全 文 ：细胞分裂素对蝴蝶兰体细胞胚诱导及大分子代谢研究
刘福平 , 陈移亮
(福建省亚热带植物研究所 , 福建　厦门　361006)
收稿日期:2007 - 02 - 13初稿;2007- 03- 28修改稿
作者简介:刘福平 (1963 -), 男 , 副研究员 , 研究方向:植物生理学。
基金项目:福建省自然科学基金项目 (C0410040)
摘　要:以含 6 BA 、 2 , 4 D培养基诱导蝴蝶兰外植体。 6 BA 可从嫩茎切块诱导出胚性愈伤组织 , 细胞富含
淀粉粒 , 而 2 , 4 D或 2 , 4 D加 6 BA 诱导得到的愈伤组织不能分化。 6 BA 易于从嫩叶切片诱导胚性愈伤
组织 , 进行体细胞胚发生过程的显微观察。在 6 BA 诱导嫩叶切片外植体期间 , DNA 含量前期平缓上升 , 第 25
d后急剧上升。 RNA 含量开始诱导就上升 , 第 11 ～ 18 d 达到高峰。水溶性蛋白含量上升启动稍晚 , 在第 25 d 达
到高峰。
关键词:蝴蝶兰;细胞分裂素;体细胞胚;大分子代谢
中图分类号:Q 813. 1 文献标识码:A
Effect of cytokinin on the induction and macromolecules metabolic kinetics of somatic
embryogenesis in Phalaenopsis sp.
LIU Fu-ping , CH EN Yi-liang
(F ujian Institute o f Subtropical Botany , X iamen , F ujian　361006 , China)
Abstract:Two ex-plants from test tube seedling of Pha laenopsis sp. were cultur ed on the media containing 6 - BA
and 2 , 4 D. From the stem ex-plant , embryogenic callus(EC) with larg e amounts of starch g ranules in cell could
be induced with the presence of 6 BA . On the o ther hand , the callus induced with 2 , 4 D o r with bo th 2 , 4 D
and 6 BA we re unable to differentiate. EC could also be induced efficiently fr om the leaf ex-plant cultured on the
medium containing 6 BA . Histological observ ation and metabo lic analy sis conducted during somatic embryogenesis
show ed tha t , in leaf ex-plant , the DNA content increa sed slow ly initially and sharply on the 25th day of induction.
The RNA content increased w hen induction began , and reached a peak on the 11 - 18th day . The soluble pro tein
content star ted to change later than RNA and peaked on the 25th day .
Key words:Phalaenopsis sp;cy tokinin;somatic embryogenesis;macromolecules metabolic kine tics
　　兰科植物的种子为一团未分化的胚性细胞 , 萌
发成原球茎才具胚胎结构 。兰科植物离体培养所诱
导的类原球茎 (PLB) 是体细胞胚的表现形式 , 这
在蝴蝶兰 (Phalaenopsis)[ 1] 、大花惠兰 (Cymbidi-
um)[ 2] 、文心兰 (Oncidium)[ 3] 、 白拉索蕾丽亚卡
特丽亚兰 (Brassolaelia catt leya)[ 4] 等都有提及 。
大部分植物尤其是单子叶植物必须以 2 , 4 D (或
与细胞分裂素协同) 诱导胚性愈伤组织 , 然后降低
