全 文 ：Chin J Clin Pharmacol 1325
Vol. 32 No. 14 July 2016(Serial No. 220)
鼠尾草酚对肿瘤坏死因子 － α诱导 HT － 29 细胞
趋化因子表达的影响
Effect of carnosol on chemokines expression in tumor necrosis factor － α － induced
HT －29 cells
收稿日期:2016 － 04 － 10
修回日期:2016 － 05 － 13
基金项目:西南医科大学附属医院博士人才基
金资助项目(201143)
作者简介:姚晖(1974 － )，男，讲师，博士，主要
从事胃肠肿瘤和炎性肠病的基础与
临床研究
通信作者:徐亮，教授，硕士生导师
MP:13708289307
E － mail:xl08289307@ 163. com
姚 晖，夏 冬，王明明，
陈旺盛，任 磊，徐 亮
(西南医科大学 附属医院 胃肠外科，四川 泸
州 646000)
YAO Hui，XIA Dong，
WANG Ming － ming，
CHEN Wang － sheng，ＲEN Lei，
XU Liang
(Department of Gastrointestinal Surgery，
The Affiliated Hospital of Southwest
Medical University， Luzhou 646000，
Sichuan Province，China)
摘要:目的 探讨鼠尾草酚对肿瘤坏死因子 － α(TNF － α)诱导 HT － 29 细胞趋
化因子表达的影响及其作用机制。方法 将 HT － 29 细胞分为空白对照组
(DMEM培养液)、TNF － α组(10 ng·mL －1 TNF － α)、低、中、高剂量鼠尾草酚组
(10 ng·mL －1 TNF － α + 10，20，40 μmol· L －1 鼠尾草酚)和阳性对照组
(10 ng·mL －1 TNF － α + 40 μmol·L －1吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)。用 CCK － 8
法检测 HT － 29 细胞活力，用酶联免疫吸附法检测白细胞介素 － 8(IL － 8)和单
核细胞趋化蛋白 － 1(MCP － 1)的表达，用 Western － blot 方法检测核转录
因子 － κB(NF － κB)p65 的表达。结果 空白对照组、TNF － α组、低、中、高剂量
鼠尾草酚组和阳性对照组的 OD 值分别为(1. 21 ± 0. 04)，(1. 17 ± 0. 06) ，
(1. 16 ± 0. 04) ，(1. 15 ± 0. 05) ，(1. 15 ± 0. 05) ，(1. 18 ± 0. 05) ，6 组的 HT － 29 细
胞活力比较差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)。TNF － α组的 IL － 8 和MCP － 1 表达
分别为(4942. 00 ± 220. 30)，(2299. 00 ± 273. 38)pg·mL －1，均明显高于空白对
照组的(841. 67 ± 27. 15)，(140. 67 ± 23. 54)pg·mL －1(P ＜ 0. 05)。低、中、高剂
量鼠尾草酚组和阳性对照组的 IL － 8 表达分别为(4136. 33 ± 253. 00)，
(3156. 00 ± 241. 89) ，(2585. 67 ±185. 04) ，(2652. 67 ± 219. 55)pg·mL －1，MCP － 1
表达分别为(1980. 67 ± 167. 02)，(1259. 33 ± 256. 66) ，(851. 00 ± 161. 16) ，
(1452. 00 ± 256. 66)pg·mL －1，均明显低于 TNF － α组(P ＜ 0. 05)。低、中、高剂
量鼠尾草酚组和阳性对照组的 NF － κB p65 表达较 TNF － α 组显著下降
(P ＜ 0. 05)。结论 鼠尾草酚能抑制 TNF － α诱导HT －29细胞趋化因子 IL －8和
MCP －1的表达，其作用机制可能与抑制 TNF － α诱导的 NF － κB通路激活有关。
关键词:鼠尾草酚;肿瘤坏死因子 － α;趋化因子;核转录因子 － κB
DOI:10. 13699 / j. cnki. 1001 － 6821. 2016. 14. 022
中图分类号:Ｒ97 文献标志码:A
文章编号:1001 － 6821(2016)14 － 1325 － 04
Abstract:Objective To study the effect of carnosol on chemokines ex-
pression in tumor necrosis factor － α (TNF － α)－ induced HT －29 cells
and its mechanism. Methods Cells were divided into control group
(DMEM medium)，TNF － α group(10 ng·mL －1 TNF － α)，low，
medium，high － dose carnosol groups (10 ng·mL －1 TNF － α + 10，
20，40 μmol·L －1 carnosol)and positive control group (10 ng·mL －1
TNF － α + 40 μmol·L －1 ammonium pyrrolidinedithiocarbamate). Cell
counting kit － 8 (CCK － 8)were used for analysis of HT － 29 viability.
