全 文 ：福建省自然科学基金项目（C0410040）资助
刘福平 男，1963年生，副研究员。研究方向：植物生理学。
收稿日期：2006-12-14 修回日期：2007-02-07
热 带 作 物 学 报
CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPS
Vol.29No.1
Feb.2008
第 29卷 第 1期
2008年 2月
细胞分裂素对蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的影响
刘福平 陈移亮
福建省亚热带植物研究所 福建 厦门 361006
摘 要 分别以 6-Benzylaminopurine（6-BA）和 2，4-Dichlorophenoxyaceticacid（2，4-D）诱导蝴蝶兰外植体。
6-BA从嫩茎切块诱导出胚性愈伤组织，细胞富含淀粉粒，而 2，4-D得到的愈伤组织不能分化。6-BA易于从
嫩叶切片诱导胚性愈伤组织，进行体细胞胚发生过程的显微观察和代谢分析。6-BA诱导期间，DNA含量上
升伴随胚性愈伤组织生长，水溶性蛋白变化稍延缓于 RNA含量变化。培养第 11天新出现 12.13，13.08，
66.30，97.25，104.31ku蛋白质，可能与胚性细胞出现有关，第 25天新出现 40.87ku蛋白质，与体细胞胚形成
有关。
关键词 蝴蝶兰 细胞分裂素 胚性愈伤组织 大分子代谢动态
中图分类号 S682.31 Q813.1+2
兰科植物的种子为一团未分化的胚性细胞，萌发成原球茎才具胚胎结构。兰科植物离体培养所诱
导的类原球茎（PLB）是体细胞胚的表现形式，这在蝴蝶兰（Phalaenopsis）[1]、大花惠兰（Cymbidium）[2]、文
心兰（Oncidium）[3]、白拉索蕾丽亚卡特丽亚兰（Brassolaeliacatleya）[4]等都有提及。大部分植物尤其是单
子叶植物必需以2，4-D（或与细胞分裂素协同）诱导胚性愈伤组织，然后降低或去除培养基 2，4-D胚性
细胞才能继续发育[5]。周俊彦等[6]归纳以细胞分裂素作为唯一外源激素诱导体胚发生的十几种双子叶或
单子叶植物，但他同时也指出如进一步提高这些植物的体细胞胚发生能力则依赖添加外源生长素。兰
科植物类原球茎的诱导及增殖细胞分裂素起到关键作用，外源生长素（NAA）仅起协同促进作用，极少
用到 2，4-D。在蝴蝶兰[7~11]、大花惠兰[3]、卡特兰（Catleya）[12]、白拉索蕾丽亚卡特丽亚兰[4]、石斛兰（Dendro-
bium）[10，12]、文心兰 [10，12]、万代兰（Vanda）[10]等著名热带兰的类原球茎诱导和增殖中，单一应用细胞分裂素
（6-BA）就取得理想效果。笔者分别以6-BA和2，4-D诱导蝴蝶兰外植体，进行大分子代谢动态分析，
旨在为研究细胞分裂素与植物体细胞胚发生的关系等研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 离体培养
蝴蝶兰组织培养瓶苗取自本研究所组织培养室。以嫩茎（抽叶约3cm长的类原球茎体膨大）切块
和瓶苗嫩叶切片为外植体，嫩茎切块外植体每瓶放置10块，嫩叶切片外植体每瓶 20片，每种处理 5瓶
以上，基本培养基为 1/2MS+CW（椰子汁）20%（v：v）+蔗糖 0.02g/mL，另加外源激素 6-BA或 2，4-D。
培养光照 1500lx，12h/d，温度24~26℃。
1.2 组织细胞学观察
常规石蜡切片。愈伤组织切片用高碘酸—席夫试剂（PAS）染色，观察淀粉粒。叶片外植体诱导期间
所得愈伤组织、发育中的类原球茎切片用铁矾—苏木精染色。
1.3 大分子代谢动态分析
DNA，RNA含量参照文献[13]的方法测定。水溶性蛋白含量按考马斯亮蓝显色法测定。蛋白质组分
动态：叶片外植体 1.0g加 1.0mL样品提取液(0.01mol/LTris-HCl，pH6.8，0.01mol/Lβ-巯基乙醇，质
量分数 15%甘油，0.002mol/LPMSF)，冰浴研磨，低温离心(20000g，4℃，20min)，取上清液，加等体积
1期 刘福平等：细胞分裂素对蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的影响
