全 文 ：华西药学杂志WCJ· PS　2008, 23(6)：630 ～ 632 　　
SY5Y细胞凋亡的保护作用 。
采用 MTT法测定细胞的存活率显示 , 1、5、 10
mg·ml-1红参水提物与 Aβ25 -35共同作用 72 h后 ,细
胞的存活率分别为 63.89% ±1.83%、 76.62% ±
2.82%、74.81% ±2.12%,与模型组的 39.26% ±
3.16%比较 ,均有显著性差异(P<0.01);PI染色法
测定细胞的凋亡率显示 , 各浓度红参水提物与
Aβ25-35共同作用 72 h后 , 细胞凋亡率分别为
4.00%±1.00%、 2.43% ±0.66%、 8.57% ±
0.58%,与模型组的 37.30%±0.69%比较 ,均有显
著性差异(P<0.01);流式细胞法测定细胞线粒体
膜电位显示 ,各浓度红参水提物与 Aβ25-35共同作用
72 h后 , 红绿荧光强度比值分别为 1.68 ±0.33、
2.77±0.67、2.08 ±0.14 ,与模型组的 0.45 ±0.10
比较 ,均有显著性差异(P<0.01)。由此可见 ,加入
红参水提物与 Aβ25-35共同作用后 ,与模型组比较 ,
Aβ25-35诱导的 SH-SY5Y损伤细胞存活率明显升
高 ,凋亡率明显降低 ,线粒体膜电位明显升高 ,说明
红参水提物对 Aβ25 -35诱导的SH-SY5Y细胞损伤具
有一定的保护作用。
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收稿日期:2008-04
基金项目:国家自然科学基金(批准号:20662001);广西科技攻关项目(桂科攻 0480005);广西研究生教育创新计划硕士研究生科研创新项目
作者简介:雷婷(1983-),女 ,四川广安 ,正攻读天然有机化学专业的硕士学位。 E-mail:chichuanleiting@126.com
＊通讯作者(Corespondentauthor), E-mail:lincuiwu@gxu.edu.cn
响应面法优化滇桂艾纳香中绿原酸的提取工艺
雷　婷 ,林翠梧＊ ,陈海燕 ,林桂汕 ,袁　霞
(广西大学化学化工学院 ,广西 南宁 530004)
摘要:目的　优化滇桂艾纳香中绿原酸的超声提取工艺。方法　根据 Box-Benhnken中心组合设计原理 ,采用 3因素 3水平
的响应面分析法 , 考察乙醇浓度 、提取时间 、提取温度对绿原酸提取率的影响。结果与结论　最佳提取条件为提取温度 80℃,
时间 31min,乙醇浓度 53%, 固液比为 1：20, 提取结果与模型预测值基本相符。
关键词:滇桂艾纳香;绿原酸;响应面分析
中图分类号:R284　 文献标识码:A　 　文章编号:1006-0103(2008)06-0630-03
OptimizationoftheextractiontechniqueofchlorogenicacidinBlumearaparia(Bl.)DC.by
Responsesurfacemethod
LEITing, LINCui-wu＊ , CHENHai-yan, LINGui-shan, YUANXia
(SchoolofChemistryandChemicalEngineering, GuangxiUniversity, Nanning530004, China)
Abstract:OBJECTIVE　TooptimizetheextractionconditionofchlorogenicacidinBlumearaparia(Bl.)DC..METHODS　Re-
sponsesurfacemethod(RSM)wasadopted.AccordingtoBox-Benhnkenprincipleforcentralcompositedesign, threefactorsandthree
levelswereusedtoevaluatetheinfluenceofconcentrationofalcohol, extractiontemperatureandextractiontime.Theexperimentaldata
weredisposedbyRSM.RESULTandCONCLUSION　 Theoptimumextractionconditionswereconfirmedasfolows:concentration
ofalcoholwas53%, extractiontemperaturewas80℃, extractiontimewas31minandtheratioofsolidtoliquidwas1：20.Theexperi-
mentalvaluesagreedwiththepredictedvalues.