或去除培养基 2 , 4 D胚性细胞才能继续发育[ 5] 。
周俊彦等[ 6] 归纳以细胞分裂素作为唯一外源激素诱
导体胚发生的十几种双子叶或单子叶植物 , 但他同
时也指出如进一步提高这些植物的体细胞胚发生能
力则依赖添加外源生长素 。
依照已有的研究报道 , 兰科植物类原球茎诱导
及增殖细胞分裂素起到关键作用 , 外源生长素
NAA 仅起协同促进作用 , 极少用到 2 , 4 D。在
蝴蝶兰[ 7 -11] 、大花惠兰[ 3] 、 卡特兰 (Catt leya)[ 12] 、
白拉索蕾丽亚卡特丽亚兰[ 4] 、石斛兰 (Dendrobi-
um)[ 10 , 12] 、 文心兰[ 10 , 12] 、万代兰 (Vand a)[ 10] 等著
名热带兰的类原球茎诱导和增殖中 , 单一应用细胞
分裂素 (6 BA) 就取得理想效果 , 为细胞分裂素
与植物体细胞胚诱导的关系提供了研究系统。本研
究以外源 6 BA 、 2 , 4 D或互相组合诱导蝴蝶兰
外植体 , 较系统地观察体细胞胚发生过程 。并从与
体细胞胚诱导过程生理变化密切相关的生物大分子
物质即核酸 、蛋白质的动态变化 , 初步了解细胞分
裂素与植物体细胞胚诱导的生理基础 。
福建农业学报 22(2):162 ～ 166 ,2007
F ujian Journal o f Agricultural Sciences
文章编号:1008 - 0384 (2007) 02 - 0162 - 05
1　材料与方法
1. 1　离体培养
蝴蝶兰组培瓶苗取自本所组培室。以嫩茎 (抽
叶约 3cm 长的类原球茎体膨大部分) 切块和瓶苗
嫩叶切片为外植体 , 嫩茎切块外植体每瓶放置 10
块 , 嫩叶切片外植体每瓶 20 片 , 每种处理 5瓶以
上 , 基本培养基为 1 /2M S +CW (椰子汁) 20%
(V /V) +蔗糖 2% (W /V), 另加外源激素 6
BA 或`2 , 4 D 或其组合 , 培养光照 1 500 lx , 12
h d- 1 , 温度 24 ～ 26℃。
1. 2　组织细胞学观察
常规石蜡切片。愈伤组织切片高碘酸—席夫试
剂 (PAS) 染色 , 观察淀粉粒。叶片外植体诱导期
间所得愈伤组织 、发育中的类原球茎切片铁矾—苏
木精染色 。
1. 3　大分子代谢动态分析
DNA 、 RNA 含量测定按朱自平等[ 13] 介绍方
法。水溶性蛋白含量测定按考马斯亮蓝显色法。取
样时间从培养之日算起分别为 0 d 、 4 d 、 11 d 、 18
d 、 25 d 、 32 d 。
2　结果与分析
2. 1　6 BA 与 2 , 4 D对不同外植体的诱导
2. 1. 1　嫩茎切块外植体　嫩茎切块外植体诱导结
果见表 1 , 培养基中添加不同质量浓度 6 BA 培养
2个月 , 均可诱导愈伤组织 , 愈伤组织外观典型 ,
颜色鲜艳 , 坚硬 , 表面粗糙 (图 1 - 1), 转入原配
方即含 6 BA 10. 0 mg L -1 (单位下同) 的培养
基和无激素培养基几乎都可发育出丛生类原球茎
(图 1 - 2), 只是分别在转入后约 24 d和约 51 d才
观察到 , 所以 6 BA 诱导外植体得到胚性愈伤组
织 (EC)。秦凡等[ 7] 认为蝴蝶兰体细胞胚发生主要
受 6 BA 用量的影响 , 但 6 BA 对体细胞胚的持
续发育并不是十分重要 。王怀宇[ 9] 、潭文澄等[ 10] 、
杨美纯等[ 11] 报导从茎尖或叶片诱导类原球茎 , 仅
以外源 6 BA诱导 , 早期幼嫩类原球茎十分密集 ,
转入低量或不含细胞分裂素培养基类原球茎才能发
育完整 。所以 , 由愈伤组织分化出类原球茎 , 外源
细胞分裂素并非必需 , 抑或是愈伤组织在诱导期间
就富集细胞分裂素 , 发生激素驯化作用 ( habi tua-
t ion) 所致 。
表 1　6 BA 与 2 , 4 D 对不同外植体的愈伤组织诱导率 (单位:%)
Table 1　The callus induction rates(%) from dif ferent ex-plants on the media containing BA and 2 , 4 D
外植体 6 BA(mg L
- 1) 2 , 4 D(m g L - 1) 2 , 4 D + 6 BA(mg L - 1)
诱导生成物 3. 0 5. 0 10. 0 13. 0 诱导生成物 0. 5 1. 0 2. 5 诱导生成物 ① ②