样品缓冲液(20%甘油，体积分数 10%β-巯基乙醇，0.125mol/LTris-HCl，pH6.8，质量分数 4%SDS，
质量分数 0.025%溴酚兰)，沸水浴处理 3min。采用 Bio-RadMini-PROTEAN电泳仪进行 SDS-PAGE
电泳，质量分数12%分离胶，质量分数 4%浓缩胶，恒压 90V，运行 100min。电泳后，考马斯亮兰 R250
染色，Bio-RadGS-800光密度计扫描。图像以QuantityOne软件处理，进行条带发现、分子量确定、条带
匹配、泳道比较等操作。
2 结果与分析
2.1 6-BA与 2,4-D对不同外植体的诱导
2.1.1 6-BA对不同外植体的诱导 嫩茎切块外植体诱导结果见表 1，培养基各种浓度6-BA培养2个
月，均可诱导愈伤组织，愈伤组织外观典型，颜色鲜艳，坚硬，表面粗糙（图版-1），转入原配方即 6-BA
10.0（单位 mg/L，以下同）培养基和无激素培养基几乎都可发育出丛生类原球茎（图版-2）并抽叶，只是
分别在转入后约24d和约51d才观察到，所以6-BA诱导外植体得到胚性愈伤组织（EC）。秦凡等[7]认
为蝴蝶兰体细胞胚发生主要受6-BA浓度的影响，但6-BA对体细胞胚的持续发育并不是十分重要。王
怀宇[9]、潭文澄等[10]、杨美纯等[11]报道从
茎尖或叶片诱导类原球茎，仅以外源 6-
BA诱导，早期幼嫩类原球茎十分密集，
桑果状，转入低浓度或不含细胞分裂素
培养基类原球茎才能发育完整。由愈伤
组织分化出类原球茎，外源细胞分裂素
并非必须，抑或是愈伤组织在诱导期间
就富集细胞分裂素，发生激素驯化作用
（habituation）所致。
嫩茎切块外植体在只含2，4-D培养基诱导的愈伤组织，颜色较暗，松软。伍成厚等[14]从蝴蝶兰子房
切段、花梗切段在 2，4-D1.0加 6-BA0.1培养基诱导的愈伤组织呈白色、疏松，认为是非胚性愈伤组
织。陈进勇等[15]从中国兰种子萌发的原球茎诱导出愈伤组织，其中一类为疏松愈伤组织，淡黄色，在固
体培养基上逐渐白化死亡，另一类为致密愈伤组织，深绿色，分化率高于疏松愈伤组织。鉴于在单子叶
植物中，由2，4-D诱导的胚性愈伤组织需转入无激素或降低生长素培养基才能使胚性细胞继续发育[5]，
将由 2，4-D诱导的愈伤组织分别转入无激素、2，4-D0.5、2，4-D1.0+6-BA1.0和 6-BA5.0等 4种培
养基，均不能诱导出体细胞胚而逐渐死亡。
植物体细胞胚发生中伴随淀粉粒消长，胚性愈伤组织积累淀粉为体细胞胚发生提供能量[5]。陈进勇
等[15]发现兰花愈伤组织中淀粉多在薄壁细胞中出现，其含量的消长过程与器官形态发生有密切关系。本
实验中由 6-BA诱导的“成熟”愈伤组织薄壁细胞中易观察到淀粉粒（图版-3），说明代谢水平较高，有
足够活力发生体细胞胚。而由 2，4-D诱导的愈伤组织没观察到淀粉粒，初步断定为非胚性愈伤组织。
2.1.2 2，4-D对不同外植体的诱导 以嫩苗叶片切块为外植体，叶片切块在含 2，4-D培养基褐变死
亡。在含6-BA培养基外植体起初切口膨大的愈伤组织，几乎都可分化出类原球茎（图版-4），愈伤组织
诱导情况见表1。
蝴蝶兰叶片培养第11天，叶片四角就出现胚性细胞（图版-5），其中有胚性母细胞，细胞质浓，核明
显较大（图版-6），也有分裂形成三细胞原胚（图版-7）。图版-8，9示培养第18天观察到的多细胞原胚，
有内起源发生（图版-8）和近表皮起源发生（图版-9），图版-10为培养第 25天观察到的球形胚，有一粗
胚柄与母体组织相连。培养第39天从叶片切口处萌发“芽点”为图版-11的梨形胚，有一数细胞的胚柄，
该梨形胚属单细胞起源。第 46天观察到图版-12为香蕉形胚，最后发育成熟（图版-13），即类原球茎，从
接种到类原球茎发育成熟总共需约 65d。
外植体 嫩茎 外植体 嫩茎 嫩叶
诱导生成物 胚性愈伤组织 诱导生成物 胚性愈伤组织 类原球茎
3.0 28 0.5 10 0
5.0 56 1.0 18 0
10.0 58 2.5 0 0
13.0 -
嫩叶
类原球茎
23
93
96
19
6-BA/mg·L-1 2，4-D/mg·L-1
表 1 6-BA与 2,4-D对不同外植体的愈伤组织诱导率 /%
43
热 带 作 物 学 报 29卷
