全 文 ：其机制可能与下调 VEGF和 HIF-1α的表达有关。由于中药的
组成比较复杂 , 其抗肿瘤作用是多靶点 、多通道的 ,对于该方的作
用机制仍然有待进一步研究。
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收稿日期:2009-08-08;　修订日期:2009-12-20
作者简介:刘彩红(1976-),女(汉族),山东平邑人 ,现任泰山医学院药学
院讲师 ,硕士学位 ,主要从事药物分析的教学和研究工作.
流动注射化学发光测定金钱草抗氧化活性
刘彩红 ,张　莹 ,李玉琴 ,齐永秀
(泰山医学院·药学院 ,山东 泰安　271000)
摘要:目的 用流动注射化学发光法研究中药金钱草的抗氧化性能。方法 将中药金钱草提取物加入三种化学发光体系 ,
测量其发光强度 , 根据系统化学发光被抑制的程度评价金钱草对活性氧的清除能力 , 并以抗坏血酸为阳性对照。结果
金钱草提取液对 O2 -· 、· OH、H2O2三种自由基有较好的清除作用 , 且清除作用随浓度的增加而增加;对三种自由基的
清除能力:H2O2 >· OH>O2 -· 。结论 中药金钱草可作为潜在的具有抗氧化活性的天然药物。
关键词:流动注射化学发光;　金钱草提取液;　抗氧化活性
中图分类号:R284.1　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)05-1267-02
　　金钱草为报春花科(Primulaceae)珍珠菜属(Lysimachia)植物
过路黄 LysimachiachristinaeHance的新鲜或干燥全草 ,味淡性微
寒 , 有清热 、利胆 、排石 、利尿 、解毒的功能。其化学成分主要为黄
酮苷类 [ 1] , 据报道黄酮类物质对活性氧自由基具有一定的抑制
作用 [ 2];目前 ,常用的抗自由基活性检测方法主要有:电子自旋
共振法 [ 3] 、荧光光谱法 , 分光光度法 [ 4]等 , 这些方法存在操作复
杂 、仪器昂贵 、检测方法缺乏专一性或灵敏度低等缺点 ,而化学发
光法具有灵敏 、快速 、操作简单 、重现性好等优点 , 因而 ,被用于抗
自由基活性药物的研究和筛选。 目前尚未见用流动注射化学发
光法测定中药金钱草抗自由基活性的报道 ,本文采用邻苯三酚 -
鲁米诺 (Luminol)-碳酸盐缓冲液 , 亚铁氰化钾 -鲁米诺 -
H2O2 , H2O2 -鲁米诺 -碳酸盐缓冲液 3个产生自由基的体系 ,对
金钱草提取液与维生素 C溶液对比研究其清除 O2 -· , · OH,H2O2自由基的能力 , 希望为合理开发该药提供参考。
1　材料与仪器
邻苯三酚溶液用 1 mmol· L-1的 HCl溶液配制 , 使用前用二
次蒸馏水稀释至所需浓度 ,鲁米诺用 0.1 mol· L-1的 NaHCO3 -Na2CO3缓冲溶液配制成所需浓度;亚铁氰化钾 、鲁米诺以及H2O2均用 KH2PO4 -NaOH(pH=7.20)缓冲溶液配制 , 使用前配
制;所用试剂均为分析纯;实验用水均为二次蒸馏水。
IFFM-D型流动注射化学发光分析仪西安瑞迈科技有限公
司。
2　方法
2.1　样品溶液的制备 样品溶液的制备参照文献 [ 5]方法进行。
取 5 g金钱草粗粉 , 加 8倍量 75%乙醇 , 超声提取 3次 , 每次 45
min,合并提取液 , 滤过 ,用石油醚萃取 , 分离 ,浓缩 , 用蒸馏水洗入
100 ml量瓶 ,定容 , 得金钱草样品含量为 1.25 mg· ml-1。
2.2　流动注射化学发光法仪器条件 实验中仪器条件为:延迟时
间 20s,测量时间 15 s, 增益 1, 滤波器截止频率 50 Hz,采样速度
20次· s-1 ,自动调零(NO),主 、副泵速度和负高压依体系而定。
2.3　流动注射化学发光 按图 1设计的流动注射化学发光分析
流路 , 蠕动泵分别泵入邻苯三酚溶液 、鲁米诺 -碳酸盐缓冲液和
H2O(· OH体系中 ,蠕动泵分别泵入鲁米诺 、亚铁氰化钾溶液以
及 H2O2溶液;H2O2自由基体系中分别泵入 H2O2、鲁米诺 -碳酸盐缓冲液和 H
2
O), 分别在混合器中混合并发生反应 , 记录发光
信号。当蠕泵中进的是空白溶液时 , 发光信号为空白值 I0 , 当进
的是待测液或维生素 C溶液时 ,发光信号记为 IT, 根据发光信号
的降低值(I0 -IT),可以定量分析金钱草提取液与维生素 C清
除自由基的能力。自由基抑制率为:
[ (I0 -IT)/I0] ×100%
以发光抑制率为纵坐标 ,样品浓度为横坐标 ,绘出发光抑制曲
线并算出自由基抑制率为 50%时的浓度 IC
50
, 用来衡量样品对自
由基的清除能力。 IC50值越小 ,表明样品清除自由基能力越强。
2.4　O2 -·清除能力检测 邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生
超氧阴离子自由基 O2 -· , O2 -· 与化学发光增效剂 Luminol反