嫩茎 EC 28 56 58 - NEC 10 18 0 NEC 13 17
嫩叶 EC 23 93 96 19 0 0 0 0 0
　注:① 2 , 4 D 1. 0+ 6 BA1. 0 , ②2 , 4 D1. 0+ 6 BA3. 0。
　　嫩茎切块外植体在含 2 , 4 D或 2 , 4 D加
6 BA 培养基诱导的愈伤组织 , 颜色较暗 , 松软 。
伍成厚等[ 14] 从蝴蝶兰子房切段 、 花梗切段在 2 , 4
D 1. 0加 6 BA 0. 1培养基诱导的愈伤组织呈白
色 、疏松 , 认为是非胚性愈伤组织 (NEC)。陈进
勇等[ 15] 从中国兰种子萌发的原球茎诱导出愈伤组
织 , 其中一类为疏松愈伤组织 , 淡黄色 , 在固体培
养基上逐渐白化死亡 , 另一类为致密愈伤组织 , 深
绿色 , 分化率高于疏松愈伤组织。鉴于在单子叶植
物中 , 由 2 , 4 D 诱导的胚性愈伤组织需转入无
激素或降低生长素培养基才能使胚性细胞继续发
育[ 5] , 本实验将由 2 , 4 D或 2 , 4 D加 6 BA
诱导的愈伤组织分别转入无激素 、 2 , 4 D 0. 5 、
2 , 4 D 1. 0 +6 BA1. 0和 6 BA 5. 0等 4种培
养基 , 均不能诱导出体细胞胚而逐渐死亡。
植物体细胞胚发生中伴随淀粉粒消长 , 胚性愈
伤组织积累淀粉为体细胞胚发生提供能量[ 5] 。陈进
勇等[ 15]发现兰花愈伤组织中淀粉多在薄壁细胞中
出现 , 其含量的消长过程与器官形态发生有密切关
系 。本试验中由 6 BA 诱导的 “成熟” 愈伤组织
薄壁细胞中易观察到淀粉粒 (图 2 - 1), 说明代谢
水平较高 , 有足够能量发生体细胞胚 。而由 2 , 4
D或 2 , 4 D加 6 BA 诱导的愈伤组织没观察到
淀粉粒 , 应为非胚性愈伤组织。
2. 1. 2　以嫩苗叶片切块为外植体　蝴蝶兰叶片切
块在含 2 , 4 D培养基褐变死亡。在含 6 BA 培
养基外植体愈伤组织诱导情况见表 1。
叶片外植体培养期间表面扩张 , 第11 d , 叶片
四角就出现胚性细胞 (图 2 - 2), 其中有胚性母细
胞 , 细胞质浓 , 核明显较大 (图 2 - 3), 也有分裂
163第 2期 刘福平等:细胞分裂素对蝴蝶兰体细胞胚诱导及大分子代谢研究
形成三细胞原胚 (图 2 - 4)。图 2 - 5 、 2 - 6 示培
养第 18 d 观察到的多细胞原胚 , 有内起源发生
(图 2 - 5) 和近表皮起源发生 (图 2 - 6), 图 2 - 7
为培养第 25 d 观察到的球形胚 , 有一粗胚柄与母
体组织相连。图 2 - 8 为梨形胚 , 有一数细胞的胚
柄 , 该梨形胚属单细胞起源。图 2 - 9为香蕉形胚 ,
最后发育成熟 (图 2 - 10), 即类原球茎。
蝴蝶兰叶片接种于 6 BA 培养基 , 诱导不同
天数转入无激素 (不加外源激素和 CW) 培养基培
养结果见表 2 , 外植体于 6 BA 培养基培养 15 d 、
23 d 后转接 , 愈伤组织诱导率比培养 28 d后转接
的 (诱导率达 96%) 低很多 , 即使转入后再培养 3
个月 , 外植体愈伤组织诱导率也低很多 , 说明叶片
经 6 BA 诱导 28 d对获得最高诱导率是必需的。
叶片转入无激素培养基或始终在 6 BA 为 10. 0
mg L - 1下培养 , 点状的类原球茎 (图 1 - 3) 几
乎都可继续发育 、 抽叶 、长根 (图 1 - 4)。
图 1　细胞分裂素对蝴蝶兰类原球茎诱导结果
Fig. 1　Effect of cytokirin on PLB induction in Phalaenopsis
1 - 1:胚性愈伤组织;1 - 2:类原球茎丛;1- 3:由叶外植体萌生幼嫩类原球茎;1- 4:瓶苗
图 2　蝴蝶兰体细胞胚发生的组织细胞学观察
Fig. 2　Histological observation of the somatic embryogenesis in Phalaenopsis
2- 1:胚性愈伤组织细胞富含淀粉粒;2 - 2:胚性细胞群;2 - 3:胚性母细胞;2 - 4:三细胞原胚;2- 5:内起源的多细胞原胚;2 -
6:近表皮起源的多细胞原胚;2 - 7:球形胚 , 有一粗胚柄与母体组织相连;2 - 8:梨形胚 , 通过数细胞的胚柄与母体组织相连;2 - 9:
香蕉形胚;2- 10:成熟胚
2. 2　6 BA诱导胚性愈伤组织的大分子代谢动态
如上所述 , 叶片外植体经 6 BA 诱导 28 d 就