蝴蝶兰叶片接种于 6-BA培养基，诱
导不同天数转入无激素、无 CW培养基结
果见表 2，于 6-BA培养基培养 15，23d
后转接的愈伤组织诱导率比培养 28d后
转接的（诱导率达 96%）低很多，即使转
入后再培养3个月，外植体愈伤组织诱导
率也低很多，说明叶片经6-BA培养 28d
对获得最高诱导率是必需的。叶片转入无
激素、无 CW培养基或始终在高浓度 6-
BA10.0培养，点状的类原球茎几乎都可
继续发育、抽叶、长根（图版-14）。
2.2 6-BA诱导胚性愈伤组织的大分子代谢动态
外植体 DNA、RNA、水溶性蛋白代谢动态见图 1，DNA含量在培养前期上升平稳，第 25天后明显
上升（从第25天的20.237μg/gFW快速上升到第 32天的 39.316μg/gFW），而外植体 RNA含量也在培
养第 25天开始转折上升，肉眼可观察到外植体切口端明显膨大，出现愈伤组织，显微观察是原胚（球形
胚）出现时期。RNA含量与水溶性蛋白含量的关系，RNA含量从一开始就较快上升，第 18天明显转折
下降（可能是RNA片断降解），水溶性蛋白含量培养第 4天才出现较快上升，第 25天转折下降，即 RNA
代谢动态稍超前于水溶性蛋白，可能细胞分裂素对体细胞胚的诱导在转录水平发生作用。
蛋白质组分动态见图 2的 SDS-PAGE图谱，蛋白质条带在未开始诱导时(0d)为 7条，在随后的培
养过程中均稳定表达，表明这几种蛋白质是维持细胞正常生长所必须。培养第 4天蛋白质条带增加到
19条，第 11天达到 24条，新出现 12.13，13.08，66.30，97.25，104.31ku蛋白质，这时显微观察可见叶片
近切口处细胞分裂旺盛，观察到胚性母细胞和三细胞原胚，而这些蛋白质在随后的诱导期间并未消失，
它们可能同胚性细胞诱导和分化有关。第25天时主带达到最高的25条，较第18天新出现 40.87ku蛋
白，此时显微观察是球形胚期，该蛋白质可能与体细胞胚形成有关。
图 2显示条带内蛋白质含量随培养天数逐步增加，在第25天达到最多，第 32天有所减少，这与叶
片外植体的培养过程水溶性蛋白含量在第25天达到高峰的结果一致。此外，在 RNA达到最高峰的第
11~18天（图 1），蛋白质组分基本都出现了（除40.87ku蛋白外），但蛋白质的大量表达（第 18~25天）滞
后于 RNA的大量出现，这可能是由于外植体细胞内的RNA转录、蛋白质翻译存在着一个时间差，因此
虽然第11天蛋白质含量不高，但组分已较齐全。
培养天数
/d
培养天数
/d
诱导率
/%
培养天数
/d
诱导率
/%
培养天数
/d
诱导率
/%
15 25 0 65 20 124 50
23 25 60 65 60 124 52
28 25 97 65 96 124 97
6-BA培养基 转入无激素、无CW培养基后
表 2 叶片外植体于 6-BA培养基培养转入于无激素、无 CW 培养
基愈伤组织诱导情况
诱导率
/%
0
0
96
图 2 叶外植体培养期间水溶性蛋白 SDS-PAGE图谱
0
200
400
600
800
1000
0 4 8 12 16 20 24 28 32
0
1000
2000
3000
4000
5000!# $# %&’()*
培养时间 /d
图 1 外植体培养期间 DNA、RNA、水溶性蛋白含量
D
N
A
，
R
N
A
含
量
/μ
g ·
g-
1 ，
FW
水
溶
性
蛋
白
含
量
/μ
g ·
g-
1 ，
FW 94ku
67ku
43ku
30ku
20.1ku
14.4ku
Marker 0d 4d 11d 18d 25d 32dMarker
44
1期 刘福平等：细胞分裂素对蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的影响
3 讨 论
大部分植物尤其单子叶植物体细胞胚诱导的经典方法是以 2，4-D（或与细胞分裂素协同）诱导胚
性愈伤组织。蝴蝶兰的类原球茎（体细胞胚）诱导和增殖技术比较成熟，培养基中单一应用外源细胞分
裂素（6-BA）就取得理想效果，本实验分别以含 6-BA与 2，4-D的培养基诱导，由 2，4-D诱导蝴蝶兰
的嫩茎切块得到的愈伤组织不表现胚性，而外源 6-BA在2种外植体都诱导得到胚性愈伤组织和体细