应 , 使之氧化 ,产生一个电子激发态的中间物 , 当其返回基态时 ,
可发出化学冷光 ,用发光检测装置即可测定发光强度。反应体系
中 O
2
-·的量可以用化学发光强度来相对表示。
实验中选择邻苯三酚:0.5 mmol· L-1;鲁米诺:7 mmol·
L-1;NaHCO3 -Na2CO3 缓冲溶液 pH:10.28, 此时体系的发光强
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度 、稳定性及重复性较好。
P-蠕动泵　V-进样阀　E-流通池　W-废液;
PMT-光电倍增管　HV-负高压　R-记录仪
图 1　流动注射化学发光示意图
2.5　· OH清除能力检测 · OH由 Fe2+催化的 Fenton体系产
生 , 鲁米诺为发光增效剂。根据反应物和鲁米诺的浓度对化学发
光强度 、稳定性以及重复性的影响 , 本实验选择亚铁氰化钾:4 mg
· ml-1;鲁米诺:0.35 mg· ml-1;H
2
O
2
含量:1.8%。
2.6　H
2
O
2
清除能力检测 碱性条件下 , 过氧化氢氧化鲁米诺使
之发光 , 其发光强度与过氧化氢含量成正比 , 发光强度的下降可
以体现样品清除过氧化氢的能力 。实验中 H
2
O
2
含量:0.48%;
鲁米诺:0.15mg· ml-1;NaHCO
3
-Na
2
CO
3
缓冲溶液 pH:9.9。
3　结果
3.1　对 O
2
-· 的清除作用 根据上述条件 , 分别对其空白溶液 、
金钱草提取液及 Vc溶液进行化学发光强度测定 , 每个体系重复
测定 9次 , 发光强度取平均值进行计算。结果见图 2。
图 2　Vc和金钱草提取液对 O2 -·的清除作用
图 3　Vc和金钱草提取液对· OH的清除作用
由图 2可知 , 金钱草提取液对 O2 -·自由基有清除作用 ,且
在实验范围内呈明显的量效关系。在低浓度范围内金钱草提取
液对 O2 -· 的清除作用低于同浓度的 Vc, 当二者浓度增大到约
为 90.06mg· L-1时 , 对 O2 -· 的清除效果相当 , 清除率约为
62%, 二者浓度继续增加 , 金钱草提取液对 O2 -· 的清除作用则
高于同浓度的 Vc;金钱草提取液及 Vc对 O
2
-· 半抑制浓度
(IC
50
)约分别为 61.01和 42.03 mg· L-1。
3.2　对· OH的清除作用 由图 3可知 , 在实验范围内金钱草提
取液及 Vc对· OH的清除率均随浓度增大而增大。将金钱草提
取液与 Vc对· OH的清除能力进行对比发现在低浓度范围内 ,
同浓度下前者低于后者 ,当二者浓度增大到约为 17.30 mg· L-1
时 , 对· OH的清除效果相当 ,清除率约为 55%,二者浓度继续增
加 , 同浓度下前者则高于后者;金钱草提取液及 Vc的半抑制浓
度(IC50)约分别为 16.05和 12.42mg· L-1。
3.3　对 H2O2的清除作用 由图 4可知 , 金钱草提取液及 Vc对H2O2的清除能力均随浓度增大而增大。相同条件下 ,金钱草提
取液对 H2O2的清除能力低于 Vc, 半抑制浓度(IC50)约分别为
2.46和 0.34 mg· L-1。
本实验结果表明 ,金钱草提取液具有较强的清除自由基的作
用。对 3种自由基的清除能力依次为 H2O2 >· OH>O-2 · , IC50
分别为 2.46, 16.05, 61.01 mg· L-1。
图 4　Vc和金钱草提取液对 H2O2的清除作用
4　讨论
主副泵的泵速大小对发光强度有很大影响 ,实验中 3个发光
体系主副泵的泵速分别为 40和 40 r· min-1 , 40和 30 r· min-1 ,
30和 20r· min-1 ,此时具有较高的发光强度和稳定性。
负高压的大小将直接影响化学发光强度的大小和灵敏度 , 在
其他条件不变的情况下 ,负高压增大 , 发光强度增大 ,同时灵敏度
也随之增大 ,使得发光不稳定。因此 ,应当根据溶液的配制情况
来选择合适的负高压 , 使得发光强度较大而且稳定 , 本实验 3个
体系负高压分别为 600, 400, 500 V。
本研究采用流动注射化学发光法利用金钱草提取液对 3种
发光体系的抑制作用来测定其抗自由基活性 , 取得了满意的结
果。本方法灵敏度高 、快速测定 、操作简单和重现性好 ,可用于评
价物质的抗氧化活性及抗自由基活性药物的研究和筛选。
O2 -· 、· OH、H2O2均属于活性氧自由基 ,具有高度的反应
活性 , 产生某些毒效应。因而维持体内一定浓度水平的抗氧化
剂 , 可以延长寿命和推迟衰老。外加一些抗氧化剂协助体内维持
氧代谢的平衡 , 对于防止疾病的发生和保持机体的健康是十分有
益的。本实验结果可知中药金钱草可作为潜在的具有抗自由基
活性的药物或保健品。因此本研究为中药金钱草的开发和应用
提供了理论基础。
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