获得最高诱导率 , 其后 6 BA 并非必需 , 所以取
诱导的前 32 d培养物进行生物大分子含量分析 。
6 BA 诱导叶片外植体期间 DNA 含量变化见
图 3 , 以每克鲜重外植体为单位的 DNA 含量变化
曲线或以每片叶外植体为单位的 DNA 含量变化曲
线相似 。培养的第0 ～ 11 d , DNA含量增加相对平
稳 , 说明此时细胞分裂并不旺盛。培养第 11 d后
DNA 含量上升加快 , 第 18 d 肉眼可观察到外植体
164 福建农业学报 第 22卷
切口端明显膨大 , 这是细胞分裂加速的结果 , 显微
观察正是胚性细胞形成 、 分裂旺盛时期 。在培养第
25 d DNA 含量开始急剧上升 , 可观察到外植体切
口端明显膨大 , 出现愈伤组织 , 显微观察是球形胚
时期 。此外 , 在整个诱导期间 , 以每克鲜重外植体
为单位的 DNA 含量增加幅度较以每片叶外植体为
单位的 DNA 含量增加幅度稍小 , 这与外植体吸收
培养基成分及光合作用代谢积累使整个外植体重量
增加有关。
表 2　6 BA 诱导叶片外植体不同天数后转入无激素培养基的 EC 诱导情况
　Table 2　Effect of induction by 6 - BA for different lengths of time on the EC induction rate of leaf explant transferred to the
medium without hormone
于 6 BA 培养基 转入无激素培养基后
培养天数(d) 诱导率(%) 培养天数(d) 诱导率(%) 培养天数(d) 诱导率(%) 培养天数(d) 诱导率(%)
15 0 25 0 65 20 124 50
23 0 25 60 65 60 124 52
28 96 25 97 65 96 124 97
图 3　6 BA 诱导外植体期间 DNA 含量变化
Fig. 3　Changes in DNA contents during 6 BA induction
诱导期间 RNA含量与水溶性蛋白含量的关系见图
4 , RNA含量从诱导一开始就较快上升 , 在第 11 ～
18 d达到高峰 , 随后明显转折下降 (可能是 RNA
片断降解 , 为下一轮转录的物质基础), 水溶性蛋
白含量在诱导第4 d才出现较快上升 , 在第25 d达
到高峰 , 随后转折下降 , 即 RNA 代谢动态稍超前
于水溶性蛋白 , 可能是由于外植体细胞内的 RNA
转录 、蛋白质翻译存在着一个时间差。生物大分子
合成具有顺序性 , 先是 RNA 合成 , 接着伴随蛋白
质大量合成 , 然后是 DNA 合成。图 3显示 , DNA
含量在培养的第 11 d后才加快上升 , 第 25 d后急
剧上升 , 均落后于 RNA 含量与水溶性蛋白含量变
化。
3　讨　论
大部分植物尤其单子叶植物必须以 2 , 4 D
(或与细胞分裂素协同) 诱导胚性愈伤组织 , 蝴蝶
图 4　6 BA 诱导外植体期间 RNA 、 水溶性蛋白含量变化
Fig. 4　Changes in RNA and soluble protein contents during
6 BA induction
兰的类原球茎 (体细胞胚) 诱导和增殖技术比较成
熟 , 培养基中单一应用外源细胞分裂素 (6 BA)
就取得理想效果 , 本试验还发现由 2 , 4 D或 2 ,
4 D加 6 BA 诱导蝴蝶兰的嫩茎切块得到的愈伤
组织不表现胚性。植物组织培养中激素起到关键的
作用 , 植物的体细胞胚发生是内 、外源激素作用的
结果 , 所以进一步探讨蝴蝶兰外植体内源激素水平
及与外源激素的相互作用 , 可望对激素与植物体细
胞胚发生的关系得到较全面了解 。生物大分子物质
的动态变化 , 对于植物的分化发育起着重要作用 ,
关于兰花离体培养形态发生的大分子生化物质代谢
动态研究较少 , 本文对在细胞分裂素作为唯一外源
激素情况下体细胞胚诱导期间的大分子物质代谢动
态进行了初步探讨 , 其分子生物学机制还有待于进
一步的研究 。
165第 2期 刘福平等:细胞分裂素对蝴蝶兰体细胞胚诱导及大分子代谢研究
参考文献:
[ 1] ISHII Y. et al. Cal lus indu ction and somat ic embryogen esi s of
Pha laenop sis [ J] . Plant Cell Repor t , 1997 , 17 (6 /7):446
- 450.