胞胚，所以外源生长素、细胞分裂素在诱导蝴蝶兰胚性愈伤组织和体细胞胚发生似乎与一般单子叶植
物相反。已知植物组织培养激素起到关键的作用，植物的体细胞胚发生是内、外源激素作用的结果，所
以进一步探讨蝴蝶兰外植体内源激素水平及与外源激素的相互作用，可望对激素与植物体细胞胚发生
的关系得到较全面了解。王怀宇等[9]、刘荣维等[16]以 6-BA为唯一外源激素，促进离体培养蝴蝶兰花芽
转化为营养芽、诱导出丛生芽，所以蝴蝶兰可作为研究细胞分裂素与兰科植物形态发生关系的研究系
统。关于兰花离体培养形态发生的大分子生化物质代谢动态研究较少，笔者对在细胞分裂素作为唯一
外源激素情况下体细胞胚诱导期间的大分子物质代谢动态进行了初步探讨，其分子生物学机制还有待
于进一步的研究。
参 考 文 献
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EfectofCytokininonEmbryogenicCalus
InductioninPhalaenopsis
LiuFuping ChenYiliang
FujianInstituteofSubtropicalBotany Xiamen Fujian 361006 China
Abstract Twotypesofexplants,stemandleaf,fromtesttubeseedlingsofPhalaenopsiswereculturedonthe
mediumsupplementedwith6-Benzylaminopurine(6-BA)and2,4-dichlorophenoxyaceticacid(2,4-D)respec-
tively.Embryogeniccalus(EC),whosecelscontainedlargeamountofstarchgrains,wasinducedwith6-BAfrom
thestem,whereasthecalusinducedwith2,4-Dwasunabletodiferentiate.TheECwasalsoinducedeficiently
fromleafexplantculturedonthemediumsupplementedwith6-BA.Histologicalobservationandmetabolicanaly-
siswerecariedonduringthesomaticembryogenesis.Whentheexplantswereinducedwith6-BA,theDNAcon-
tentintheexplantswasincreasedwiththegrowthoftheEC.TheRNAcontentchangedearlierthanthesoluble
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热 带 作 物 学 报 29卷
proteincontent.TheSDS-PAGEprofileofthesolubleproteinindicatedthatproteins(12.13kDa,13.08kDa,
66.30kDa,97.25kDa,104.31kDa)cameupatthe11thdayofculture,whichprobablyindicatestheinductionof
embryocels.Andtheproteinof40.87kDashowedupatthe25thdayofculture,indicatingsomaticembryogenesis.
Keywords Phalaenopsissp cytokinin embryogeniccalus macromoleculemetabolickinesis
(责任编辑：李永龙)
图 版 说 明
1.胚性愈伤组织；2.类原球茎丛；3.胚性愈伤组织细胞富含淀粉粒；4.由叶外植体萌生幼嫩类原球茎；5.胚性细胞群；6.胚性母细胞；7.
三细胞原胚；8.内起源的多细胞原胚；9.近表皮起源的多细胞原胚；10.球形胚，有一粗胚柄与母体组织相连；11.梨形胚，通过数细胞的
胚柄与母体组织相连；12.香蕉形胚；13.成熟胚；14.瓶苗
1 2 3 4
5 6 7 8
9
10 11 12 1413
46