The expression of interleukin － 8 (IL － 8)and monocyte chemoattractant
protein － 1 (MCP － 1)were examined by enzyme linked immunosorbent
assay. The expression of nuclear factor － κB (NF － κB) p65 were
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evaluated by Western － blot. Ｒesults The optical densities were (1. 21 ± 0. 04)，(1. 17 ± 0. 06) ，(1. 16 ± 0. 04) ，
(1. 15 ± 0. 05) ，(1. 15 ± 0. 05) ，(1. 18 ± 0. 05)in control，TNF － α，low － dose，medium － dose，high － dose and
positive control group，also，there were no significant differences on cell viability in six groups (P ＞ 0. 05). The ex-
pressions of IL － 8 and MCP －1 were (4942. 00 ± 220. 30) ，(2299. 00 ± 273. 38)pg·mL －1 in TNF － α group，which
were significantly higher than those in control group ［(841. 67 ± 27. 15) ，(140. 67 ± 23. 54)pg·mL －1，P ＜ 0. 05］.
Among the low － dose，medium － dose，high － dose and positive control group，the expressions of IL － 8 were
(4136. 33 ± 253. 00)，(3156. 00 ± 241. 89) ，(2585. 67 ± 185. 04) ，(2652. 67 ± 219. 55)pg·mL －1 and MCP － 1
were (1980. 67 ± 167. 02)，(1259. 33 ± 256. 66) ，(851. 00 ± 161. 16) ，(1452. 00 ± 256. 66)pg·mL －1，which were
significantly lower than those in TNF － α group. The expression of NF － κB p65 in low，medium，high － dose carnosol
groups were significantly lower than those of TNF － α group (P ＜ 0. 05). Conclusion Carnosol can inhibit the
expression of IL － 8 and MCP －1 in TNF － α － induced HT －29 cells，which may associate with inhibition of TNF － α
－ induced NF － κB pathway activation.
Key words:carnosol;tumor necrosis factor － α;chemokine;nuclear factor － κB
肠道内环境是由免疫、上皮、内皮、间质和神经细
胞构成的精细协调网络，其中肠上皮细胞(IEC)能够
产生多种趋化因子［如白细胞介素 － 8(IL － 8)和单核
细胞趋化蛋白 － 1(MCP －1)］、促炎因子［如肿瘤坏死
因子 － α(TNF － α)、IL － 1］及其它炎症信号以调节肠
黏膜炎症反应［1］。鼠尾草酚是一种源自植物迷迭香
提取物的多酚类单体，其具有抗炎、抗氧化和抗增殖
作用［2 － 3］。本研究旨在探讨鼠尾草酚对 TNF － α诱导
肠上皮细胞株 HT －29 的 IL － 8、MCP － 1 表达的影响
及分子机制。
材料与方法
1 材料
细胞株 HT － 29 细胞，购自中国科学院上海细
胞库。
药品与试剂 鼠尾草酚，规格:每瓶 1 mg，批号:
127606 － 6，美国 Caymen 公司生产;TNF － α，规格:每
瓶 1 mg，批号:0805CY25 － 2，美国 Invitrogen 公司生
产;吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)，规格:每瓶 2
g，批号:P2297，美国 Sigma 公司生产。CCK － 8 检测
试剂盒，上海同仁化学研究所生产;人 IL － 8 和
(MCP －1)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，美国 Ｒ＆D
公司生产;小鼠抗人 GAPDH 单克隆抗体，美国 Santa
cruz 生物公司生产;兔抗人核转录因子 － κB
(NF － κB)p65 单克隆抗体，美国 Cell signaling 公司生
产;羊抗小鼠二抗 IgG － HＲP、羊抗兔二抗 IgG － HＲP，
北京博奥森生物技术有限公司生产;ＲIPA 蛋白抽提
液，上海申能博彩公司生产;全蛋白提取试剂盒，南京
凯基生物科技发展有限公司生产;胞浆蛋白 －核蛋白
抽提试剂盒，浙江宁波 Viagene公司生产;ECL化学发
光检测试剂盒，北京普利莱公司生产。