[ 2] 谷祝平 , 严廷进. 大花蕙兰茎尖组织培养及其形态建成的研究
[ J] . 实验生物学报 , 1989 , 22 (2):149 - 155.
[ 3] CHEN J T , CHANG C , CHANG W C. Direct somat ic em-
b ry ogenesison leaf ex plants of Oncid ium Gow er Ramsey and
subsequen t plant regeneration [ J] . Plant Cell Report s , 1999 ,
19:143 - 149.
[ 4] 丁兰 , 赖家业 , 傅华龙. 白拉索蕾丽亚卡特丽亚兰叶片离体培
养及形态发生的研究 [ J] . 四川大学学报:自然科学版 ,
2002 , 39 (3):534 - 537.
[ 5] 崔凯荣 , 戴若兰. 植物体细胞胚发生的分子生物学 [ M ] . 北
京:科学出版社 , 2000.
[ 6] 周俊彦 , 郭扶兴. 细胞分裂素类物质在植物体细胞胚胎发生中
的作用 [ J] . 植物生理学通讯 , 1996 , 32 (4):247 - 253.
[ 7] 秦凡 , 周吉源. 不同植物生长调节剂对蝴蝶兰快速繁殖的影响
[ J] . 武汉植物学研究 , 2003 , 21 (5):452- 456.
[ 8] 曾宋君 , 彭晓明 , 张京丽 , 等. 蝴蝶兰的组织培养和快速繁殖
[ J] . 武汉植物研究 , 2000 , 18 (4):344 - 346.
[ 9] 王怀宇 . 蝴蝶兰的快速无性繁殖 [ J] . 园艺学报 , 1989 , 16
(1):73- 77.
[ 10] 潭文澄. 观赏植物组织培养技术 [M ] . 北京:中国林业出版
社 , 1991:237- 267.
[ 11] 杨美纯 , 周歧伟 , 许鸿源 , 等. 外部因子对蝴蝶兰叶片原球
茎状体发生的影响 [ J] . 广西植物 , 2000 , 20 (1):42 - 46.
[ 12] SAIPRASAD G V S. et al. Propagat ion of th ree orchid genera
using encapsulat ionted protocorm-like b odies [ J] . In vi tro C ell
Dev , Biol , -Plant , 2003 , 39:42- 48.
[ 13] 朱治平 , 沈瑞娟 , 唐锡华. 高等植物胚胎发育生物学研究 Ⅱ .
水稻胚胎发育过程中的生化变化 [ J] . 植物生理学报 , 1980 ,
6 (2):141- 147.
[ 14] 伍成厚 , 叶秀粦 , 梁承邺 . 蝴蝶兰愈伤组织诱导研究 [ J] .
亚热带植物科学 , 2004, 33 (4):29 - 31.
[ 15] 陈进勇 , 程金水 , 朱滢. 几种中国兰种子试管培养愈伤组织
发生的研究 [ J] . 北京林业大学学报 , 1998 , 20 (4):76 -
79.
(责任编辑:翁志辉)
166 福建农业学报 第 22卷