Keywords:Blumearaparia(Bl.)DC.;Chlorogenicacid;Responsesurfacemethod
DOI :10.13375/j.cnki.wcjps.2008.06.035
CLCnumber:R284　　　 Documentcode:A　 　ArticleID:1006-0103(2008)06-0630-03
　　滇桂艾纳香 Blumeariparia(Bl.)DC.又名假东
风草 ,为壮族民间草药 ,在广西百色地区有较长的使
用历史 ,主要用于治疗经期提前 、产后血崩 、产后浮
肿 、不孕症 、阴疮等 。临床应用证明 ,以滇桂艾纳香
为原料生产的 “妇血康颗粒”在治疗妇女功能性子
宫出血和产后出血有独特的疗效 。因此 ,作者首次
从滇桂艾纳香中分离得到数种有机酸类化合物 ,其
中绿原酸的含量最高 ,为滇桂艾纳香的主要药效成
分之一 。
响应面法 (Responesurfacemethod, RSM)为数
学和统计方法结合的产物 ,较传统优化法考虑了实
验的随机误差 ,将复杂未知的函数关系在小区域内
用简单的一次或二次多项式模型拟合 ,计算较简单 。
此方法可研究几种因素间的交互作用 ,且在实验区
域内无最优值的情况下可以通过岭嵴分析找出最优
条件 ,从而确定新的实验方向 ,正确指导实验或生
产 。因此 ,特用此法对滇桂艾纳香中绿原酸的提取
条件进行响应面优化 ,确定了最佳的提取工艺 。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
SSI液 相 色 谱 仪 (美 国 LabAliance);
SK3310LHC超声清洗器(上海科导超声仪器有限公
司)。滇桂艾纳香干草(广西桂西制药有限公司);
绿原酸对照品(成都福润德实业有限公司 ,含量 >
99%);乙腈为色谱纯;其余试剂为分析纯;水为重
蒸水。
1.2　方法与结果
1.2.1　色谱条件　色谱柱为 KromasilC18(150 mm×
4.6mm, 5μm);流动相为 0.2%磷酸 -乙腈(93：7);
流速为 1.0 ml·min-1;检测波长为 326 nm;柱温为室
温;进样量 10μl。
1.2.2　标准曲线的绘制　精密称取 25.0 mg绿原
酸对照品 ,用甲醇配成 50ml的溶液 ,分别移取 0.3、
0.5、0.7、0.9、1.0 ml于 5只 10 ml的量瓶中 ,用甲
醇稀释至刻度。以峰面积积分值为纵坐标 、样品浓
度(mg·ml-1)为横坐标绘制标准曲线。结果表明 ,
绿原酸 15.3 ～ 61.2 mg·ml-1与峰面积呈良好的线
性关系 。其回归方程为:Y=1.249×104X-1.280×
10
5(r=0.9992)。
1.2.3　绿原酸含量的测定　将干燥的滇桂艾纳香
全草粉碎后过 20目筛 ,混匀后称取 1.5 g于圆底烧
瓶中 ,用一定浓度的乙醇提取 3次 ,提取液浓缩并转
入 50ml量瓶中用 ,甲醇定容 ,摇匀备用。对照品 、
样品溶液的色谱图见图 1。
图 1　对照品(A)和样品(B)溶液的色谱图
Fig1　Chromatogramsofcontrolsolution(A)andsamplesolution
(B)
1.2.4　响应面实验　根据 Box-Benhnken的中心
组合实验设计原理 ,综合作者的前期实验结果 ,选取
3个影响比较大的因素 ,即乙醇浓度(X1)、提取时间
(X2)和提取温度(X3)。每个自变量的低 、中 、高实
验水平分别以 -1、0、1进行编码(表 1),实验方案
及结果见表 2。固液比定为 1：20。
1.2.5　数学模型的拟合　将表 2中绿原酸提取得
率的数据进行多元回归拟合 ,获得绿原酸得率对编
码自变量 x1、x2和 x3的二次多项回归方程为:
Y1 =0.107+2.806×10-3x1 +5.172×10-3x2 +
2.747×10-3x3 -4.15×10-3x1x1 +1.943×10-3x1x2 +
3.45 ×10-4 x1x3 -2.951×10-3 x2x2 +0.71 ×
10
-3x2x3 -1.151×10-3x3x3
表 1　实验因素水平及编码
Table1　Factor-levelsandcoding
Independentvariable Codeuncodedcoded
Levels
-1 0 1
Concentrationofethanol X1 x1 20% 40% 60%
Extractiontime/min X2 x2 10 20 30
Extractiontemperature X3 x3 60℃ 70℃ 80℃