仪器 Multiskan MK3 全自动酶标仪，芬兰Thermo
公司产品;VCX130 超声波细胞破碎仪，美国Sonics公
司产品。
2 实验方法
2. 1 细胞培养
HT －29 细胞用含 10% FBS 的 DMEM 培养液(含
青霉素 100 U·mL －1，链霉素 100 U·mL －1)，置于 37
℃，5%CO2饱和湿度培养箱培养，2 ～ 3 d更换培养液。
2. 2 分组与给药方法
HT －29 细胞接种于培养皿，37 ℃培养箱中培养
48 h，生长至 90%密度。换成无血清培养基，使其同
步化 12 h。将实验细胞分为空白对照组(DMEM培养
液)、TNF － α组(10 ng·mL －1 TNF － α)、低、中、高剂
量鼠尾草酚组(10 ng·mL －1 TNF － α + 10，20，40
μmol·L －1鼠尾草酚)和阳性对照组(10 ng·mL －1
TNF － α + 40 μmol·L －1 PDTC)。细胞同步化后，空
白对照组不加任何药物继续培养 24 h;TNF － α 组继
续培养 18 h后加入 TNF － α 刺激 6 h;低、中、高剂量
鼠尾草酚组和阳性对照组，先用不同剂量鼠尾草酚或
PDTC预处理 18 h，再加入 TNF － α刺激 6 h。
3 观察指标
用 CCK －8法检测细胞活力 细胞同步化，分组后
再培养24 h，每组设3个复孔。每孔加入CCK －8 10 μL，
培养 2 h，用酶标仪于 450 nm处测定光密度(OD值)。
用 ELISA检测 IL －8 和MCP －1 蛋白水平［4］
根据试剂盒说明书进行操作，用双抗体夹心酶标免疫
分析法测定标本中 IL － 8 和 MCP －1 水平。往包被单
抗的微孔中依次加入制备好的细胞培养上清液、生物
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素化的抗人 IL － 8 和 MCP － 1 抗体、HＲP 标记的亲和
素，TMB显色底物。用酶标仪于 450 nm 处测定 OD
值，每个样品设 3 个复孔。
用Western blot法检测细胞核 NF － κB p65 蛋白
表达［5］ 用试剂盒提取 HT － 29 细胞总蛋白及核蛋
白，经 10% SDS － PAGE电泳后转 PVDF 膜。将 PVDF
膜封闭后，室温下摇床孵育一抗 1 h(兔抗人 NF － κB
p65 单克隆抗体、鼠抗人 GAPDH 单克隆抗体)。漂洗
后的 PVDF 膜，室温下摇床孵育二抗 1 h(羊抗兔
IgG － HＲP、羊抗小鼠 IgG － HＲP);用增强化学发光法
(ECL)检测目的蛋白条带。以 GAPDH作为内参。
4 统计学处理
用 SPSS 18. 0 软件进行统计分析。数据用珋x ± s表
示，多样本比较用单因素方差分析，两样本间的比较
用配对 t检验。
结 果
1 6 组 HT －29 细胞活力的比较
空白对照组、TNF － α 组、低、中、高剂量鼠尾草酚
组和阳性对照组的 OD 值分别为(1. 21 ± 0. 04)，
(1. 17 ± 0. 06) ，(1. 16 ± 0. 04) ，(1. 15 ± 0. 05) ，
(1. 15 ± 0. 05) ，(1. 18 ± 0. 05) ，这表明 6 组 HT － 29
细胞活力比较差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)。结果见
表 1 和图 1。
2 鼠尾草酚和 PDTC对 TNF － α诱导 HT －29 细胞
IL －8 和MCP －1 的表达
TNF － α 组的 IL － 8 和 MCP － 1 表达分别为
(4942. 00 ± 220. 30)，(2299. 00 ± 273. 38)pg·mL －1，
均明显高于空白对照组的 (841. 67 ± 27. 15)，
(140. 67 ± 23. 54)pg · mL －1，差异有统计学意义
(P ＜ 0. 05)。低、中、高剂量鼠尾草酚组和阳性对照组的
IL －8表达分别为(4136. 33 ±253. 00)，(3156. 00 ±241. 89)，
(2585. 67 ±185. 04)，(2652. 67 ±219. 55)pg·mL－1，MCP －1
表达分别为(1980. 67 ± 167. 02)，(1259. 33 ± 256. 66)，
(851. 00 ±161. 16)，(1452. 00 ±256. 66)pg·mL －1，均明显
低于 TNF － α组，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。结
果见表 1 和图 2。
表 1 各组 HT － 29 的细胞活力、白细胞介素 － 8(IL － 8)和单核细胞趋化蛋白 － 1(MCP － 1)水平、核转录因子 － κB p65
(NF － κB p65)蛋白表达水平的比较(珋x ± s)
Table 1 Comparison of cell viability，the levels of interleukin － 8(IL － 8)and monocyte chemoattractant protein － 1 (MCP － 1)，the pro-
tein expression of nuclear factor － κB p65 (NF － κB p65) (珋x ± s)
Group OD IL － 8(pg·mL －1) MCP － 1(pg·mL －1) NF － κB p65(IOD)
Control 1. 21 ± 0. 04 841. 67 ± 27. 15 140. 67 ± 23. 54 13. 33 ± 3. 51
