酚混匀 , 10 000 r/min离心 10
min。取上清液 ,加 600 μl氯仿 /异戊醇(24∶1)混匀 , 10 000
r/min离心 10 min,重复抽提 1次 。加 1/10体积的浓度 3
mol/L乙酸钠混匀后加 2倍体积的无水乙醇 ,静置 30 min沉
淀 DNA。 10 000 r/min离心 5 min,弃上清液 ,用 70%乙醇清
洗 2次 ,加适量 TE溶解后 , -20 ℃贮存备用。
责任编辑　张彩丽　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(5):2244 -2245, 2273
1.4　测定项目与方法
1.4.1　提取 DNA质量的检测。取适量 DNA溶液(约 3
μl),用溴化乙锭(EB)染色 ,用浓度 1%的琼脂糖凝胶电泳
(电泳缓冲液为 1×TBE,电压 80V,电泳 1h),然后在紫外凝
胶成像系统下成像 、观察。
1.4.2　提取 DNA浓度和纯度的检测 。取适量 DNA溶液 ,
在紫外分光光度计下测定波长为 260和 280nm时的吸光值 ,
计算 OD260/280比值 ,根据 OD260/280判断 DNA的纯度 ,当 1.75≤
OD260/280 <2.0时 ,表明 DNA纯度较好。
2　结果与分析
2.1　琼脂糖凝胶电泳分析　分别将平邑甜茶的新鲜叶片 、
硅胶干燥的叶片 、标本干燥的叶片用 S.Wilkie的 CTAB法与
改良 CTAB法的提取物进行琼脂糖凝胶电泳 ,将得到的图像
进行比较 ,对于相同条件下的试验材料 ,改良 CTAB法提取
的 DNA沉淀为白色 ,干燥后透明无色 , DNA主带清晰 ,无弥
散带 ,无明显的 RNA条带 ,而且经过硅胶干燥的叶片较新鲜
叶片及标本干燥的叶片得到的 DNA主带更清晰 ,亮度更好 。
这说明改良后的 CTAB法能够较好地去除平邑甜茶叶片中
的多糖 、酚类物质 、蛋白质及 RNA等杂质 ,获得较高纯度的
DNA(见图 1、2)。
　注:1.硅胶干燥的叶片;2.新鲜叶片;3.标本干燥的叶片。下
图同。
　Note:1.Leavesdriedbysilica;2.Freshleaves;3.Leavesdriedby
thesamples.Thesameasbelow.
图 1　改良CTAB法提取的平邑甜茶基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.1　AgarosegelelectrophoresispatternofMalushupenensis
Rehd.var.mengshanensisgenomicDNA extracted by
modifiedCTABfromleaves
图 2　S.Wilkie的 CTAB法提取的平邑甜茶基因组 DNA琼脂糖
凝胶电泳
Fig.2　AgarosegelelectrophoresispatternofMalushupenensis
Rehd.var.mengshanensisgenomicDNAextractedbyS.
Wilkie sCTABfromleaves
2.2　紫外分光光度计测定的吸光值分析　分别将不同干燥
方法提取的平邑甜茶 DNA样品在紫外分光光度计下测量波
长为 260和 280nm时的吸光值 ,然后进行分析比较 ,得到的
结果如表 1、2所示 。OD260/280比值≥1.75时表示所提取的
DNA纯度较高。
表 1　改良CTAB法测定的样品吸光度值
Table1　 Determinationofsampleabsorbancevaluesbymodified
CTABmethod
样品
Sample OD260 OD280 OD260/ 280
硅胶干燥叶片 0.272 0.151 1.801
LeavesdriedbySilica
新鲜叶片 0.193 0.109 1.770
Freshleaves
标本干燥叶片 0.166 0.094 1.765
Leavesdriedbythesamples
表 2　S.Wilkie的CTAB法测定的样品吸光度值
Table2　DeterminationofsampleabsorbancevaluesbyS.Wilkie s
CTABmethod
样品
Sample OD260 OD280 OD260/ 280
硅胶干燥叶片 0.226 0.132 1.712
LeavesdriedbySilica
新鲜叶片 0.118 0.075 1.573
Freshleaves
标本干燥叶片 0.095 0.063 1.507
Leavesdriedbythesamples
2.3　2种提取方法的比较　通过分析电泳图谱和吸光度值
可以看出 ,改良的 CTAB法有更好的提取效率;而在 3种干
燥方法中 ,硅胶干燥叶片中提取的 DNA量最多 ,质量最好。
这一结果似乎不合理 ,因此笔者进行了重复试验 ,对材料尤
其是新鲜叶片进行了充分研磨。
重复试验发现 ,新鲜叶片基因组 DNA提取效果远好于
　注:1.新鲜叶片第 2次试验;2.第 1次试验结果,中间为新鲜叶片。
　Note:1.Freshleavesofthesecondexperiment;2.Theresultoffirst
experiment, thesecondoneisthefreshleaf.