x1 =(X1 -40%)/20%;x2 =(X2 -20)/10;x3 =(X3 -70)/10
表 2　响应面试验设计及试验结果
Table2　RSMexperimentaldesignandresult
No. X1 /% X2 /min X3 /℃ Rateofextraction/%
1 -1 -1 0 0.0936
2 -1 1 0 0.0991
3 1 -1 0 0.0963
4 1 1 0 0.1096
5 0 -1 -1 0.0932
6 0 -1 1 0.1008
7 0 1 -1 0.1043
8 0 1 1 0.1122
9 -1 0 -1 0.0979
10 1 0 -1 0.1018
11 -1 0 1 0.1004
12 1 0 1 0.1057
13 0 0 0 0.1069
14 0 0 0 0.1070
15 0 0 0 0.1063
631第 6期 雷　婷 , 等。响应面法优化滇桂艾纳香中绿原酸的提取工艺 　　　
1.2.6　数学模型的分析　对所得数据进行回归分
析(表 3),方程 F=17.38(F>f0.01(9, 3)),表明因变
量和全体自变量间的线性关系显著。若 P<0.05
方程为显著 ,则表 3中所有一次项以及 x1x1、x2x2具
有显著性 ,各具体试验因子对响应值的影响不是简
单的线性关系。模型的决定系数R2 =96.90%,校正
系数 Radj2 =91.33%,且失拟项相对于绝对误差不显
著 ,说明回归方程实验拟合情况较好。残差均由随
机误差引起 ,不存在模型拟合不足的现象 。因此 ,此
模型可用于预测滇桂艾纳香中绿原酸的提取情况 。
由模型可知 ,特征值都为负值 ,说明所得响应面为山
丘曲面 ,有极大值存在 。求解方程可得模型极坐标
为:X1 =53.0%、X2 =31.1 min、X3 =83.2℃。此时
模型预测的最大提取得率为 0.1123%。
表 3　回归分析结果
Table3　Resultsofregressionanalysis
Source DF SS(×10-5) MS(×10-5)F Pr>F
x
1 1 6.3 6.3 22.2109 0.00528＊＊
x2 1 21.4 21.4 75.4426 0.00034＊＊
x3 1 6.0 6.0 21.2811 0.00577＊＊
x1x1 1 6.4 6.4 22.4097 0.00518＊＊
x1x2 1 1.5 1.5 5.3243 0.06913
X1x3 1 0.05 0.05 0.1676 0.69922
x2x2 1 3.2 3.2 11.3321 0.01997＊
x2x3 1 0.002 0.002 0.0071 0.93608
x3x3 1 0.5 0.4 1.7250 0.24609
Model 9 44.4 4.9 17.3840 0.00291＊＊
Error 5 1.4 0.3
Total 14 45.8
＊P<0.05, ＊＊P<0.01
1.2.7　响应面分析 　根据拟合函数 ,由软件给出
每两个因素对提取率的响应面图(图 2A～ C)。从
图 2A可以看出 ,提取时间对提取得率的影响比乙
醇浓度的影响大 。当固定乙醇浓度时 ,随着浸提时
图 2　响应面图
Fig2　Responsesurfaceplot
间的增加 ,绿原酸得率有显著上升的趋势;当固定提
取时间时 ,随着乙醇浓度的提高 ,绿原酸得率呈先上
升后下降的趋势。因为绿原酸极性较大 ,既有醇溶
性 、也有水溶性 。乙醇浓度较高时 ,随着时间的增
加 ,提取得率的上升趋势较乙醇浓度较低时大。由
图 2B可看出 ,提取时间对得率的影响要比提取温
度大 ,提取时间和提取温度的交互作用不明显。图
2C显示 ,提取温度和乙醇浓度的交互作用也不
明显 。
1.2.8　模型的验证　为了验证绿原酸提取模型方
程的适用性 ,在计算机模拟得出最佳提取条件下 ,通
过 3次验证实验(因为所用超声波提取器最大可调
温度为 80℃,所以设置温度为 80℃),绿原酸的平均
得率为 0.1138%,比预测值略高。
2　讨论
将响应面分析法应用于绿原酸提取工艺的研
究 ,采用了合理的实验设计 ,依据回归分析确定各工
艺条件的影响因子 ,取得了比较好的结果。优化后
的绿原酸最佳提取条件为:乙醇浓度 53%,提取温
度 80℃,提取时间 31min,固液比 1：20,提取 3次。
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收稿日期:2008-04
632 　 华 西 药 学 杂 志　　　 第 23卷