TNF － α 1. 17 ± 0. 06 4942. 00 ± 220. 29# 2299. 00 ± 273. 38# 106. 67 ± 6. 89#
Low － dose 1. 16 ± 0. 04 4136. 33 ± 253. 00* 1980. 67 ± 167. 02* 80. 33 ± 7. 02*
Medium － dose 1. 15 ± 0. 05 3156. 00 ± 241. 89* 1259. 33 ± 256. 66* 61. 33 ± 15. 60*
High － dose 1. 15 ± 0. 05 2585. 67 ± 185. 04* 851. 00 ± 161. 16* 27. 00 ± 3. 61*
Positive control 1. 18 ± 0. 05 2652. 67 ± 219. 55* 1452. 00 ± 256. 66* －
－:Not data;OD:Optical density;IOD:Integrated optical density;Control group:Dulbecco minimum essential medium;TNF － α group:10 ng·mL －1
tumor necrosis factor － α (TNF － α);Low，medium，high － dose carnosol group:10 ng·mL －1 TNF － α + 10，20，40 μmol·L －1 carnonsol;Positive con-
trol group:10 ng·mL －1 TNF － α + 40 μmol·L －1 ammonium pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC);Compared with control group，#P ＜ 0. 05;Compared
with TNF － α group，* P ＜ 0. 05
图 1 6 组 HT － 29 细胞活力的比较
Figure 1 Comparison of cell viability in HT － 29 cells in six
groups
图 2 鼠尾草酚和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对
TNF － α诱导下 HT － 29 IL － 8 和 MCP － 1 表达的影响
Figure 2 Effect of carnosol and PDTC on expression of IL － 8
and MCP － 1 in TNF － α induced HT － 29
Compared with control group，#P ＜0. 05;Compared with TNF －α group，* P ＜0. 05
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图 3 鼠尾草酚对 TNF － α 诱导下 HT － 29 细胞核 NF － κB
p65 蛋白表达的影响
Figure 3 Effect of carnosol on protein expression of NF － κB
p65 in TNF － α － induced HT － 29
3 鼠尾草酚对 TNF － α 诱导下 HT － 29 细胞核
NF － κB p65 蛋白表达的影响
TNF － α组的 NF － κB p65 较空白对照组明显增
加，低、中、高剂量鼠尾草酚组的 NF － κB p65 较
TNF － α组明显减少。结果见表 1 和图 3。
讨 论
肠上皮细胞是调控肠道固有和适应性免疫的中
间环节，担负着调控针对肠道抗原的黏膜免疫防御反
应的重任［6］。TNF － α在炎症性肠病的发病中起重要
作用，其可以激活 NF － κB 信号通路，使肠上皮细胞
分泌的大量趋化因子，诱导中性粒细胞及淋巴细胞向
炎症组织的趋化和激活，使肠道炎症反应激发和扩
大，引起 IBD 肠道黏膜持续慢性炎症状态及黏膜破
坏［7］。IL － 8(CXCL8)和 MCP －1(CCL2)同属趋化因
子亚家族，在免疫和炎症细胞的定向迁移中起重要作
用［8］。抗 IL － 8 /CXCL8 单克隆抗体(MDX － 018)和
CXCＲ2 拮抗药(SCH －527123，SB － 656933)已被用于
多种免疫疾病治疗，氨基端修饰的 MCP － 1 拮抗因子
能够对 IBD动物模型显示治疗作用［9］。
本实验结果表明，TNF － α 能诱导肠上皮细胞株
HT －29 大量表达 IL － 8 和 MCP － 1，鼠尾草酚预处理
后 HT － 29 的 IL － 8 和 MCP － 1 表达明显受到抑制，
且这种抑制作用和药物剂量成正比。这提示鼠尾草
酚能抑制 TNF － α 诱导的趋化因子(IL － 8 和
MCP －1)的激活。同时，本实验结果还发现，NF － κB
特异性抑制药 PDTC对 HT － 29 趋化因子分泌有明显
抑制作用，这也证实了 IL － 8 和 MCP － 1 的表达和
NF － κB激活相关。最后，本实验还发现，鼠尾草酚能
明显抑制 TNF － α 诱导下 HT － 29 细胞核 NF － κB
P65 的表达，这说明鼠尾草酚抑制趋化因子表达的作
用可能和抑制 NF － κB 亚基 p65 入核，从而阻断下游
炎症相关基因转录有关。本研究首次发现鼠尾草酚
对HT －29趋化因子 IL － 8 和 MCP － 1 分泌有抑制作
用，其机制可能和抑制肠道炎症反应关键转录因子
NF － κB相关。
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(本文编辑 戴荣源)