图 3　2次试验结果中电泳效果的比较
Fig.3　Comparisonofelectrophoresiseffectsoftwoexperiments
第 1次试验结果 ,也远好于其他 2种方法干燥的材料(见图
3)。因此 ,新鲜植物材料如果研磨不够充分 ,细胞没有被充
分磨碎 ,就会导致 DNA提取量较少;而充分研磨后 ,新鲜材
料中获得的 DNA量远高于硅胶干燥材料。
3　讨论
试验分别采用 S.Wilkie提出的 CTAB法和改良 CTAB
法提取了平邑甜茶硅胶干燥叶片 、腊叶标本叶片及新鲜叶片
的基因组 DNA。用传统 CTAB法得到的 DNA颜色为黄
褐色 ,而且提取量较少;而改良的CTAB法得到DNA颜色呈
(下转第 2273页)
224538卷 5期　　　　　　　　　　　　　赵海山等　2种 CTAB法对干燥方法不同的平邑甜茶叶片 DNA的提取
注:系统树的构建采用 Mega4.0 NJ法 , bootstrap500, 0.05表示的
遗传距离(仅以序列相似度为度量)。树形上的数值表示boot-
strap支持率 ,其中 ourcDNA为克隆的黑唇鼠兔的 LDH-C的
cDNA序列 ,其他物种 LDH-C基因序列在GenBank中的登录号
分别为:Bostaurus(BC105361.1), Susscrofa(U95378.1), Cricet-
inaegen.sp.(AF070995.1), Musmusculus(NM 013580.4),Rat-tusnorvegicus(NM 017266.2), Macacafascicularis(AB169
182.1), Homosapiens(NM 002301.4), Pantroglodytes(XM
508318.2)。
Note:Mega4.0 NJmethodisadoptedtoconstructphylogenetictree,
bootstrap500, 0.05 indicatesthegeneticdistance(onlywithse-
quencesimilarityasameasure).Datainthetreestructureindi-
catesupportrateforbootstrap, amomgwhich, ourcDNAisse-
quenceofLDH-Cfromcloningblack-lippedpika, theaccession
numberofotherspeciesLDH-CgenesequenceinGenBankare
Bostaurus(BC105361.1), Susscrofa(U95378.1), Cricetinaegen.sp.(AF070995.1), Musmusculus(NM 013580.4), Ratus
norvegicus(NM 017266.2), Macacafascicularis(AB169
182.1), Homosapiens(NM 002301.4), Pantroglodytes(XM
508318.2)respectively.
图 4　系统发生树
Fig.4　Phylogenetictree
3　讨论
ORF的核酸序列比对显示出了高度的序列相似性 ,而且
ORF框长 999 bp,编码 332个氨基酸 ,说明已成功地克隆到
了黑唇鼠兔的 LDH-C基因的 cDNA序列 ,但黑唇鼠兔的 3
UTR却长 486bp,这比人 、牛 、大鼠等物种 LDH-C基因的
3 UTR都要长几倍。由于 GenBank数据库里至今还没有兔
形目物种的 LDH-C基因的相关序列 ,笔者属首次报道 ,故构
建了系统发生树 ,树图显示虽然在分类上黑唇鼠兔和大鼠 、
小鼠及仓鼠都属于啮齿动物(Glires),但其 LDH-C基因却和
啮齿目(Rodentia)的动物在系统发生上更远些。因为只分析
LDH-C一个基因 ,所以该结果只供参考 ,有待于进一步分析
验证。
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(上接第 2245页)
白色 ,纯度较高。改良的 CTAB法与传统方法的不同之处主
要体现在以下几点:①提取液中 CTAB的浓度比 S.Wilkie的
CTAB法高 1倍 ,这样能够充分提取叶片的 DNA,增加提取
DNA的量。而且加入了 β-巯基乙醇 ,能够有效防止多酚类
物质的氧化 [ 11] 。②在提取液中加入了 PVP。PVP是一种交
联结构高分子量物质 ,其分子中的酰胺键可吸附多酚分子上
的氢键 ,形成水不溶性复合物 ,可以有效地防止多酚类物质
氧化并除去多酚类物质 [ 12] 。③提取中使用了 Tris平衡酚 。
Tris平衡酚可以有效地解离与 DNA结合的蛋白质 ,去除蛋白
质 。④加入了高盐溶液 ,能较好地去除多糖类物质 [ 13] 。
腊叶标本制作过程中由于干燥较慢 , DNA降解较多;新
鲜叶片的 DNA虽没有降解 ,但苹果属野生植物多零星散生
于海拔较高的山地 ,取材较难;而利用变色硅胶快速干燥法
可获得较少 DNA降解的材料 ,因此是较好的取材方式。
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